Cinetica de Hidrolisis Enzimatica PDF

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN
ESCUELA DE POSGRADO
UNIDAD DE POSGRADO DE LA FACULTAD DE
INGENIERIA DE PROCESOS
“CINÉTICA DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL

ALMIDÓN EN UN REACTOR DE LECHO EMPACADO
CON ALFA AMILASA INMOVILIZADA”.
TESIS PRESENTADO POR:

Bachiller ELÍAS ESCOBEDO PACHECO
PARA OPTAR EL GRADO DE MAESTRO EN
CIENCIAS Y TECNOLOGÍAS DE ALIMENTOS
ASESOR:
Ph. D. FÉLIX JOSÉ SUEROS VELARDE
AREQUIPA – PERÚ
2009
2
AGRADECIMIENTOS
Mi más sincero agradecimiento:
A Dios, de quien siempre he recibido bendiciones para mi y para mi familia, por

su inmenso amor y por que siempre ha preparado el camino para el logro de
mis metas espirituales y temporales.
A mi Esposa Lilia Mary y a mis Hijos Daniel Elías y Nefi Moroni por su apoyo,
cariño, comprensión, consejos y sobre todo por su paciencia.
A mis Padres y a toda mi familia, por su apoyo incondicional e invalorable

apoyo.
A mis amigos de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Nacional

del Altiplano de Puno por su amistad y apoyo.
3
RESUMEN
En el presente trabajo de investigación se ha realizado la hidrólisis de almidón

en un reactor de lecho fijo empacado con alfa amilasa inmovilizada con alginato
de sodio y cloruro de calcio.
Se ha trabajado en un reactor de vidrio de doble tubo; en su interior se ha

cargado 100 pellets de la enzima inmovilizada, de 5 mm de diámetro promedio.
Se ha realizado 12 experimentos que corresponden a un diseño factorial
multinivel, siendo los factores independientes: la temperatura, T; el flujo de
alimentación, F y la concentración inicial de almidón, CAo. Para el seguimiento
de la hidrólisis se ha utilizado el método yodométrico, Fuwa-1954, y
manteniendo el pH constante (pH = 7,02) con tampón fosfato.
Se ha logrado una conversión de 98,29% cuando CAo = 1 g/l, T = 50 ºC y F =

100 ml/h. En estas condiciones, la constante de Michaelis – Menten, CM =
0,088 g/l; constante de velocidad, k = 6,038 y el orden de reacción, n = 0,596.
También se ha realizado un análisis de los resultados experimentales con

ayuda del programa Statgraphics 5.1, obteniendo el modelo matemático
ajustado siguiente: % X  43, 2108  0, 020575F  1, 26783T  5, 06667C Ao ;
considerando %X (porcentaje de conversión por hidrólisis enzimática), F (flujo

de alimentación de almidón al reactor, en ml/h), T (temperatura de proceso de
hidrólisis, en ºC) y CAo (concentración inicial de almidón, en g/l).
4
SUMMARY
Presently investigation work has been carried out the hydrolysis of starch in a
reactor of fixed bed packed with alpha amylase immobilized with alginate of
sodium and calcium chloride.
One has worked in a reactor of glass of double tube; in its interior 100 pellets of
the enzyme immobilized has been loaded, of 5 mm of diameter average. It has
been carried out 12 experiments that correspond to a multilevel factorial design,
being the independent factors: the temperature, T; the feeding flow, F and the
initial concentration of starch, CAo. For the follow-up of the hydrolysis the
iodometric method, Fuwa-1954, has been used and maintaining the constant
pH (pH = 7,02) with tampon phosphate.
A conversion of 98,29% has been achieved when CAo = 1 g/l, T = 50 ºC and F =

100 ml/h. Under these conditions, the constant of Michaelis – Menten, CM =
0,088 g/l; constant of speed, k = 6,038 and the reaction order, n = 0,596.
Also has been done an analysis of the experimental results with the help of the
program Statgraphics 5.1, obtaining the following fit mathematical model: where
% X (conversion percentage for enzymatic hydrolysis), F (flow of feeding of
starch to the reactor, in ml/h), T (temperature of hydrolysis process, in ºC) and
CAo (initial concentration of starch, in g/l).
5
INDICE
Página
Nº
AGRADECIMIENTOS 2
RESUMEN 3
SUMMARY 4
INDICE GENERAL 5
INDICE DE TABLAS 9
INDICE DE FIGURAS 11
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN 14
ANTECEDENTES 15
OBJETIVOS 16
HIPÓTESIS 16
CAPÍTULO II
REVISIÓN DE LITERATURA 17
2.1. CARBOHIDRATOS 17
2.1.1. CLASIFICACIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS 17
2.1.1.1. MONOSACÁRIDOS 18
2.1.1.2. OLIGOSACÁRIDOS 19
2.1.1.3. POLISACÁRIDOS 20
2.2. ALMIDÓN 22
2.2.1. AMILOSA 25
2.2.2. AMILOPECTINA 27
2.2.3. COMPLEJOS DE ALMIDÓN 28
2.3. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN 29
2.3.1. ENZIMAS 30
2.3.1.1. PRINCIPALES TIPOS DE ENZIMAS 32
2.3.2. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN 33
2.3.2.1. ENZIMAS ESPECÍFICAS DEL ENLACE α(1-4) 37
2.3.2.2. ENZIMAS ESPECÍFICAS DEL ENLACE α(1-6) 39
2.3.2.3. ENZIMAS ESPECÍFICAS DE LOS ENLACES α(1-4) Y α(1-6) 39
2.3.2.4. AMILASAS 41
6
2.3.2.4.1. INHIBIDORES DE α-AMILASA 42

2.3.2.5. ENZIMAS INMOVILIZADAS EN EL PROCESO DE
ALIMENTOS 42
2.3.2.5.1. MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS 43
2.3.2.5.2. CRITERIOS USADOS PARA OPTAR POR UN MÉTODO DE
INMOVILIZACIÓN 44
2.3.2.5.3. ALGINATOS PARA INMOVILIZAR ENZIMAS 44
2.3.2.6. MÉTODOS DE MEDIDA DE LA ACTIVIDAD AMILOLÍTICA 47
2.3.2.6.1. MÉTODOS SACAROGÉNICOS 47
2.3.2.6.2. MÉTODOS CROMOGÉNICOS 49
2.3.2.6.3. MÉTODOS AMILOCLÁSTICOS 49
2.4. CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS 50
2.4.1. REACCIONES DE ENZIMAS INMOVILIZADAS 53
2.4.2. FACTORES QUE INFLUYEN EN LAS REACCIONES
ENZIMÁTICAS 53
2.4.2.1. EFECTO DEL pH 54
2.4.2.2. EFECTO DE LA TEMPERATURA 55
2.4.2.3. ENERGÍA DE ACTIVACIÓN DE LA REACCIÓN CATALIZADA
ENZIMÁTICAMENTE. 56
2.4.2.4. DEPENDENCIA DE LA TEMPERATURA SEGÚN LA LEY DE
ARRHENIUS 59
2.4.3. REGULACIÓN DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS 60
2.4.4. LA ECUACIÓN CINÉTICA 60
2.4.4.1. MECANISMO PARA LA REACCIÓN ENZIMA – SUSTRATO 61
2.4.5. REACTORES DE FLUJO PISTÓN EN ESTADO ESTACIONARIO 63
2.4.5.1. OTROS MÉTODOS PARA EVALUAR k y CM 66
2.4.6. INHIBICIÓN POR UNA SUSTANCIA EXTRAÑA, INHIBICIÓN
COMPETITIVA Y NO COMPETITIVA 67
2.4.6.1. CINÉTICA DE LA INHIBICIÓN COMPETITIVA 68
2.4.6.2. CINÉTICA DE LA INHIBICIÓN NO COMPETITIVA 68
2.4.6.3. COMO DISTINGUIR ENTRE INHIBICIÓN COMPETITIVA Y NO
COMPETITIVA A PARTIR DE DATOS EXPERIMENTALES 69
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS 70
3.1. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS 70
7
3.1.1. MATERIALES 70
3.1.2. EQUIPOS 71
3.1.3. REACTIVOS 71
3.2. MÉTODO YODOMÉTRICO PARA EL SEGUIMIENTO DE LA
REACCIÓN 72
3.2.1. PREPARACIÓN DE DISOLUCIÓN DE I2 – KI (DISOLUCIÓN
MADRE) 73
3.2.2. PREPARACIÓN DE LA DISOLUCIÓN TAMPÓN FOSFATO 0.1M 74
3.2.3. PREPARACIÓN DE DISOLUCIÓN DE ALMIDÓN, USANDO COMO
DILUYENTE LA SOLUCIÓN TAMPÓN 74
3.2.4. PREPARACIÓN DE LA ENZIMA INMOVILIZADA 75
3.2.5. SELECCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA DE MEDIDA 75
3.2.6. CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN 76
3.2.7. EXPERIMENTOS DE HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA EN UN
REACTOR DE LECHO EMPACADO CON ALFA AMILASA
INMOVILIZADA 77
3.2.7.1. CARACTERÍSTICAS DE LA ENZIMA INMOVILIZADA 77
3.2.7.2. CARACTERÍSTICAS DEL REACTOR EMPACADO CON LA
ENZIMA INMOVILIZADA 78
3.2.7.3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PARA LA HIDRÓLISIS
ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN 78
3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL 79
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 81
4.1. CARACTERÍSTICAS DE LA ENZIMA INMOVILIZADA 81
4.2. CARACTERÍSTICAS DEL REACTOR EMPACADO CON LA
ENZIMA INMOVILIZADA 81
4.3. SELECCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA DE MEDIDA 81
4.4. CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN 84
4.5. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA A 30 ºC y C Ao = 1g/l 86
4.7. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA A 30 ºC y CAo = 5g/l 89
4.9. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN INICIAL DE ALMIDÓN 92
4.10. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA 95
8
4.11. EVALUACIÓN COMPARATIVA DEL EFECTO DE LA

CONCENTRACION INICIAL DE ALMIDÓN, EL FLUJO DE
ALIMENTACIÓN Y LA TEMPERATURA SOBRE EL
PORCENTAJE DE ALMIDÓN HIDROLIZADO 97
4.12. DETERMINACIÓN DE LA CONSTANTE DE MICHAELIS –
MENTEN 99
4.13. CONSTANTE DE MICHAELIS – MENTEN (CM) A DIFERENTES
CONDICIONES DE C Ao Y TEMPERATURA 103
4.14. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD Y ORDEN DE REACCIÓN 104
4.15. ENERGÍA DE ACTIVACIÓN 110
4.16. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 114
4.16.1. EFECTOS ESTIMADOS PARA CONVERSIÓN POR HIDRÓLISIS 114
4.16.2. COEFICIENTE DE REGRESIÓN PARA LA CONVERSIÓN POR
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA 116
4.16.3. SUPERFICIES DE RESPUESTA EN EL PROCESO DE
HIDRÓLISIS. 117
4.16.4. RESPUESTA OPTIMIZADA 119
CONCLUSIONES 120
REFERENCIA BIBLIOGRÁFÍCA 122

9
INDICE DE TABLAS
Página
Nº
Tabla 1. Producción Agropecuaria en el Perú de principales materias
primas para obtener almidón. (En miles de toneladas) 14
Tabla 2. Clasificación de los carbohidratos más importantes 18
Tabla 3. Características de los polisacáridos 22
Tabla 4. Características de almidones en la industria alimentaria 25
Tabla 5. Enzimas empleadas en la hidrólisis de almidón. 33
Tabla 6. Propiedades funcionales de los productos de la hidrólisis del
almidón 34
Tabla 7. Energía de activación para algunas reacciones de interés en
alimentos 51
Tabla 8. Energía de activación de algunas reacciones 51
Tabla 9. Preparación de muestras para selección de longitud de onda 75
Tabla 10. Preparación de muestras para recta patrón 76
Tabla 11. Factores o variables del Proceso 79
Tabla 12. Diseño de Experimentos, Factorial Multinivel 80
Tabla 13. Barrido de Longitudes de Onda 82
Tabla 14. Coeficientes de absortividad para diferentes longitudes de
onda 83
Tabla 15. Lecturas de Absorbancia para curva de calibración 85
Tabla 16. Lecturas de absorbancia a la salida del reactor, para
distintos flujos de alimentación, habiendo diluido 50 veces. 86
Tabla 20. Influencia de la concentración inicial de almidón a una
temperatura constante de 30 ºC. 92
temperatura constante de 50 ºC. 94
Tabla 22. Influencia de la temperatura, manteniendo constante CAo =
1g/L. 95
10
Tabla 23. Influencia de la temperatura, manteniendo constante la

concentración inicial, C Ao = 5g/l. 96
Tabla 24. Conversión del almidón, para distintos flujos de
alimentación, distintas concentraciones iniciales y diferentes
temperaturas 97
Tabla 25. Datos para graficar curva para hallar CM,
(CAo = 1 g/l y T = 30 ºC) 99
(CAo = 1 g/l y T = 50 ºC) 100
(CAo = 5 g/l y T = 30 ºC) 101
(CAo = 5 g/l y T = 50 ºC) 102
Tabla 29. Resumen de resultados de determinación de la constante de
Michaelis – Menten para diferentes condiciones de temperatura y
concentración inicial. 103
Tabla 30. Datos para graficar curva para hallar constante de velocidad
y orden de reacción (CAo = 1 g/l y T = 30 ºC) 105
Tabla 34. Resumen de los resultados de velocidad y orden de
reacción. 109
Tabla 35. Datos para hallar Energía de Activación, cuando CAo = 1 g/l
para diferentes temperaturas. 110
Tabla 36. Datos para hallar Energía de Activación, cuando C Ao = 5 g/L
para diferentes temperaturas. 111
Tabla 37. Resumen de Resultados 113
Tabla 38. Análisis de la Varianza para Conversión 114
Tabla 39. Resultados de la Estimación para Conversión 116
Tabla 40. Respuesta optimizada 119
11
INDICE DE FIGURAS
Página
Nº
Figura 1. Representación de la α-D-glucopiranosa (dextrosa) 18
Figura 2. Representación de la β-D-fructofuranosa (levulosa) 19
Figura 3. Estructura de la sacarosa (glucosa-fructosa) 20
Figura 4. Estructura de la maltosa (glucosa-glucosa) 20
Figura 5: Enrollamiento helicoidal de la amilosa 25
Figura 6: Porción de una molécula de amilosa 26
Figura 7. Estructura de la Amilosa 26
Figura 8. Estructura de la Amilopectina 27
Figura 9. Estructura ramificada de la amilopectina. 28
Figura 10. Principales productos obtenidos por degradación del
almidón 40
Figura 11. Puntos de ataque del almidón por diferentes tipos de
amilasas. 42
Figura 12. Unidades G y M de alginatos 45
Figura 13: Bloques G y M de alginatos 45
Figura 14: Formación de gel de alginato de calcio: unidades de ácido
gulurónico en solución 46
Figura 15: Formación de redes de gel con cadenas homopoliméricas
unidas a través de iones calcio 46
Figura 16: Unión entre cadenas homopoliméricas a través de iones de
calcio situados entre los grupos con carga negativa 47
Figura 17. Diagrama de energía para una reacción química efectuada
(a) con catalizador y (b) sin catalizador. El cambio de energía (c)
representa la diferencia de energía libre entre los estados inicial y final
de la reacción. 52
Figura 18: Efecto del pH en la actividad enzimática: (a) pH óptimo; (b)
intervalo de estabilidad de la enzima; (c) intervalo de inactivación
reversible y (d) inactivación instantánea. 54
Figura 19: Efecto de la temperatura en la actividad catalítica de las
enzimas. 55
Figura 20. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de formación de
producto. Las líneas continuas son las de los valores experimentales;
las líneas discontinuas están basadas en las velocidades iniciales (por
12
ej., líneas trazadas tangencialmente a los valores experimentales a

tiempos cercanos a cero). 57
Figura 21: Efecto de la temperatura sobre la constante de velocidad de
una reacción. 58
Figura 22: Nomenclatura para un reactor de flujo pistón 63
Figura 23: Representación gráfica de las ecuaciones de diseño para el
reactor de flujo pistón 65
Figura 24. Gráficas que puede utilizarse para probar y ajustar la
ecuación de M-M a partir de datos provenientes de un reactor de flujo
pistón. 67
Figura 25. Representación simple de la acción de dos tipos de
inhibidores 68
Figura 26. Efecto de la inhibición sobre los datos provenientes de
reactores de flujo pistón o de reactores intermitentes 69
Figura 27. Esquema de la instalación del reactor para hidrólisis
enzimática 77
Figura 28. Barrido de Longitud de Onda 82
Figura 29. Coeficiente de Absortividad para diferentes longitudes de
onda 84
Figura 30. Curva de Calibración 85
Figura 31. Concentración de Almidón a la salida del reactor a 30 ºC y
CAo = 1 g/l 87
CAo = 1 g/l 88
CAo = 5 g/l 90
CAo = 5 g/l 91
Figura 35. Influencia de la concentración inicial de almidón para su
hidrólisis, a 30 ºC 92
hidrólisis, a 50 ºC 94
Figura 37. Influencia de la temperatura de hidrólisis, cuando C Ao = 1 g/l 95
Figura 38. Influencia de la temperatura de hidrólisis, cuando C Ao = 5 g/l 96
Figura 39. Influencia de la Concentración inicial de almidón, el flujo de
alimentación y la temperatura en el porcentaje de almidón hidrolizado 97
13
Figura 40. Curva para hallar CM, cuando CAo = 1 g/l y T = 30 ºC 99

Figura 44. CM a diferentes CAo y diferentes T 103
Figura 45. Velocidad y orden de reacción, cuando C Ao = 1 g/l y T = 30
ºC 105
ºC 106
ºC 107
ºC 108
Figura 49. Velocidades de reacción a 30 ºC, para diferentes
concentraciones iniciales 109
concentraciones iniciales 109
Figura 51. Curva para hallar Energía de Activación, C Ao = 1 g/l 110
Figura 52. Curva para hallar Energía de Activación, C Ao = 5 g/l 111
Figura 53. Energía de Activación a diferentes C Ao 112
Figura 54. Gráfico de Pareto estandarizado para Conversión 115
Figura 55. Gráfico de Efectos Principales para Conversión 115
Figura 56. Superficie de Respuesta Estimada, Concentración Inicial de
almidón = 3 g/l 117
Figura 57. Superficie de Respuesta Estimada, Temperatura = 40 ºC 118
Figura 58. Superficie de Respuesta Estimada, Flujo de alimentación =
300 ml/h 118
14
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
En el Perú, hay importante reserva y fuentes de materia prima que contiene

almidón; incluso hay muchos de estos son desperdiciados por diversas
razones. Existe la necesidad de aprovechar estas materias primas y además
darle valor agregado con tecnologías accesibles y eficientes.
En la Tabla 1, se muestra datos oficiales hasta el año 2008 de la producción

agropecuaria en el Perú de las principales materias primas a partir de las
cuales se puede obtener almidón.
Tabla 1. Producción Agropecuaria en el Perú de principales materias

primas para obtener almidón. (En miles de toneladas)
Principales
2004 2005 2006 2007 2008
productos
Arroz Cáscara 1 844,896 2 468,357 2 363,498 2 435,134 2 782,700
Cebada Grano 177,169 193,085 191,627 177,479 186,619
Maíz Amiláceo 216,891 241,506 249,169 245,326 250,558
Quinua 26,997 32,590 30,428 31,824 29,852
Trigo 170,411 178,460 191,094 181,552 206,286
Maíz Choclo 377,904 351,341 360,600 332,255 375,345
Camote 184,375 184,422 198,635 184,765 185,186
Olluco 120,636 135,340 144,878 156,379 158,745
Papa 3 008,159 3 289,699 3 248,416 3 383,020 3 588,086
Yuca 971,035 1 004,454 1 138,553 1 158,042 1 153,425
Fuente: Ministerio de Agricultura - Dirección General de Información Agraria -
Dirección de Estadística – 2009.
El almidón es un polisacárido que se encuentra abundantemente en la

naturaleza. Además, este polisacárido tiene muchas opciones para ser
aprovechado por el hombre; una de estas opciones es la hidrólisis enzimática.
15
Puesto que la hidrólisis enzimática es un proceso donde ocurre reacción

química en presencia de un biocatalizador, es necesario un reactor adecuado y
de preferencia debe ser continuo, puesto que en la industria se recomienda los
procesos continuos por cuestiones de economía y eficiencia.
Los reactores de lecho empacado son reactores de flujo continuo que tienen en
su interior un lecho fijo que al pasar uno de los reactantes a través de este
relleno ocurren reacciones químicas. Por ello es importante definir que tipo de
relleno debe estar en el reactor. En el caso de reacciones enzimáticas, la
enzima es la que debe estar en el lecho fijo.
Los biorreactores enzimáticos de lecho empacado tienen relleno de enzimas

inmovilizadas, estás enzimas deben ser específicas para el tipo de sustrato que
se desea catalizar y reaccionar.
A nivel de investigación experimental, se puede desarrollar métodos o

tecnologías que lleven a cabo procesos que se pueden escalar a planta piloto y
luego a escala industrial. Una de las cuestiones más importantes que se
requiere responder es en qué condiciones de operación se desarrolla mejor un
proceso de hidrólisis enzimática del almidón. Estas condiciones pueden ser
Temperatura de operación, Flujo de alimentación de sustrato en el reactor, pH,
Concentración de sustrato, tipo de enzima, inmovilización de enzima, tamaño
de lecho, etc.
ANTECEDENTES
Existen diversos trabajos de investigación con respecto a la hidrólisis
enzimática. Estos demuestran que la hidrólisis enzimática cumple con el
modelo de la cinética de Michaelis – Menten, sea este en proceso batch o
contínuo10,28,53.
Además hacen notar que la hidrólisis enzimática en un reactor de lecho fijo

empacado con enzima inmovilizada dependen del flujo de alimentación del
sustrato9,60, de la concentración del sustrato65, del pH del proceso65, del grado
de agitación y de la temperatura53 y del tipo de enzima36.
16
En el caso de la hidrólisis del almidón con alfa amilasa inmovilizada en proceso

batch, se han encontrado antecedentes en las que las condiciones óptimas
son: alginato de sodio al 2% p/v y CaCl2 al 5% p/v.35
Estos antecedentes conducen a proponer un trabajo de investigación sobre la

hidrólisis del almidón en un reactor de lecho empacado con la enzima alfa
amilasa inmovilizada con alginato de sodio, en la que se evalúe si la cinética de
hidrólisis, bajo estas condiciones, cumple con el modelo de Michaelis – Menten
y evaluar la influencia de la temperatura, flujo de alimentación y concentración
de sustrato, de tal manera que se obtenga los parámetros que favorezcan las
condiciones óptimas para un alto grado de conversión o hidrólisis del almidón.
OBJETIVOS
1. Evaluar la cinética de hidrólisis del almidón en un reactor de flujo continuo
con alfa amilasa inmovilizada como lecho fijo.
2. Evaluar la influencia de la Temperatura, Flujo de alimentación de sustrato y
concentración inicial de sustrato en la hidrólisis del almidón en un reactor de
flujo continuo con alfa amilasa inmovilizada como lecho fijo.
3. Determinar los parámetros óptimos, Temperatura, Flujo de alimentación de
sustrato y concentración inicial de sustrato, para obtener un alto grado de
conversión en la hidrólisis del almidón.
HIPÓTESIS
1. La cinética de hidrólisis del almidón, en un reactor de flujo continuo con alfa
amilasa inmovilizada como lecho fijo, se ajusta al modelo de Michaelis-
Menten.
2. La Temperatura, Flujo de alimentación de sustrato y la concentración inicial
de sustrato influyen en la hidrólisis del almidón en un reactor de flujo
continuo con alfa amilasa inmovilizada como lecho fijo.
3. Es posible encontrar valores óptimos de Temperatura, Flujo de alimentación
de sustrato y concentración inicial de sustrato que permitan alcanzar el más
alto grado de hidrólisis del almidón.
17
CAPÍTULO II
REVISIÓN DE LITERATURA
2.5. CARBOHIDRATOS
Los hidratos de carbono o carbohidratos son compuestos con estructura
de polihidroxialdehido o de polihidroxiacetona; son la fuente más
abundante y barata de alimentos de la naturaleza y por lo tanto los más
consumidos por los seres humanos.
Son los principales compuestos químicos almacenadores de la energía

radiante del sol; de hecho, la glucosa sintetizada en las plantas por el
proceso de fotosíntesis representa la materia prima fundamental para la
fabricación de la gran mayoría de ellos; el dióxido de carbono reacciona
con agua para formar glucosa, con el consecuente desprendimiento de
oxígeno:
6CO2  12 H 2O 
 C6 H12O6  6O2  6 H 2O H º  2802,96kJ / mol (1)
A su vez, mediante diversas rutas bioquímicas, éste azúcar da origen a

muchos otros como la sacarosa y la fructosa, o bien a polímeros como la
celulosa y el almidón.2
2.5.1. CLASIFICACIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS

Los carbohidratos más importantes en alimentos tienen una clasificación
general, tal como se muestra en la Tabla 2:
Su clasificación se hizo de acuerdo con diversos criterios: estructura

química, abundancia en la naturaleza, uso en alimentos, poder
edulcorante, etc. Normalmente se prefiere el criterio de la estructura
química, que se basa en el tamaño de la molécula o en el número de
átomos de carbono que contiene, según la cual, los hidratos de carbono
pueden ser monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.
18
Tabla 2. Clasificación de los carbohidratos más importantes

Carbohidratos Ejemplo
Pentosas Xilosa, arabinosa, ribosa, etc.

a) Monosacáridos Aldohexosas Glucosa, galactosa, manosa, etc.
Hexosas
Cetohexosas Fructosa, sorbosa, etc.
Disacáridos Lactosa, sacarosa, maltosa, etc.
b) Oligosacáridos Trisacáridos Rafinosa, etc.
Tetra y pentasacáridos Estaquiosa, verbascosa, etc.
Homopolisacáridos Almidón, glucógeno, celulosa, etc.
c) Polisacáridos
Heteropolisacáridos Hemicelulosa, pectinas, etc.
Fuente: BADUI DERGAL
2.5.1.1. MONOSACÁRIDOS
Estos compuestos son insolubles en etanol y en éter; solubles en
agua y sus soluciones tienen, en general, un sabor dulce aunque
existen algunos que son amargos; comparativamente, la cantidad de
monosacáridos en estado libre es muy inferior a la que se encuentra
combinada integrando los diversos polisacáridos.
La glucosa es el monosacárido más abundante; se encuentra en

diferentes frutas y hortalizas, y su concentración depende
básicamente del grado de madurez del producto.
La fructosa se encuentra principalmente en los jugos de diversas

frutas y en las mieles, y se producen en cantidades equimoleculares
con la glucosa cuando se hidroliza la sacarosa.
OH
OH
H
H O H
H O
HO H
OH H HO H H
HO OH
OH
H OH H OH
Figura 1. Representación de la α-D-glucopiranosa (dextrosa)

19
H
H
HO O
OH HO
O OH
H
H HO H OH
H H
OH HO
OH H OH
Figura 2. Representación de la β-D-fructofuranosa (levulosa)
Los monosacáridos tienen un grupo aldehído o una cetona y varios

hidroxilos y consecuentemente los cambios químicos a los que están
sujetos se relacionan con las transformaciones de estas funciones;
se ven afectados por los ácidos, los álcalis, las altas temperaturas y
los agentes oxidantes y reductores, que provocan su isomerización,
enolización, deshidratación, ciclización, oxidación, reducción, etc.
2.5.1.2. OLIGOSACÁRIDOS
Se considera tradicionalmente como el producto de la condensación
de dos a 10 monosacáridos mediante un enlace glucosídico.2
En el área de los alimentos, los más importantes son los disacáridos

y algunos tri y tetrasacáridos. Un disacárido se sintetiza por la unión
de dos monosacáridos, con la consecuente pérdida de una molécula
de agua, pero también se pueden obtener por la hidrólisis de los
polisacáridos
En general, los disacáridos se han dividido de acuerdo con su poder

reductor, y así tenemos aquellos que son capaces de reducir las
soluciones de Fehling, como la lactosa, la celobiosa, la isomaltosa y
la maltosa, y los que no la reducen, como la sacarosa.
Al igual que sucede con los polisacáridos, el organismo humano sólo

utiliza los oligosacáridos después de que han sido hidrolizados
enzimáticamente en el intestino delgado y convertidos en sus
correspondientes monosacáridos; en esta forma se absorben a
20
través de la pared intestinal para llegar a los sitios donde finalmente

son aprovechados.
La hidrólisis química de los enlaces glucosídicos de los

oligosacáridos depende de factores como el pH, la temperatura, la
configuración anomérica y el tamaño del anillo glucosídico; en
general, estas uniones son más lábiles en los ácidos que en los
álcalis y las de configuración β resisten más que las de configuración
α.
OH
HO
H O H OH
O
H
OH H H HO
O
HO
OH
H OH OH H
-D-fructofuranosil--D-glucopiranosido
Figura 3. Estructura de la sacarosa (glucosa-fructosa)
OH
OH
H O H H O OH
H H
OH H OH H
O
HO H
H OH H OH
4-O--D-glucopiranosil--D-glucopiranosa
Figura 4. Estructura de la maltosa (glucosa-glucosa)
2.5.1.3. POLISACÁRIDOS
Convencionalmente, se ha considerado polisacárido aquel polímero
constituido por más de 10 monosacáridos unidos por distintos
enlaces glucosídicos. A pesar de esta distinción, la gran mayoría de
los polisacáridos naturales contienen cientos de monómeros y, en
ocasiones, varios miles.2
No producen verdaderas soluciones, sino más bien dispersiones de

tamaño coloidal; puros no tienen color, aroma o sabor. Su peso
molecular, que puede llegar a ser hasta de millones, es en realidad
21
un promedio, puesto que las moléculas no son iguales y siempre

presentan una distribución de valores.
Se encuentran como cadenas lineales, o bien, ramificadas, que a su

vez pueden estar integradas por un solo tipo de monosacárido
(homopolisacárido), como el almidón y la celulosa, o también por
varios tipos de monosacáridos (heteropolisacárido), como es el caso
de la mayoría de las gomas. De cualquier manera, sus componentes
siempre están unidos regularmente con una secuencia y estructura
repetitivas, representando polímeros con un alto grado de
ordenación.
Su nomenclatura se basa en la adición de la terminación “ana” a las

primeras letras que identifiquen el nombre del azúcar que lo integra;
por ejemplo, aquellos constituidos por glucosa exclusivamente se
denominan glucanas, los que contienen solo galactosa, galactanas,
etc. Cuando contienen más de un monómero se hace una
combinación, como galactomanana, arabinogalactana, etc.
De acuerdo con su función biológica se han dividido en dos grandes

grupos: los que constituyen la estructura celular y le confieren rigidez
a los tejidos (celulosa, pectinas, gomas, etc.), y los que representan
la reserva energética de animales y vegetales (glucógeno, inulina y
almidón); cada grupo tiene propiedades físicas y químicas muy
distintas que se resumen en la tabla 3.
Los polisacáridos se encuentran en forma natural en muchos

alimentos, pero en algunas ocasiones se añaden a otros para
obtener la formulación correcta, como en el caso del almidón, la
carragaenina y las pectinas, que se utilizan por sus propiedades
funcionales. Por su gran capacidad de retener agua, producen
partículas coloidales muy hidratadas, razón por la cual a los
polisacáridos se les da el nombre de hidrocoloides.
22
Tabla 3. Características de los polisacáridos

Estructurales De reserva alimenticia
 Forman puentes de hidrógeno  Pocos puentes de hidrógeno
intermoleculares muy fuertes intermoleculares y débiles
 Producen fibras muy rígidas  No producen fibras
 Insoluble en agua  Solubles en agua
 Enlaces glucosídicos  Enlaces glucosídicos
generalmente β generalmente α
 Muy resistentes a enzimas,  Muy atacables por enzimas,
microorganismos y agentes microorganismos y agentes
químicos químicos
 Sus dispersiones son de alta  Sus dispersiones no son muy
viscosidad viscosas
Fuente: Badui 1997.
2.6. ALMIDÓN
El almidón es la sustancia de reserva alimenticia predominante en las
plantas, y proporciona el 70 – 80% de las calorías consumidas por los
humanos de todo el mundo.
Tanto el almidón como los productos de la hidrólisis del almidón

constituyen la mayor parte de los carbohidratos digestibles de la dieta
habitual.
El almidón se diferencia de todos los demás carbohidratos en que en la

naturaleza se presenta como complejas partículas discretas (gránulos).
Los gránulos de almidón son relativamente densos e insolubles, y se
hidratan muy mal en agua fría. Pueden ser dispersados en agua, dando
lugar a la formación de suspensiones de baja viscosidad que pueden ser
fácilmente mezcladas y bombeadas, incluso a concentraciones mayores
del 35%.20
23
La capacidad de formar soluciones viscosas (capacidad espesante) es

alcanzada solo cuando la suspensión de los gránulos es sometida a la
acción del calor. Calentando una suspensión al 5% de gránulos de
almidón no modificado hasta unos 80 ºC (175 ºF), con agitación, se
produce una alta viscosidad.
Los gránulos de almidón son insolubles en agua fría, debido a la fuerza

de cohesión de los puentes de hidrógeno, que mantienen unidas las
cadenas, pero a medida que la temperatura se eleva hasta lo que se
conoce como temperatura inicial de gelatinización, comienzan a
absorber agua. La gelatinización corresponde a los fenómenos de
hinchamiento irreversible y solubilización observados cuando los granos
de almidón se calientan a temperaturas superiores a 60 ºC en presencia
de exceso de agua.
Las temperaturas iniciales de gelatinización son características de cada

tipo concreto de almidón, pero generalmente se hallan en el intervalo 55
a 70 ºC. A medida que los granos absorben agua se produce una
pérdida progresiva de la birrefringencia y de su cristalinidad. La
solubilización del almidón conduce a la destrucción parcial de la
estructura granular dependiendo de la especie botánica y del tipo
cristalino del almidón nativo. Conforme prosigue el hinchamiento
aumenta espectacularmente la viscosidad de la suspensión-disolución;
las moléculas de amilosa son lixiviadas de los granos hinchados y
contribuyen también a la viscosidad. Si se sigue calentando mientras se
agita, la viscosidad comienza pronto a decaer a medida que los granos
pierden su integridad. Si se deja que la pasta se enfríe, la viscosidad
vuelve a elevarse, a medida que las uniones a través de puentes de
hidrógeno entre la amilopectina y la amilosa se restablecen para dar un
producto de consistencia tipo gel.14
Los geles obtenidos tienen estructuras tridimensionales y porosas.

Esquemáticamente estos geles se forman a partir de una matriz continua
de uno de los polímeros que retienen pequeñas gotas del otro polímero.
24
La composición de cada una de las dos fases depende principalmente

del grado de gelatinización (parcial/total) y de la relación
amilosa/amilopectina en el grano de almidón. Resumiendo, las
características del gel de almidón dependen, entre otros factores, del
tamaño, de la estructura morfológica de los granos, de la relación
amilosa/amilopectina, de la temperatura y del tiempo de cocción.74
Debido a los cambios morfológicos que se producen durante la

gelatinización del almidón, éste adquiere una estructura más asequible
al ataque enzimático.70
Cuando se dejan en reposo durante unas horas, las disoluciones de

almidón o las pastas de esta sustancia, comienzan a mostrar cambios
en sus propiedades reológicas; las disoluciones diluidas pierden
viscosidad pero las pastas concentradas y los geles se tornan gomosos
y exudan agua. Los dos tipos de cambios señalados se deben al
fenómeno denominado retrogradación, que afecta a las moléculas de
amilosa. Éstas en el transcurso del tiempo se asocian y cristalizan.14
La tendencia a la retrogradación se ve incrementada por las bajas

temperaturas, especialmente alrededor de los 0 ºC, el pH neutro, las
altas concentraciones de almidón. También depende del peso molecular
y del tipo de almidón.4
El fenómeno de recristalización de la amilosa en la retrogradación

dificulta la hidrólisis enzimática del almidón por las amilasas 70.
Otra propiedad importante es que la mayoría de los gránulos de almidón

están compuestos de una mezcla de polímeros: un polisacárido
esencialmente lineal denominado amilosa y otro muy ramificado llamado
amilopectina. En términos generales, los almidones contienen
aproximadamente 17 – 37% de amilosa y el resto de amilopectina, tal
como se muestra en la Tabla 4.
25
Tabla 4. Características de almidones en la industria alimentaria

Temperatura de Tamaño del
Amilopectina Amilosa
Tipo gelatinización gránulo
(%) (%)
(ºC) (micras)
Maíz 73 27 62-72 5-25
Maíz rico en amilosa 20-45 55-80 67-80 5-25
Papa 78 22 58-67 5-100
Arroz 83 17 62-78 2-5
Tapioca 82 18 51-65 5-35
Maíz céreo 99-100 0-1 63-72 5-25
Sorgo céreo 99-100 0-1 67-74 5-25
Trigo 76 24 58-64 11-41

Fuente: BADUI – 1997.
2.6.1. AMILOSA
La amilosa es un polímero lineal formado de unidades D-glucosa unidas
por enlaces α(1-4). Tiene la facilidad de adquirir una conformación
tridimensional helicoidal, en la que cada vuelta de la hélice consta de 6
moléculas de glucosa.2
Figura 5: Enrollamiento helicoidal de la amilosa
El acoplamiento de la posición axial-ecuatorial de las unidades α-D-

glucopiranosilo con enlaces (1  4) en las cadenas de amilosa da a las
moléculas una forma de hélice o espiral con giro a la derecha. (Fig. 5). El
interior de la hélice contiene solo átomos de hidrógeno, y por tanto
26
lipofílico, mientras que los grupos hidroxilo están situados en el exterior

de la hélice.
Figura 6: Porción de una molécula de amilosa
OH OH OH OH
H O H H O H H O H H O H
H H H H
OH H OH H OH H OH H
HO O O O OH
H OH H OH H OH H OH
Extremo no reductor Enlaces glicosídios  (1-4) de la amilosa Extremo reductor
Figura 7. Estructura de la Amilosa
Debido a su carácter prácticamente lineal y a la presencia casi exclusiva

de los enlaces α(1-4), es susceptible de complejar moléculas hidrófobas
(yodo, ácidos grasos, cadenas hidrocarbonadas); su capacidad de
fijación de yodo es del orden de 20 mg por 100 mg de amilosa.12
Esta propiedad se debe a la conformación en hélice de esta

macromolécula, en la cual todos los grupos hidrófilos están orientados
hacia el exterior mientras que los grupos hidrófobos lo están hacia el
interior. Esto forma una cavidad hidrófoba de un diámetro de 4,6
Amstrong que puede ser ocupada por diversos compuestos. Esta
capacidad de fijación del yodo es la base de la cuantificación analítica
27
del almidón25, de la caracterización de la amilosa 32 y de la determinación

de su proporción en el almidón en relación a la amilopectina44.
El tamaño molecular de la amilosa es muy variable; así en los cereales

presenta un grado de polimerización entre 1 000 y 2 000, mientras que
en la patata puede alcanzar los 4 500. Ello determina pesos moleculares
comprendidos entre 150 000 y 750 000 Dalton4.
2.6.2. AMILOPECTINA
La amilopectina es el polímero mayoritario del almidón, ya que supone
entre el 70 y el 80% en peso. Se trata de una macromolécula ramificada
en la que las unidades de glucosa anhidra (D-glucosa) están
principalmente unidas por enlaces α(1-4) cuando forman parte de
cadenas lineales y por enlaces α(1-6) cuando actúan como nexo de
unión entre dos cadenas para formar ramificaciones.
Alrededor del 4-5% de las unidades de glucosa están implicadas en los

enlaces α(1-6)14. La amilopectina se diferencia de la amilosa en que
tiene ramificaciones que le dan una forma molecular similar a la de un
árbol (Figura 9); las ramas están unidas al tronco central (semejante a la
amilosa) por enlaces α-D-(1-6), localizadas cada 15-25 unidades lineales
de glucosa.2
OH OH
H O H H O H
H H
OH H OH H
O O O
H OH H OH
OH OH
CH2
H O H H O H H O H
H H H
OH H OH H OH H
HO O O O
H OH H OH H OH
Ramificación (1-6) de la amilopectina
Figura 8. Estructura de la Amilopectina

28
La amilopectina se trata, en esencia, de un esqueleto de cadenas

monorramificadas de aproximadamente 40 unidades de glucosa que
llevan consigo familias (“clusters”) de cadenas, en su mayor parte no
ramificadas de unas 15 unidades de longitud. La estructura de la
amilopectina que se representa se basa en los estudios de Robin 1981
sobre almidón de patata. Generalmente se supone que las cadenas de
amilopectina se orientan radialmente en el gránulo de almidón, con sus
extremos no reductores proyectados hacia la superficie. En la figura 9, la
flecha indica regiones concéntricas, separadas aproximadamente unas 6
μm, en las que se concentra la ramificación.
Extremo
reductor
Figura 9: Estructura ramificada de la amilopectina.
La amilopectina es una molécula muy grande y altamente ramificada,

con enlaces de ramificación que constituyen alrededor del 4-5% del total
de los enlaces. Las ramas de las moléculas de amilopectina toman la
forma de un racimo (Fig. 9) y se presenta como dobles hélices. Tienen
pesos moleculares desde 107 hasta 5x108 Dalton.
2.6.3. COMPLEJOS DE ALMIDÓN

Las moléculas de amilosa son helicoidales, con la zona interior hidrófoba
(lipófila), y son capaces de formar complejos con porciones lineales
hidrófobas de moléculas que se ajusten a las dimensiones del tubo
hidrofóbico. El yodo (como I 3 ) es capaz de formar complejos tanto con
amilosa como con amilopectina. También en este caso, el complejo se

forma cuando se introduce el yodo en el interior hidrofóbico del
segmento de hélice.
29
En el caso de la amilosa, los largos segmentos helicoidales permiten la

formación de largas cadenas de poli ( I 3 ), que dan lugar al color azul
característico que puede ser utilizado como diagnóstico de la presencia

de almidón.
El ion yoduro (I-) puede combinarse con el yodo elemental (I2) para
producir el anión triyoduro (I3-). Este ion triyoduro se combinará con la
amilosa del almidón y se tornará de color azul rojizo, según se muestra
en las siguientes reacciones:
I   I 2 
 I 3 (2)
I3  amilosa 
 complejotriyoduro  amilosa (3)
color azul rojizo
El complejo amilosa-yodo contiene un 19% de yodo, y la determinación

de la cantidad de complejo sirve para medir la cantidad de amilosa
aparente presente en el almidón. La amilopectina se colorea de rojo
púrpura con el yodo, debido a que las ramas de amilopectina son
demasiado cortas para la formación de largas cadenas de poli ( I 3 ).20
El yodo reacciona con la amilosa y genera un fuerte color azul

característico debido al complejo que se establece entre una molécula
de este con cada 7-8 glucosas; como para desarrollar perfectamente la
coloración se requiere un mínimo de 40 residuos de monosacáridos, las
cadenas muy cortas de amilosa, en lugar de azul, producen una
coloración roja.2
2.7. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN

El comienzo del desarrollo de la hidrólisis del almidón tuvo lugar en el
siglo XVIII. El químico alemán Kirchhoff descubrió que hirviendo almidón
en medio ácido y neutralizándolo posteriormente aquel podía ser
convertido en azúcar.
30
Sin embargo, la acción catalítica no específica del ácido daba lugar a la

formación de productos de sabor y color indeseables. Además el sirope
obtenido tenía un contenido salino relativamente alto. Estas
características indeseables en los siropes causadas por la hidrólisis
ácida dieron lugar al desarrollo de tecnologías enzimáticas que
solventan estos problemas.
Así la historia moderna de las enzimas comienza en 1833, cuando el

francés Payen logró aislar el componente activo (α-amilasa) en la malta,
el cual llamó diastasa. Takamine, en 1894, utilizó una mezcla enzimática
procedente del Aspergillus oryzae como suplemento alimenticio para la
población asiática que tenía dificultades para digerir el arroz (en
concreto el almidón)24. Este preparado constituye posiblemente el primer
producto enzimático de origen microbiano (los anteriores fueron
obtenidos de tejidos animales o vegetales).
La identificación y el uso de esas enzimas del aspergillus oryzae

permitió la producción de siropes de las características deseadas y que
no eran factibles con la hidrólisis ácida. El verdadero impulso en
términos industriales se produjo a mediados de la década de los 60, con
el desarrollo de la amiloglucosidasa, la cual hizo posible que el almidón
fuera completamente hidrolizado a glucosa41. Finalmente en 1973 se
optimizó el proceso enzimático a nivel industrial cuando se introdujo una
amilasa obtenida del Bacillus licheniformis, que era estable a altas
temperaturas. El uso de esta enzima permitió la producción de siropes
con un contenido en glucosa de hasta el 98%, que eran el sustrato ideal
para que la glucosa isomerasa convirtiera la glucosa en fructosa 40.
2.7.1. ENZIMAS
Las enzimas son proteínas que, debido a su poder de activación
específica y de conversión de sustratos en productos, tienen actividad
catalítica:
Sustrato( s) 
enzima
 producto( s) (4)
31
Las enzimas son catalizadores positivos; esto es, incrementa la

velocidad de las reacciones por un factor de entre 103 y 1011 respecto a
las reacciones no catalizadas enzimáticamente.20
En relación con su velocidad de acción, algunas de ellas tienen la

capacidad de transformar más de un millón de moléculas de sustrato,
por segundo, por molécula de enzima; cabe indicar que, al igual que
otros catalizadores, solo acelera la velocidad de aquellas reacciones que
termodinámicamente son posibles.
Tiene que ocurrir un mínimo de dos sucesos para que se detecte

actividad enzimática:
 La enzima tiene que unir estereoespecíficamente un compuesto en el
centro activo (no covalentemente)
 Tiene que producirse la conversión química del compuesto inicial en
un nuevo compuesto.
El empleo de enzimas tiene muchas ventajas:2

a) Son de origen natural y por lo tanto no deben ser tóxicas;
b) Son muy específicas en su manera de actuar, por lo que no propician
reacciones secundarias indeseables;
c) Funcionan en condiciones moderadas de temperatura y de pH y no
requieren de condiciones de procesamiento drásticas que puedan
alterar la naturaleza del alimento, ni de equipo muy costoso;
d) Actúan a bajas concentraciones;
e) Su velocidad puede ser controlada al ajustar el pH, la temperatura y
la concentración de enzimas; y
f) Son fácilmente inactivadas una vez alcanzado el grado de
transformación deseado.
La principal limitante es que algunas de ellas son muy caras y no se

consiguen fácilmente; sin embargo, es conveniente hacer un balance de
las ventajas y las desventajas que trae consigo llevar a cabo una
32
determinada reacción con enzimas, o con otros métodos químicos o

físicos.
2.7.1.1. PRINCIPALES TIPOS DE ENZIMAS

 Oxidoreductasas. Son enzimas que oxidan o reducen sustratos por
transferencia de hidrógeno o electrones o mediante oxígeno.
 Transferasas. Son enzimas que eliminan grupos (sin incluir el H) de
los sustratos y los transfieren a moléculas aceptoras (sin incluir el
agua)
 Hidrolasas. Son enzimas que catalizan reacciones en las que el agua
participa en la ruptura de enlaces covalentes de un sustrato con la
adición concomitante de elementos del agua a los elementos de ese
enlace.
 Liasas. Son enzimas que eliminan grupos de un sustrato (no por
hidrólisis) dejando un doble enlace, o que por el contrario adicionan
grupos a dobles enlaces.
 Isomerasas. Son enzimas que llevan a cabo la isomerización de un
sustrato.
 Ligasas. Son enzimas que catalizan la unión de dos moléculas
acoplada a la ruptura de un enlace pirofosfato con el del ATP. Este
grupo de enzimas se denominó «sintetasas» anteriormente.
Las enzimas responsables de la degradación del almidón son las

Glucosil Hidrolasas (Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de
Bioquímica), y su acción irreversible sobre un sustrato se puede
esquematizar como sigue:
R  O  R ' H  OH 
E
 R  OH  R ' OH (5)
Donde R y R’ son cadenas que contienen de 1 a n moléculas de glucosa

anhidra.
33
2.7.2. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN

Durante la hidrólisis enzimática se rompen los enlaces α(1-4) y α(1-6)
presentes en el almidón para liberar cadenas más cortas: dextrinas,
maltosa y glucosa. Las enzimas actúan específicamente sobre un tipo
de enlaces o en algunos casos sobre los dos. En la tabla 5 se clasifican
las enzimas utilizadas en la hidrólisis del almidón45.
Tabla 5. Enzimas empleadas en la hidrólisis de almidón.

Tipo de Tipo de Productos Terminales
Enzima
enlace ataque Amilosa Amilopectina
α-amilasa α(1-4) Endo Glucosa Dextrinas
E.C.3.2.1.1 Maltosa
β-amilasa α(1-4) Exo Glucosa Maltosa
E.C.3.2.1.2 Maltosa Dextrinas
Pululanasa α(1-6) Endo Ninguno Dextrinas
E.C.3.2.1.41
Isoamilasa α(1-6) Endo Ninguno Dextrinas
E.C.3.2.1.60
Amiloglucosidasa α(1-4) Exo Glucosa Glucosa
E.C.3.2.1.3 α(1-6)
Fuente: Mercier 1982.
La hidrólisis de dispersiones de almidón, tanto con ácidos como con

enzimas, produce maltodextrinas. Las maltodextrinas son descritas y
clasificadas normalmente de acuerdo con su equivalencia en dextrosa
(ED). El ED está relacionado con el grado de polimerización (GP) a
través de la siguiente ecuación:
100
ED  (6)
GP
En consecuencia, el ED de un producto de hidrólisis es igual a su poder

reductor como porcentaje del poder reductor de la dextrosa pura (D-
glucosa), y por tanto, el ED está inversamente relacionado con el peso
molecular medio.20
34
Las maltodextrinas se definen como productos cuyos valores de ED son

medibles, pero inferiores a 20. Las maltodextrinas de menor ED no son
higroscópicas, mientras que las de mayor ED (es decir las de menor
peso molecular medio) tienden a absorber humedad.
Las maltodextrinas son más bien insípidas y prácticamente sin sabor

dulce, y son excelentes para contribuir al cuerpo o volumen de muchos
sistemas alimenticios.
La hidrólisis hasta valores de ED de 20 – 60 proporciona mezclas de

moléculas que, cuando son desecadas, se llaman sólidos de jarabe de
maíz. Estos sólidos de jarabe de maíz se disuelven muy rápidamente y
poseen un ligero sabor dulce.
Tabla 6. Propiedades funcionales de los productos de la hidrólisis

del almidón
Propiedades obtenidas por el Propiedades obtenidas por el
alto grado de hidrólisisa menor grado de conversiónb
 Dulzura  Viscosidad
 Higroscopicidad y  «Cuerpo»
humectación  Estabilización de espumas
 Depresión del punto de  Prevención de la cristalización
congelación de azúcar
 Incremento del sabor  Prevención del crecimiento de
 Fermentabilidad cristales de hielo.
 Reacción de pardeamiento
a: jarabes de alto índice de conversión (alto ED)
b: jarabes de bajo ED y maltodextrinas.
La hidrólisis continua del almidón produce una mezcla de D-glucosa,

maltosa y otros maltooligosacáridos. Los jarabes con esta composición
se producen en la industria en enormes cantidades. Uno de los más
35
comunes tiene un ED de 42. Estos jarabes son estables a causa de que

la cristalización no se produce con facilidad en tales mezclas complejas.
Se comercializa en concentraciones de alta osmolalidad, tan elevada

que la mayoría de los organismos no pueden vivir en ella.
Para la hidrólisis industrial del almidón a D-glucosa se utilizan 3 o 4

enzimas diferentes. La α-amilasa es una endoglicosidasa que hidroliza
internamente tanto las moléculas de amilosa como las de la
amilopectina, dando lugar a la formación de oligosacáridos.
Los más grandes de ellos pueden estar ramificados una, dos o tres
veces por enlaces (16), puesto que la enzima actúa solo sobre los
enlaces (14) del almidón. La α-amilasa no ataca tampoco a los
segmentos del polímero de almidón que están formando dobles hélices,
ni a los que se encuentran en forma de complejo en un líquido polar
(segmento de hélice sencilla estabilizado).
La glucoamilasa (amiloglucosidasa) se utiliza comercialmente en

combinación con una α-amilasa, para producir jarabes de D-glucosa y D-
glucosa cristalina. La enzima actúa sobre el almidón completamente
gelatinizado como un exoenzima, liberando de forma secuencial
unidades sencillas D-glucosilo a partir de los extremos no reductores de
las moléculas de amilosa y amilopectina, incluso de aquellos que están
unidos por enlaces (16). En consecuencia, esta enzima puede
hidrolizar el almidón por completo, para dar solo moléculas de D-
glucosa, pero se usa en general en almidón que ha sido previamente
despolimerizado con α-amilasa para generar pequeños fragmentos y
más extremos no reductores.20
La β-amilasa libera unidades de disacárido maltosa de manera

secuencial desde el extremo no reductor de la amilosa. También ataca
los extremos no reductores de la amilopectina liberando maltosa, pero
no puede hidrolizar los enlaces (16) de los puntos de ramificación, por
36
lo que da lugar a la formación de un residuo redondeado de amilopectina

denominado dextrina límite, y más específicamente dextrina β-límite.
Existen varios enzimas desramificadores que catalizan de manera

específica la hidrólisis de los enlaces (16) de la amilopectina,
produciendo numerosas moléculas lineales de bajo peso molecular. Una
de estas enzimas es la isoamilasa; entre ellos, la pululanasa.
La ciclodextringlucanotransferasa es un enzima procedente de bacillus

de propiedades únicas, puesto que forma anillos de unidades D-α-
glucopiranosa unido por enlaces (14) a partir de polímeros de almidón.
La enzima puede formar anillos de seis, siete u ocho unidades que se
denominan respectivamente alfa-, beta- y gamma- ciclodextrinas.
Puesto que la conformación helicoidal normal de una porción lineal de

una molécula de almidón contiene seis o siete unidades glucosílicas por
cada vuelta de la hélice, la transferencia de un enlace glucosídico que
une unidades adyacentes de una espiral a otra que forma una estructura
circular a modo de rosquilla es fácil de imaginar. Estos productos,
llamados originalmente dextrinas de Schardinger, por su descubridor,
ahora son conocidos como ciclodextrinas o cicloamilosas. Poseen la
capacidad de formar complejos con sustancias hidrofóbicas que son
mantenidas en el centro del anillo.
El jarabe de maíz es la mayor fuente habitual de D-glucosa y D-fructosa.

Para hacer el jarabe de maíz, se mezcla el almidón de maíz embebido
en agua con una α-amilasa termoestable, y al calentarse se produce
rápidamente la gelatinización y la hidrólisis (licuefacción) catalizada por
la enzima. Después de enfriar a 55 – 60 ºC (130 – 140 ºF), la hidrólisis
se continúa con glucoamilasa, tras lo cual el jarabe es clarificado,
concentrado, refinado con carbón activo y sometido a intercambio iónico.
Si el jarabe es adecuadamente refinado y sembrado con núcleos de
cristalización se obtiene D-glucosa cristalina (dextrosa) o su
monohidrato.
37
Para la producción de D-fructosa, la solución de D-glucosa se pasa a

través de una columna que contiene (de forma inmovilizada) glucosa
isomerasa. La enzima cataliza la isomerización de D-glucosa a D-
fructosa hasta alcanzar una mezcla de equilibrio de aproximadamente
un 58% de D-glucosa y un 42% de D-fructosa. En la industria se desean
normalmente mayores concentraciones de D-fructosa; por ejemplo el
jarabe de maíz de alta concentración de fructosa (HFCS) utilizado como
edulcorante en la elaboración de bebidas refrescantes, contiene
alrededor de un 55% de D-fructosa. Para incrementar la concentración,
el jarabe isomerizado se pasa a través de una columna con una resina
de intercambio catiónico en forma de sal sódica. La resina une la D-
fructosa, que puede ser recuperada hasta alcanzar la concentración
deseada en el jarabe enriquecido en este azúcar.
2.7.2.1. ENZIMAS ESPECÍFICAS DEL ENLACE α(1-4)

Se llaman genéricamente Amilasas y fueron clasificadas en α y β por
Khun en 1925. Las α-amilasas liberan productos de reacción que
tienen el grupo –OH situado en el carbono C1 en configuración α,
mientras que en las β-amilasas se encuentra en configuración β.
Las α-amilasas son las más utilizadas a escala industrial y su origen

puede ser vegetal, animal o microbiano (bacterias, mohos y
levaduras). Se caracterizan por hidrolizar al azar los enlaces α(1-4)
presentes en las cadenas de amilosa y amilopectina produciendo
como sustancias terminales, en el primer caso, glucosa y maltosa, y
en el segundo, además de los sacáridos anteriores, cadenas más o
menos ramificadas llamadas α-dextrinas límite45. Las α-amilasas
atacan al almidón al azar y nunca por los extremos, lo que permite
clasificarlas como endoenzimas. Este ataque sobre las regiones
interiores del sustrato causa un rápido descenso en la viscosidad de
los almidones hinchados y también un cambio en la coloración del
complejo yodo-almidón.24,32,41
38
Las α-amilasas comerciales pueden ser de orígen bacteriano

(Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus amiloliquefaciens, …)
o de origen fúngico (Aspergillus oryzae, Aspergillus Níger, …). Las de
origen bacteriano son más termoestables que las fúngicas.
Las α-amilasas termolábiles de origen fúngico se utilizan

fundamentalmente para la obtención de productos que contienen
unas elevadas proporciones en maltosa.3
La utilización de enzimas termoestables presenta muchas ventajas,

entre ellas se eliminan riesgos de contaminación por
microorganismos y disminuyen la viscosidad del medio ya que actúan
a altas temperaturas. Sin embargo las α-amilasas fúngicas son más
eficaces cuando no es necesario gelatinizar previamente el almidón
además de que ofrecen la posibilidad de trabajar a bajas
temperaturas.
Las β-amilasas son exo-enzimas que atacan las cadenas de almidón

por sus extremos no reductores. Convierten la amilosa en β-maltosa
si estas cadenas contienen un número par de unidades de glucosa
anhidra, mientras que los productos de reacción son β-maltosa y
glucosa cuando el número de unidades de glucosa es impar.
Estas β-amilasas se extraían tradicionalmente a partir de vegetales

(cebada, boniato); sin embargo a partir de 1974 se preparan
fundamentalmente a partir de microorganismos, tales como B.
polymxa, B. megaterium, B. cereus y ciertas especies de
45
Streptomyces y Pseudomonas . Estas β-amilasas bacterianas
presentan múltiples ventajas sobre las de origen vegetal. Producidas
en mayores cantidades por el microorganismo, pueden ser fácilmente
purificadas y actúan a temperaturas entre 60 y 70 ºC y a un pH
comprendido entre 7 y 7,5, más elevado que el de sus equivalentes
vegetales.
39
Las β-amilasas tienen un pH óptimo más elevado que las α-amilasas

y no requieren de iones calcio (Ca2+) para su estabilización térmica o
para el aumento de su actividad.61
2.7.2.2. ENZIMAS ESPECÍFICAS DEL ENLACE α(1-6)

Son las llamadas enzimas desrramificantes. Las más importantes
son la pululanasa, descubierta por Bender y Wallenfels 1961 a partir
de un cultivo de Enterobacter aerogenes, y la isoamilasa, descubierta
por Harada y col 1968 en Japón y Parrish y col 1970 en EEUU a
partir de cultivos de Pseudomonas y Citofaga respectivamente. Sus
parámetros de actividad óptima están situados a pH entre 5 a 6,5 y
Temperatura entre 40 a 50 ºC.
La pululanasa hidroliza la amilopectina del almidón, pero es incapaz,

debido a su gran volumen, de hidrolizar completamente el glucógeno
(polímero de reserva dos veces más ramificado que la amilopectina).
La isoamilasa tiene una actividad complementaria a la pululanasa ya
que desrramifica tanto la amilopectina como el glucógeno. Ambas
enzimas completan al 100% las acciones dextrinizantes y
sacarificantes de las α y β amilasas cuando actúan sobre el almidón,
consiguiendo hidrolizados con alta conversión en maltosa.
2.7.2.3. ENZIMAS ESPECÍFICAS DE LOS ENLACES α(1-4) Y α(1-6)

El descubrimiento en los años 50 y 60 de enzimas microbianas
capaces de hidrolizar los dos tipos de enlaces α(1-4) y α(1-6) ha
mejorado la industria del almidón, ya que la comercialización de
estas enzimas, a partir de 1960, permitió la producción industrial de
dextrosa o D-glucosa por vía enzimática en vez del proceso clásico e
hidrólisis ácida.
Estas enzimas se denominan Amiloglucosidasas o Glucoamilasas.

Son exo-enzimas que tienen una actividad óptima a pH entre 4,5 a 5
y Temperatura entre 50 a 60 ºC. Liberan β-D-glucosa por hidrólisis
repetitiva de los enlaces glucosídicos, empezando por sus extremos
40
no reductores16,45. Provienen de microorganismos del género

Rhizopus y Aspergillus, y por su forma de actuar, aunque varía según
el origen de estas enzimas, parece ser que tienen más facilidad para
unirse a las cadenas largas que a las cortas e hidrolizan antes los
enlaces α(1-4) que α(1-6)41.
La amiloglucosidasa presenta un efecto sinérgico con la α-amilasa.

Esta sinergia disminuye conforme lo hace el peso molecular del
sustrato de modo que por debajo de los 5 000 Dalton puede
despreciarse la acción de la α-amilasa. El papel de la α-amilasa es la
aceleración de la velocidad de formación de glucosa suministrando,
al hidrolizar el almidón, nuevas moléculas que sirven de sustrato a la
amiloglucosidasa.23
Los principales productos obtenidos de la degradación del almidón,

se representa en la figura 10:
MALITOL
Hidrogenación
MALTOSA
MALTOOLIGOSACARIDOS CICLODEXTRINAS
f
g
e
ALMIDÓN
a e
b,c
JARABE DE ALMIDON ALMIDON-SACAROSA
GLUCOSA
a = Alfa-amilasa
d Hidrogenación e = ciclodextrin-
bacteriana
glucosiltransferasa
b = Alfa-amilasa fúngica
f = beta-amilasa
c = Amiloglucosidasa FRUCTOSA SORBITOL
g = Oligosacaridasa
d = glucosaisomerasa
Figura 10. Principales productos obtenidos por degradación del almidón

41
2.7.2.4. AMILASAS
Las amilasas se encuentran no solo en los animales sino también en
las plantas superiores y en los microorganismos. Hay tres tipos
principales de amilasas: α-amilasas, β-amilasas y glucoamilasas.
Actúan primariamente sobre el almidón y el glucógeno.
Las α-amilasas, que se encuentran en todos los organismos,

hidrolizan los enlaces glucosídicos, α(1-4) del interior del almidón
(tanto de la amilosa como de la amilopectina), del glucógeno y de las
ciclodextrinas manteniendo la configuración α del carbono
anomérico. Dado que es un enzima del tipo «endo», su acción tiene
un gran efecto sobre la viscosidad de los alimentos que tienen el
almidón como base.
La α-amilasa es una endohidrolasa que actúa de manera aleatoria

sobre los enlaces internos α(1-4) de la amilosa y de la amilopectina,
con lo cual se producen dextrinas; se le da el nombre de enzima
licuante debido a que su presencia provoca la rápida reducción de la
viscosidad de las soluciones de almidón. Es capaz de romper las
uniones glucosídicas adyacentes a ambos lados del enlace α(1,6) de
la amilopectina, aunque no ataca específicamente este enlace. 2
Las β-amilasas, que se encuentran en las plantas superiores,

hidrolizan los enlaces glucosídicos α (1-4) del almidón en el extremo
no reductor para dar β-maltosa. Dado que son enzimas de tipo exo,
tiene que hidrolizar muchos enlaces antes de que se observe un
efecto apreciable en la viscosidad de las pastas de almidón. La
amilosa se puede hidrolizar en un 100% hasta maltosa mediante la β-
amilasa, pero no es capaz de seguir hidrolizando después del primer
enlace glicosídico α-1,6 que se encuentra en la amilopectina.20
Se han conseguido éxitos importantes en la utilización de enzimas en

la tecnología alimentaria. La producción de jarabe de maíz de alto
contenido en fructosa es un ejemplo. Este proceso requiere una α-
42
amilasa relativamente termorresistente, glucoamilasa y glucosa

isomerasa:glucosa
  amilasa
Almidón   dextrinas   glucosa
glucoamilasa glucosa isomerasa
fructosa (7)
Los puntos de ataque del almidón por diferentes tipos de amilasas,

se puede representar tal como muestra la figura 11:
-amilasa Amiloglucosidasa
Pululanasa
Amiloglucosidasa
-amilasa
Glucosa
Maltosa
Figura 11. Puntos de ataque del almidón por diferentes tipos de amilasas.
2.7.2.4.1. INHIBIDORES DE α-AMILASA

Son tres los tipos de inhibidores de la α-amilasa:20
a) Proteínas producidas por plantas superiores,
b) Polipéptidos pequeños producidos por varias especies de
streptomyces y
c) Carbohidratos pequeños que contienen nitrógeno, producidos por
streptomyces.
2.7.2.5. ENZIMAS INMOVILIZADAS EN EL PROCESO DE ALIMENTOS

Los objetivos de inmovilizar enzimas son permitir su uso repetido
para fabricar productos y, al final, conseguir un producto libre de
enzima. Actualmente, el costo de preparaciones más puras de
enzimas sería prohibitivo si solo se usara una vez. La ventaja de las
43
enzimas inmovilizadas es que pueden ser usadas repetidamente, lo

que disminuye mucho el costo total.
La mayoría de los alimentos son demasiado complejos, físicamente.

La complejidad química no es un problema. Debido a la alta
especificidad de las enzimas, un único compuesto como la glucosa,
por ejemplo, puede ser seleccionado entre una compleja mezcla,
unirse a la glucosa oxidasa y convertirse en producto. Los otros miles
de compuestos no cambian.
En un sistema con enzimas inmovilizados es necesario tomar

medidas especiales para conseguir que haya contacto entre la
enzima y el sustrato. Esto puede realizarse añadiendo la preparación
de la enzima inmovilizada y haciéndola circular extensamente o
haciendo fluir el alimento por una enzima inmovilizada estática
(columna, pared de un tubo recubierto, etc.). La enzima inmovilizada
puede usarse durante varios meses.20
2.7.2.5.1. MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

Las enzimas pueden ser inmovilizadas por diversos métodos:
a) Fijación covalente a un material de soporte insoluble como
metales, cristal, cerámica, nylon, celulosa, sheparosa o sephadex;
b) Inclusión en la matriz de un gel hecho de, por ejemplo,
poliacrilamida, sephadex o agar;
c) Adsorción a una matriz insoluble por métodos hidrófobos
electrostáticos u otros métodos por semejanza no covalente;
d) Adsorción a una matriz insoluble y unión posterior a esta por
enlaces covalentes;
e) Entrelazamiento intermolecular de enzimas para formar una
matriz insoluble que se usa en forma granular;
f) Unión a membranas semipermeables; y
g) Suspensión de partículas insolubles de enzimas en disolventes
orgánicos inmiscibles.
44
2.7.2.5.2. CRITERIOS USADOS PARA OPTAR POR UN MÉTODO DE

INMOVILIZACIÓN
a. Estabilidad de la enzima durante el uso repetido;
b. Mantenimiento de la actividad de la enzima después de la
inmovilización;
c. Estabilidad de la matriz frente a otros enzimas y condiciones
como el flujo, la presión y la temperatura;
d. Accesibilidad del sustrato a la enzima (difusión del sustrato hacia
la enzima y separación de los productos de la enzima);
e. Susceptibilidad del enzima a la degradación por el sustrato que se
le suministre;
f. Eficiencia de la conversión del sustrato en producto;
g. Compatibilidad del sistema con los pasos subsiguientes de la
conversión y recuperación del producto;
h. Necesidad de cofactores;
i. Compatibilidad del enzima puro, de la enzima sin purificar o de las
células con la inmovilización;
j. Susceptibilidad a la contaminación microbiana;
k. Eficacia de la renovación; y
l. Costo.
Idealmente, el sistema de una enzima inmovilizada debería ser

reutilizable cientos de veces (de 3 a 6 meses) antes de que se
perdiera un 50% de la actividad enzimática.
2.7.2.5.3. ALGINATOS PARA INMOVILIZAR ENZIMAS

El alginato comercial es una sal, la mayoría de las veces la sal
sódica, de un ácido poliurónico, el ácido algínico, que se obtiene a
partir de algas pardas. El ácido algínico está compuesto de dos
unidades monoméricas, ácido β-D-manopiranosilurónico y ácido α-L-
gulopiranosilurónico.
Estos dos monómeros se encuentran, bien en regiones homogéneas

(compuestas exclusivamente de una unidad o de la otra) o bien en
45
regiones en las que están mezclados. Los segmentos que contienen

solo unidades de ácido β-D-manopiranosilurónico se les conoce
como bloques M, y los que contienen solo unidades de ácido α-L-
gulopiranosilurónico, como bloque G.
Figura 12. Unidades G y M de alginatos
Las regiones de bloques M son planas y en forma de cinta, similar a

las cadenas de celulosa debido a que el tipo de enlace es siempre
ecuatorial-ecuatorial.
Las regiones de bloque G poseen una conformación plegada

(corrugada), como resultado de los enlaces de tipo axial-axial.
Figura 13: Bloques G y M de alginatos

46
Porcentajes diferentes de los dos tipos de bloques dan lugar a que

los alginatos de algas distintas poseen propiedades diferentes. Los
alginatos con un elevado contenido en bloques G producen geles
muy fuertes.
Figura 14: Formación de gel de alginato de calcio: unidades de

ácido gulurónico en solución
Las soluciones de los alginatos sódicos son muy viscosas. La sal

cálcica, por su parte, es insoluble. Esta insolubilidad resulta de la
reacción autocooperativa entre los iones calcio y las regiones de
bloques G de la cadena. Los agujeros formados entre dos cadenas
de bloque G constituyen cavidades que ligan iones calcio. El
resultado es una zona de unión que da lugar a un ordenamiento
conocido como «caja de huevos» en el que los iones de calcio se
encuentran fijados en los huecos similares a los de estos recipientes.
La fuerza del gel depende del contenido de bloques G en el alginato
utilizado y de la concentración de iones calcio.
Las sales de calcio y de amonio producen soluciones viscosas

estables en un intervalo de pH de 5 a 10; debido a su naturaleza
iónica, estos polímeros se ven afectados por la presencia de sales y
por pH inferiores a 5.2
Figura 15: Formación de redes de gel con cadenas

homopoliméricas unidas a través de iones calcio
47
Figura 16: Unión entre cadenas homopoliméricas a través de iones de

calcio situados entre los grupos con carga negativa
2.7.2.6. MÉTODOS DE MEDIDA DE LA ACTIVIDAD AMILOLÍTICA

Dada la gran variedad de técnicas de medida de la actividad de las
amilasas que han sido desarrolladas, la elección de la más adecuada
depende de los requerimientos del caso concreto al que vaya a
aplicarse. Los métodos más comúnmente utilizados para la
determinación de la actividad de las amilasas pueden ser clasificados
en: sacarogénicos, cromogénicos y amiloclásticos 58. Los métodos
amiloclásticos miden la degradación del almidón por viscosimetría,
turbidimetría, yodometría25 y nefelometría56. Los métodos
sacarogénicos representan una medida directa de la hidrólisis
mediante la determinación del número de extremos reductores
generados en ella15,18,30,46,51,57,63,66,69,72. Los métodos cromogénicos
se basan en el uso de sustratos coloreados 11,43,55,58,68.
2.7.2.6.1. MÉTODOS SACAROGÉNICOS

Durante la hidrólisis del almidón se van generando nuevos grupos
reductores, uno por cada enlace hidrolizado. Este incremento de
extremos reductores viene determinado por la oxidación del carbono
anomérico situado en el extremo reductor. La subsiguiente reducción
de un ión metálico o de un compuesto da lugar a la aparición de una
48
coloración, ya sea por el estado reducido de dicha sustancia o por

formación de un complejo coloreado.
La determinación colorimétrica de la formación de extremos

reductores ha venido siendo realizada en condiciones alcalinas
principalmente mediante el uso de tres reactivos oxidantes:
cobre18,51,69,72, ferrocianuro30,63,66, ácido 3,5-dinitrosalicílico46. Además
de la determinación colorimétrica también se han empleado métodos
potenciométricos57. Para la cuantificación de la cantidad de extremos
reductores generados se ha venido tomando como referencia la
maltosa para realizar las rectas patrón.
A la hora de utilizar estos métodos se han de tomar precauciones

pues en algunos de ellos el poder reductor de los azúcares
disminuye al aumentar el grado de polimerización de la glucosa17. Tal
es el caso por ejemplo del método del DNS46 en el cual obtendríamos
que la actividad de la amilasa disminuyera al aumentar el grado de
polimerización del azúcar usado como referencia (glucosa, maltosa,
maltotriosa). En el caso del método del CuSO4/biquinolina69, la
maltopentosa, maltotetrosa, maltotriosa y maltosa darían curvas
patrón idénticas y diferentes a la glucosa (mayor cantidad de
azúcares reductores).
Investigaciones sobre el método de Somogyi-Nelson51,72 han

demostrado que no existen diferencias en las curvas patrón
obtenidas al usar glucosa o maltosa como referencia17. Estos
resultados fueron confirmados por el hallazgo de que dicho método
da equivalentes reductores equimolares para extremos reductores
equimolares de malto-oligosacáridos.
Estudios del método del ferrocianuro66 también han puesto de

manifiesto un mayor poder reductor de la glucosa respecto a otros
malto-oligosacáridos. Así el método fue modificado30 para obtener el
49
mismo poder reductor para la glucosa y maltosacáridos hasta un

grado de polimerización igual a 40.
2.7.2.6.2. MÉTODOS CROMOGÉNICOS

En ellos se usan bien complejos insolubles del sustrato, los cuales
liberan fragmentos coloreados al ser hidrolizados11,55,58, o bien
paranitrofenol derivados de los maltosacáridos (maltopentosa,
maltohexosa, maltoheptosa) los cuales liberan el paranitrofenol al ser
hidrolizados por una mezcla de la amilasa problema con α-
glucoamilasa, pudiendo medirse aquel
8,43,68
espectrofotométricamente . El uso de α-glucoamilasa limita el
rango de aplicación de este método a pH 5.0 – 6.0. Además la
actividad enzimática obtenida para sustratos de cadena corta (por
ejemplo maltopentosa) puede conducir a resultados no aplicables
para sustratos de cadena larga como el almidón nativo, el cual puede
variar en estructura y presentar múltiples ramificaciones, debido a
que la actividad de la α-glucoamilasa puede variar dependiendo de la
longitud de cadena del sustrato, presentando menor actividad en
sustratos de cadena larga que en los de cadena corta 21.
2.7.2.6.3. MÉTODOS AMILOCLÁSTICOS

Entre ellos los más utilizados son el método yodométrico25,32, basado
en el color azul que desarrolla el complejo yodo-almidón, métodos
basados en la medida de los cambios en la viscosidad de la
disolución de almidón al ir hidrolizándose66, turbidimetría y
nefelometría56.
El método yodométrico se basa en el hecho conocido de la formación

de un complejo de inclusión de I 2 , I 3 e I 5 en la estructura helicoidal
de la amilosa al añadir sobre una disolución de almidón una

disolución de yodo-yoduro potásico. La capacidad de ligar yodo es de
20-22 mg por 100 mg de amilosa12.
50
Este complejo da una coloración azul medible

espectrofotométricamente25,32. Conforme se hidroliza el almidón, por
la acción de la amilasa, la intensidad de la coloración azul disminuye.
La longitud de onda a la cual absorbe el complejo yodo-amilosa
disminuye conforme lo hace el grado de polimerización de la amilosa,
existiendo un límite correspondiente a 20 unidades de glucosa por
debajo del cual no se produce coloración32.
2.8. CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS

La característica que distingue a las enzimas de otras proteínas es que
las enzimas unen sus sustratos estereoespecíficamente a su centro
activo y los convierten en productos. Por lo tanto, la presencia de una
enzima se determina viendo si el sustrato se transforma en producto
más de prisa de lo que ocurre en ausencia de enzima.
Los ensayos de actividad enzimática se basan en la aparición de

cambios físicos o químicos del(os) sustrato(s) y/o del(os) producto(s) en
la mezcla de reacción.
Los métodos continuos (cambios de la absorbancia, de la fluorescencia

o del pH) son preferibles a aquellos en los que hay que tomar alícuotas a
diversos tiempos, parar la reacción inactivando la enzima y añadir uno o
más reactivos para formar un derivado mensurable del sustrato o del
producto (mejor de este último).20
Las enzimas catalizan reacciones biológicas, y al igual que otros

catalizadores, influyen en la velocidad a la cual se alcanza el equilibrio
sin afectar propiamente el equilibrio global; en estas circunstancias, las
transformaciones químicas se llevan a cabo mediante una ruta que
requiere menos energía libre de activación.
51
Tabla 7. Energía de activación para algunas reacciones de

interés en alimentos
Reacción Kcal/mol
Reacciones enzimáticas 10-30
Hidrólisis 15
Oxidación de Lípidos 10-25
Oscurecimiento no enzimático 25-50
Destrucción de enzimas 12-100
Desnaturalización de proteínas 80-120

Fuente: Badui, 1997
Tabla 8. Energía de activación de algunas reacciones

Reacción Catalizador Ea (cal/mol)
Hidrólisis de caseína HCl 20 600
Tripsina 12 000
Inversión de sacarosa H+ 26 000
Invertasa de levadura 11 500
Hidrólisis de butirato etílico H+ 13 200
Lipasa pancreática 4 200
Descomposición de H2O2 Ninguno 18 000
Pt coloidal 11 700
Catalasa de hígado 5 500
Hidrólisis del éster fosfato Fosfatasa 3 400

Fuente: Badui, 1997
52
Estado de
transición
(b)
Energía libre
(a)
Estado inicial (c)
Estado final
Tiempo de reacción
Figura 17. Diagrama de energía para una reacción química
efectuada (a) con catalizador y (b) sin catalizador. El cambio de
energía (c) representa la diferencia de energía libre entre los
estados inicial y final de la reacción.
Obtener una ecuación cinética que reproduzca las conversiones en

función del tiempo y de las condiciones experimentales de la reacción es
difícil, debido, fundamentalmente, a las siguientes causas:
 El almidón es una mezcla de amilopectina y amilosa; ello conlleva a

una estructura compleja en donde existen ramificaciones y diferentes
tipos de enlaces, α(1-4) y α(1-6), que son hidrolizados por distintas
enzimas.
 La mezcla de almidón y productos de reacción varía en función del
tiempo de hidrólisis y está formada por sacáridos de diferentes pesos
moleculares.
 Durante el proceso de hidrólisis pueden producirse reacciones de
reversión.
53
Por estas razones, la mayoría de los autores que estudian la hidrólisis

del almidón con diferentes enzimas, se limitan a evaluar las velocidades
de reacción aplicando la ecuación de Michaelis – Menten y determinan
los parámetros CM y rm, o proponen modelos empíricos que de alguna
forma explican sus resultados experimentales 53,54.
2.8.1. REACCIONES DE ENZIMAS INMOVILIZADAS

Enzimas inmovilizadas son aquellas que están adheridas
frecuentemente a paredes celulares y membranas o están unidos a
soportes insolubles para la conversión comercial de sustratos en
productos. Cuando la enzima está inmovilizada, hay factores adicionales
que afectan a la formación del complejo enzima-sustrato y a la catálisis.
Estos incluyen:
a) Solo el sustrato puede difundir libremente;
b) El soporte de la enzima está rodeado por la capa (de difusión) de
Nerst, que actúa como límite disminuyendo la concentración de
sustrato en las proximidades del enzima en relación a la
concentración en el resto del volumen;
c) Hay factores electrostáticos debidos a cargas del sustrato, de la
enzima o del soporte que pueden aumentar la unión (cargas
opuestas) o disminuir (cargas del mismo signo) la formación de
complejos; y
d) Las condiciones de velocidad inicial, no se dan ya que se desea la
máxima conversión de sustrato en producto.
2.8.2. FACTORES QUE INFLUYEN EN LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS

 Concentración de sustrato
 Concentración de enzima
 Efecto del pH (pH óptimo de α-amilasas es 7)
 Efecto de la temperatura
 Concentración / actividad del agua
54
2.8.2.1. EFECTO DEL pH

La actividad de las enzimas depende mucho de la concentración de
iones de hidrógeno del medio, ya que esto afecta el grado de
ionización de los aminoácidos del sitio activo, del sustrato, o del
complejo enzima-sustrato; todo esto llega a influir en la afinidad que
tenga la enzima por el sustrato.
En los casos en que los sustratos no son ionizables, como la mayoría

de los carbohidratos y los lípidos, los grupos iónicos de las enzimas
son los únicos afectados por el pH.
Por esta razón, todas las enzimas presentan una máxima actividad
catalítica a un cierto valor óptimo de pH, en un intervalo de 5 a 8, aun
cuando hay excepciones muy importantes.
(a)
Velocidad de reacción
(b)
(c)
(d) (d)
0
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
pH
Figura 18: Efecto del pH en la actividad enzimática: (a) pH
óptimo; (b) intervalo de estabilidad de la enzima; (c) intervalo de
inactivación reversible y (d) inactivación instantánea.
55
2.8.2.2. EFECTO DE LA TEMPERATURA

Como sucede con la mayoría de las reacciones químicas, la
velocidad de las enzimáticas aumenta con la temperatura, pero solo
en el intervalo en que la enzima es estable y retiene su capacidad
catalítica; en casos extremos, cuando se incrementa mucho la
temperatura, se favorece la desnaturalización y consecuentemente
esta proteína pierde su capacidad catalizadora.
Por esta razón, cada enzima tiene un intervalo óptimo de

temperatura en el cual se logra la mayor actividad; la mayoría tiene
su óptimo entre 30 y 45 ºC, y se inactiva a más de 55 ºC.2
La mayoría de las enzimas actúan en el intervalo de 25 a 90 ºC y

muchas de ellas tienen su óptimo entre 45 y 60 ºC; en general, por
cada 10 ºC de incremento, se duplica su velocidad, es decir, tiene un
Q10 de 2,0. Hay que recordar que esto solo es válido dentro del
intervalo de temperatura en que la enzima es estable, ya que un
incremento muy grande puede provocar su desnaturalización e
inactivación.2
desnaturalización
Actividad enzimática
Temperatura
Figura 19: Efecto de la temperatura en la actividad

catalítica de las enzimas.
56
El término Q10 se usa para medir el efecto de la temperatura en la

velocidad de reacción; se expresa como una relación de dos
velocidades a dos temperaturas con una diferencia de 10 ºC entre
ellas:
velocidad de reacción a T + 10 ºC
Q10  (8)
velocidad de reacción a T
Es decir, un valor de Q10 = 2 indica que la velocidad de reacción se

duplica por cada 10 ºC de aumento dentro del intervalo de
temperatura en el que la enzima es estable; los valores de Q 10 para
la mayoría de estos catalizadores se encuentran entre 2 y 4.
Igualmente, el efecto de la temperatura en la velocidad de reacción
enzimática se puede representar por la ecuación de Arrhenius:
Ea
k  Ae Ea RT
o bien ln k  ln A  (9)
RT
Donde: k = constante de la velocidad de reacción

A = constante llamada factor de frecuencia
Ea = energía de activación
T = temperatura absoluta (ºK)
R = constante de los gases (8,314 J/mol·ºK)
La Ea es la energía requerida para tener las moléculas en un estado

activo y puede calcularse por la pendiente de la línea que se obtiene 2
al graficar lnK contra 1/T.
2.8.2.3. ENERGÍA DE ACTIVACIÓN DE LA REACCIÓN CATALIZADA

ENZIMÁTICAMENTE.
Para determinar las energías de activación se necesitan dos
representaciones:
57
 Representación de los valores experimentales de concentración de

producto frente al tiempo a diferentes temperaturas (figura 20) y
 Representación de log k, la constante de velocidad de la reacción
de orden cero, frente a 1/T (figura 21).
Para la primera representación, las temperaturas tienen que ser lo

suficientemente bajas para obtener buenos valores de velocidad inicial
antes de que la velocidad de desnaturalización de la enzima sea un
problema, CAo tiene que ser >> CM para que la enzima esté saturada
con sustrato a todas las temperaturas y el pH (el mismo valor para
todas las temperaturas) tiene que ser el óptimo. 20
(60º) (55º) 50º

Concentración de producto
55º
40º
30º
60º
20º
Tiempo
Figura 20. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de
formación de producto. Las líneas continuas son las de los
valores experimentales; las líneas discontinuas están basadas en
las velocidades iniciales (por ej., líneas trazadas tangencialmente
a los valores experimentales a tiempos cercanos a cero).
La segunda representación se puede hacer usando los valores k y las

temperaturas de la figura 21. La energía de activación, Ea, se obtiene
de la pendiente de esta representación (pendiente = -Ea/2.3R).
58
Los valores típicos de Ea de las reacciones enzimáticas varían entre 25

000 a 50 000 J/mol.
 Ea
Pendiente 
2.3R
log k
1/T (K)
Figura 21: Efecto de la temperatura sobre la constante de
velocidad de una reacción.
El valor ΔH a una temperatura fija se puede determinar a partir de la

relación:
Ea  H  RT (10)
ΔG se calcula a partir de:

G  RT ln  kh kBT  (11)
Donde: kB es la constante de Boltzman (1,380x10-16 erg grad-1) y

h es la constante de Planck (6,624x10-27 erg seg)
La entropía de activación, ΔS para una temperatura fija se calcula de

acuerdo con:
G  H  T S (12)
59
2.8.2.4. DEPENDENCIA DE LA TEMPERATURA SEGÚN LA LEY DE

ARRHENIUS
En el caso de estas reacciones, se ha encontrado que en
prácticamente todos los casos el término dependiente de la
temperatura, la constante de velocidad de reacción, está bien
representado por la ley de Arrhenius:
k  Ae E RT (13)
Donde A se denomina factor pre-exponencial o factor de frecuencia y

E es la energía de activación de la reacción. Esta expresión se ajusta
bien a los datos experimentales en un amplio rango de temperaturas
y, desde diferentes puntos de vista, se considera como una muy
buena aproximación a la verdadera dependencia de la temperatura.
A la misma concentración, pero a diferentes temperaturas, la ley de

Arrhenius indica que:
r2 k E 1 1 
ln  ln 2     (14)
r1 k1 R  T1 T2 
Siempre que E permanezca constante.
La dependencia de las reacciones a la temperatura está determinada

por la energía de activación y por el nivel de temperatura en la
reacción.
1. A partir de la ley de Arrhenius, una gráfica de ln k contra 1/T
produce una línea recta con pendiente grande si E es grande, y
con pendiente pequeña si E es pequeña.
2. Las reacciones con energía de activación grande son muy
sensibles a la temperatura; las reacciones con energías de
activación pequeñas son relativamente poco sensibles a la
temperatura.
60
3. Cualquier reacción es mucho más sensible a la temperatura

cuando las temperaturas son bajas que cuando son altas.
4. A partir de la ley de Arrhenius, el valor del factor de frecuencia k o
no afecta la sensibilidad a la temperatura.
2.8.3. REGULACIÓN DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS

La actividad enzimática puede ser controlada de distintas maneras que
son muy importantes para el científico de los alimentos. La velocidad de
una reacción catalizada enzimáticamente es por lo general directamente
proporcional a la concentración de enzima activo y dependiente (de una
manera compleja) de las concentraciones de sustrato, inhibidor y
cofactor, y de la temperatura y el pH.
La mayoría de las reacciones enzimáticas disminuyen 1,4 – 2 veces por

cada 10 ºC de descenso de la temperatura. Por lo tanto, a 5 ºC las
velocidades serían de 0,5 a 0,25 veces la velocidad a 25 ºC. Alejar el pH
del sistema del pH óptimo para la actividad entre 1 y 2 unidades puede
disminuir la velocidad enzimática a 0,5 y 0,1 veces, respectivamente, de
la velocidad al pH óptimo. Disminuir la concentración de enzima a 0,1
veces de la presente normalmente, disminuiría la actividad enzimática a
0,1 veces de la originalmente presente.
2.8.4. LA ECUACIÓN CINÉTICA39

Sea la reacción: aA  bB 
 rR  sS
La medida más útil de la velocidad de reacción del reactivo A es:
1 dN A cantidad de A que desaparece  mol 
rA    , 3  (15)
V dt  volumen  tiempo  m s 
La experiencia ha demostrado que en la velocidad de la reacción

influyen la composición y la energía del material. Energía significa aquí
temperatura (energía cinética debido al movimiento aleatorio de las
moléculas), intensidad de luz dentro del sistema, intensidad de campo
magnético, etc. Solo se necesita tomar en cuenta la temperatura.
61
Así es posible escribir:

 términos términos 

rA  f dependientes de , dependientes de  (16)
 la temperatura la concentración 
2.8.4.1. MECANISMO PARA LA REACCIÓN ENZIMA – SUSTRATO39

En este caso, un reactivo, llamado sustrato, se convierte en producto
por la acción de una enzima, una sustancia proteínica de peso
molecular elevado (pm > 10 000). Una enzima es muy específica, es
decir, cataliza únicamente una reacción particular o un grupo de
reacciones, Así:
A 
enzima
R (17)
Muchas de estas reacciones muestran el siguiente comportamiento:

 Una velocidad proporcional a la concentración de enzima
introducida en la mezcla CEo
 A bajas concentraciones de reactivo la velocidad es proporcional
a su concentración, CA
 Cuando la concentración de reactivo es alta, la velocidad se
estabiliza y se vuelve independiente de su concentración.
Los primeros que resolvieron este problema fueron Michaelis y

Menten (1913). Conjeturaron que la reacción se efectuaba de la
siguiente manera:
A E
1
2
X (18)
X 
3
R  E (19)
Hay dos supuestos:

CEo  CE  C X (20)
62
dCX
0 (21)
dt
M-M asume que la reacción reversible de (18) alcanza el equilibrio

rápidamente, o
CX k
k  1 (22)
C AC E k 2
De (19): rR  k3C X (23)
dCX
De (21):  0  k1CACE   k2  k3  CX (24)
dt
Eliminando E con (19):
 
k1C A CEo  C X   k2  k3  C X  0 (25)
k1CACEo
De (25): CX  (26)
k1CA  k2  k3
(26) en (23) da:

k3C ACEo
 rA  rR  (27)
k 2  k3
 CA
k1
k 2  k3
Donde:  CM  constante de M-M
k1
A = sustrato
E = enzima
X = intermedio (enzima-sustrato)
R = producto
Eo = enzima inicial
63
2.8.5. REACTORES DE FLUJO PISTÓN EN ESTADO ESTACIONARIO39

En un reactor de flujo pistón la composición del fluido varía de un punto
a otro a lo largo de la dirección del flujo; en consecuencia, el balance de
materia para un componente de la reacción debe hacerse para un
elemento diferencial de volumen dV.
Figura 22: Nomenclatura para un reactor de flujo pistón
Así para el reactivo A:
Entrada = Salida + desaparición por reacción + acumulación

0
FA   FA  dFA    rA  dV (28)
Donde: FA = entrada de A, moles/tiempo

FA + dFA = salida de A, moles/tiempo
(-rA) dV = desaparición de A por reacción, moles/tiempo
Teniendo en cuenta que:
dFA  d  FAo 1  X A     FAo dX A (29)

64
Sustituyendo resulta:
FAo dX A   rA  dV (30)
Esta es, entonces, la ecuación referida a A para la sección diferencial

del reactor de volumen dV. A fin de resolver para todo el reactor es
necesario integrar esta expresión. Ahora bien FAo, la velocidad de
alimentación, es constante, pero rA depende de la concentración o de la
conversión de los componentes.
Agrupando los términos convenientemente, se obtiene:
V dV X A dX
0 FAo
 f
0 rA
A
(31)
Por tanto:
V  X A dX
  f A
(32)
FAo CAo 0 rA
V VC Ao X A dX
   C Ao  f A
(33)
vo FAo 0 rA
En cuanto a una expresión más general para los reactores de flujo

pistón, si la alimentación a la que se refiere la conversión entra al reactor
parcialmente convertida, se tiene que:
V X A dX X Af dX A
FAo
 f
X Ai r
A
A
o   CAo X Ai rA
(34)
Para el caso especial de sistemas de densidad constante

CA dC Ao
X A  1 y dX A   (35)
C Ao C Ao
65
Y en este caso la ecuación de diseño puede expresarse en función de

las concentraciones:
V  X A dX 1 CA f dCA
  f A
  (36)
FAo CAo 0 rA CAo C Ao rA
V X A dX C A dC
  C Ao  f A
  f A
(37)
vo 0 rA C Ao rA
Cualquiera que sea su forma, la ecuación de diseño relaciona la

velocidad de reacción, la conversión, el volumen del reactor y la
velocidad de alimentación, de tal manera que si alguna de estas
cantidades se desconoce, podrá calcularse a partir de las otras tres.
En la fig. 23 se representan estas ecuaciones de diseño y se observa

que el espacio-tiempo necesario para cualquier tarea particular puede
calcularse siempre por integración numérica o gráfica.
Figura 23: Representación gráfica de las ecuaciones de diseño

para el reactor de flujo pistón
66
Según M-M:
k3CEo CA
rA  rR  (38)
CM  CA
La integración de esta ecuación resulta:
 
CAo
CM ln  CAo  CA  k3CEo t (39)
CA
La desventaja de esta ecuación es que no puede graficarse

directamente para encontrar los valores de las constantes k 3 y CM. Sin
embargo, reordenando los términos se llega a la siguiente expresión que
sí puede ser graficada para obtener las constantes de velocidad. (Ver
fig. 24).
CAo  CA t
 CM  k3CEo (40)
CA CA
ln o ln o
CA CA
2.8.5.1. OTROS MÉTODOS PARA EVALUAR k y C M

Los biólogos y los expertos en ciencias de la salud han desarrollado una
tradición de ajustar y calcular las constantes de la ecuación M-M con un
procedimiento de etapas múltiples:
 Medir primero CAout contra t para datos tomados en cualquiera de los
tres reactores ideales, intermitente, de tanque agitado o de flujo
pistón;
 Evaluar después –rA para varias CA;
 Graficar CA contra (-rA) de una de las dos formas siguientes:
o (-rA) contra (-rA)/CA la gráfica de Eadie
o 1/(-rA) contra 1/CA la gráfica de Lineweaver
 Deducir CM y k a partir de estas gráficas.
67
Figura 24. Gráficas que puede utilizarse para probar y ajustar la ecuación
de M-M a partir de datos provenientes de un reactor de flujo pistón.
2.8.6. INHIBICIÓN POR UNA SUSTANCIA EXTRAÑA, INHIBICIÓN

COMPETITIVA Y NO COMPETITIVA
Cuando la presencia de la sustancia B causa la disminución de la
velocidad de la reacción enzima-sustrato, entonces B se denomina
inhibidor.
Se tienen varios tipos de acciones de los inhibidores, denominándose

los modelos más sencillos inhibición competitiva y no competitiva. Se
produce una inhibición competitiva cuando A y B atacan el mismo sitio
de la enzima. Se tiene una inhibición no competitiva cuando B ataca en
un sitio diferente de la enzima, pero al hacerlo detiene la acción de A.
68
Figura 25. Representación simple de la acción de dos tipos de

inhibidores
2.8.6.1. CINÉTICA DE LA INHIBICIÓN COMPETITIVA

Cuando A y B compiten por el mismo sitio sobre la enzima, se tiene
el mecanismo siguiente:
A E X  R  E
1 3
2
(41)
BE
4
5
Y (42)
Se llega a la siguiente ecuación de velocidad:

k3CEo C A k3CEo C A
rR   (43)
CM  C A  NCBo CM  
CM 1  NCBo  C A
k2  k3 mol
Donde: CM  , 3
k1 m
k 4 m3
N ,
k5 mol
2.8.6.2. CINÉTICA DE LA INHIBICIÓN NO COMPETITIVA

En este caso A ataca la enzima en un sitio y B la ataca en otro sitio
diferente, pero al hacerlo detiene la acción de A. El mecanismo de
esta acción está representado por:
A E X  R  E
1 3
2
(44)
BE
4
5
Y (45)
B X
6
7
Z (46)
69
Observar que B ataca a la enzima independientemente de si A está

enlazado a ella o no. La velocidad global es entonces:
k3
CE C A
k3CEo C A 1  LCBo o
rR   (47)
CM  C A  NCBo CM  LC ACBo  1  NCBo 
CM 
 1  LCB   C A
 o 
k 2  k3 k4 k6
Donde: CM  N N
k1 k5 k7
2.8.6.3. COMO DISTINGUIR ENTRE INHIBICIÓN COMPETITIVA Y NO

COMPETITIVA A PARTIR DE DATOS EXPERIMENTALES
Con los datos de C contra t obtenidos, se hace una de las gráficas
recomendadas para los sistemas sin inhibición. Si existe inhibición
estas gráficas se modifican tal como se muestra en la figura 26.
La ecuación M-M es la expresión más simple para representar las

reacciones catalizadas por enzimas. Ha sido modificada y ampliada
de muchas formas. Las dos formas de inhibición presentadas aquí
son las más simples imaginables. Otras formas son mucho más
complejas de representar matemáticamente, por lo que siempre se
probarán primero éstas.39.
Figura 26. Efecto de la inhibición sobre los datos provenientes de

reactores de flujo pistón o de reactores intermitentes
70
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
El propósito de esta parte es implementar la metodología experimental para el

proceso de hidrólisis enzimática del almidón, usando un reactor de lecho
empacado de α-amilasa inmovilizada y según la literatura consultada, el
método de espectroscopia del visible será empleado con el propósito de
monitorear el progreso del proceso hidrolítico y con esto poder evaluar la
cinética y poder determinar las condiciones en las que se logre un alto grado de
conversión o hidrólisis del almidón.
La implementación de éste método, requiere de empleo de material, equipo y

reactivos los cuales se detallan a continuación:
3.4. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

3.4.1. MATERIALES
Los materiales de laboratorio que se requieren para llevar a cabo los
experimentos son:
 02 fiolas de 1 l  02 pipetas de 2 ml
 02 fiolas de 500 ml  02 pipetas de 5 ml
 02 fiolas de 250 ml  02 pipetas de 10 ml
 06 fiolas de 100 ml  20 tubos de ensayo
 12 fiolas de 50 ml pequeños
 06 vasos de precipitados  10 tubos de ensayo
de 250 ml medianos
 06 matraces erlenmeyer  02 gradillas para tubos de
de 250 ml ensayo
 01 probeta de 50 ml  02 espátulas
 01 probeta de 100 ml  02 soporte universal
 01 probeta de 250 ml  02 recipientes de vidrio de 1l
 02 pipetas de 1 ml con salida lateral
71
3.4.2. EQUIPOS
Los equipos a utilizar pertenecen al Laboratorio de la Facultad de
Ingeniería Química de la Universidad Nacional del Altiplano – Puno, y
son los siguientes:
 Espectrofotómetro UV-Visible, Rango de longitud de onda: 325 nm a
1 100 nm, equipo de Thermo Electron Corporation, modelo
GENESYS 10Vis.
 Baño termostático con controlador programable, equipo de Brookfield
Engineering Laboratories Inc., modelo TC-102P.
 Reactor de lecho fijo, enchaquetado, de vidrio; equipo armado en
laboratorio, que consta de una columna de 14,0 cm x 1,2 cm.
 Balanza analítica
 pH-metro HANNA, con electrodo combinado de vidrio, Precisión 0,01
 02 cocinillas eléctricas
 01 agitador magnético con pastilla magnética
3.4.3. REACTIVOS
Los reactivos necesarios para llevar a cabo los experimentos se citan a
continuación:
 Yodo en cristales (resublimado) HALLINCKRODT de Química Suiza
 Yoduro de sodio (sólido) de DIPROQUIM
 Almidón soluble Erg B6 (sólido) de MERCK
 Cloruro de Calcio CaCl2·2H2O (crystals)
 Fosfato de Sodio monobasico 2-hidrato (NaH2PO4·2H2O) de KW
KESSEL S.A.
 Fosfato de Sodio dibásico 7-hidrato (Na2HPO4·7H2O) de KW
KESSEL S.A.
 Agua destilada para análisis químico
 Alginato de sodio, ALGINELLE, de LASCOD S.p.A., clase A – tipo II.
 Enzima: Se utilizó una α-amilasa fungal de 5 000 SKB/g, Enzymix
5000. Es una enzima derivada del Aspergillus oryzae. Ha sido
aprobada para su uso por el Codex Alimentarius.
72
3.5. MÉTODO YODOMÉTRICO PARA EL SEGUIMIENTO DE LA REACCIÓN

Para el seguimiento de la reacción se utiliza el procedimiento basado en el
método yodométrico de medida de actividad de amilasas descrito por
Fuwa 1954. El método yodométrico se basa en el hecho conocido de la
formación de un complejo de inclusión de I 2 , I 3 e I 5 en la estructura
helicoidal de la amilosa al añadir sobre una disolución de almidón una

disolución de yodo-yoduro potásico.
Este complejo da una coloración azul, medible espectrofotométricamente

conforme se hidroliza el almidón, por la acción de la amilasa. La
intensidad de la coloración azul disminuye.
El ion yoduro (I-) puede combinarse con el yodo elemental (I2) para
producir el anión triyoduro (I3-). Este ion triyoduro se combinará con la
amilosa del almidón y se tornará de color azul rojizo, según se muestra en
las siguientes reacciones:
I   I 2 
 I 3 (48)
I3  amilosa 
 complejotriyoduro  amilosa (49)
color azul rojizo
Según estos fundamentos se requiere preparar una solución que aporte el

yoduro y el yodo. Se empleará entonces el KI como fuente del ion yoduro.
Además, según las fuentes bibliográficas, se requiere mantener el

proceso de hidrólisis enzimática a un pH = 7,0; ya que a este pH la
actividad de la alfa-amilasa es la más óptima. Por ello se requiere
preparar una solución tampón.
En el trabajo experimental se requiere también de evaluar la influencia de

la concentración de almidón en el ingreso al reactor, por lo que es
necesario preparar soluciones de almidón a diferentes concentraciones
según el diseño experimental que se muestra en la tabla 11.
73
La inmovilización de la enzima se llevará a cabo utilizando el alginato de

sodio con cloruro de calcio para poder atrapar la alfa-amilasa que será el
lecho del reactor enzimático.
Para monitorear el proceso de hidrólisis enzimática del almidón se lleva a

cabo utilizando el espectrofotómetro UV-Visible y registrando la
absorbancia a 575 nm de la solución que sale del reactor, obteniendo así
la concentración del almidón a la salida del reactor. Para esto se necesita
tener una curva de calibración la cual se hace preparando soluciones
conocidas de almidón y leyendo las absorbancias y de esta manera
obtener la concentración del almidón en función de la absorbancia.
El proceso de hidrólisis se lleva a cabo en un reactor de vidrio,

enchaquetado, y empacado con la alfa-amilasa inmovilizada y haciendo
fluir a través de este reactor la solución de almidón que a la entrada del
reactor la concentración es conocida y a la salida se hace el monitoreo
respectivo. Este proceso de hidrólisis se lleva a cabo a pH = 7,0 y a
diferentes flujos de alimentación de almidón y a diferentes
concentraciones de almidón y diferentes temperaturas.
Los procedimientos para preparar las soluciones necesarias para llevar a

cabo la parte experimental, se detallan a continuación:
3.5.1. PREPARACIÓN DE DISOLUCIÓN DE I2 – KI (DISOLUCIÓN MADRE)

 Pesar 10 g de I2 y 100 g de KI
 Disolver los 100 g de KI en aprox. 800 ml de agua destilada
 Añadir los 10 g de I2 y continuar agitando hasta disolución completa
 Enrasar a 1 l con agua destilada
 Etiquetar como: Disolución madre, 1% I2 – 10% KI en p/v
 Conservar en envase de vidrio topacio en refrigeración.
74
3.5.2. PREPARACIÓN DE LA DISOLUCIÓN TAMPÓN FOSFATO 0.1M

Para 1 l de tampón fosfato 0,1M:
A: Disolver 3,042 g de NaH2PO4·2H2O hasta 100 ml de agua destilada
B: Disolver 8,442 g de Na2HPO4·7H2O hasta 100 ml de agua destilada
En una fiola de 1 l, juntar A y B y luego enrasar hasta 1000 ml de agua
destilada (pH = 7,02)
3.5.3. PREPARACIÓN DE DISOLUCIÓN DE ALMIDÓN, USANDO COMO

DILUYENTE LA SOLUCIÓN TAMPÓN
Disolución de almidón al 0,1% (p/v):
 Pesar 1 g de almidón; diluirlo hasta 250 ml con disolución tampón
 Calentar hasta ebullición otros 750 ml de disolución tampón
 Añadir la disolución de almidón sobre la disolución en ebullición y
dejar hervir durante 3 minutos
 Enfriar con agua hasta temperatura ambiente y enrasar hasta 1 000
ml con agua destilada.

 Pesar 3 g de almidón, diluirlo hasta 250 ml con disolución tampón

 Pesar 5 g de almidón; diluirlo hasta 250 ml con disolución tampón
75
3.5.4. PREPARACIÓN DE LA ENZIMA INMOVILIZADA

 Fiola A: disolver 5 g de CaCl2 hasta 100 ml de agua destilada (5%
p/v)
 Fiola B: disolver 1 g de enzima hasta 100 ml de agua destilada
 En la fiola B, añadir 2 g de alginato y homogenizar rápidamente (2%
p/v)
 De la fiola B, recoger con una jeringa de vidrio, rápidamente
 Hacer gotear la mezcla enzima-alginato, contenido en la jeringa,
sobre la solución de CaCl2
 Dejar reposar los pellets (beats) producidos en la solución de CaCl2,
durante 15 minutos
 Separar los beats por filtración (colador)
 Lavar con agua destilada sobre un colador
3.5.5. SELECCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA DE MEDIDA

Para seleccionar la longitud de onda adecuada, se realiza, con un
espectrofotómetro UV-Visible, un barrido de longitudes de onda (entre
500 a 700 nm) de la disolución de almidón y se elegirá como longitud de
onda óptima la correspondiente a la máxima absorbancia. Además se
realizará el barrido para diferentes concentraciones de almidón en la
solución, tal como se detalla en la siguiente tabla:
Tabla 9. Preparación de muestras para selección de longitud de onda

Almidón de Tampón H2O Concentración
0,2%I2 – 2%KI
Nº 1 g/l fosfato 0,1M destilada de almidón
(ml)
(ml) (ml) (ml) (g/l)
B 0,0 2,5 1,0 46,5 0,000
1 0,2 2,3 1,0 46,5 0,004
2 1,0 1,5 1,0 46,5 0,020
3 1,6 0,9 1,0 46,5 0,032
4 2,2 0,3 1,0 46,5 0,044

76
3.5.6. CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN

La curva de calibración del método se obtiene preparando disoluciones
de almidón de concentraciones comprendidas entre 0,004 g/l y 0,044 g/l.
En estas concentraciones el método yodométrico cumple con la ley de
Lambert Beer. Las disoluciones se prepararon del siguiente modo:
 Preparar 1 l de solución de almidón 1 g/l. Pesar 1 g de almidón y
disolver hasta 1 l con la solución tampón fosfato 0,1M.
 Preparar 100 ml de disolución 0,2% I2 – 2% KI. Coger 20 ml de la
disolución madre, preparada inicialmente, y diluirlo hasta 100 ml con
agua destilada.
 En 12 fiolas de 50 ml, añadir según se indica en la tabla 9.
 Transcurridos 10 minutos medir la absorbancia a 575 nm en el
espectrofotómetro.
 Nótese que la medida se realiza frente a un blanco. El blanco es la
primera fiola, es decir cuando la concentración de almidón es 0,0 g/l.
Esta fiola solo contiene I2 – KI, agua destilada y tampón, tal como se
muestra en la tabla 10.
Tabla 10. Preparación de muestras para recta patrón

Almidón de Tampón H2O
0,2%I2 – 2%KI Concentración
1 g/l fosfato 0,1M destilada
(ml) de almidón (g/l)
(ml) (ml) (ml)
0,0 2,5 1,0 46,5 0,000
0,2 2,3 1,0 46,5 0,004
0,4 2,1 1,0 46,5 0,008
0,6 1,9 1,0 46,5 0,012
0,8 1,7 1,0 46,5 0,016
1,0 1,5 1,0 46,5 0,020
1,2 1,3 1,0 46,5 0,024
1,4 1,1 1,0 46,5 0,028
1,6 0,9 1,0 46,5 0,032
1,8 0,7 1,0 46,5 0,036
2,0 0,5 1,0 46,5 0,040
2,2 0,3 1,0 46,5 0,044
77
3.5.7. EXPERIMENTOS DE HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA EN UN REACTOR DE

LECHO EMPACADO CON ALFA AMILASA INMOVILIZADA
La Hidrólisis enzimática se realiza en un reactor con α-amilasa como
lecho fijo y se monitorea las concentraciones de salida para distintos
flujos de alimentación, y distintas temperaturas, tal como indica el diseño
experimental realizado. El esquema del equipo a utilizar es el siguiente:
T1 EI
BT VC
Figura 27. Esquema de la instalación del reactor para hidrólisis enzimática
Donde: T1: Tanque de disolución de almidón

P: Tanque de producto hidrolizado
R: Reactor de lecho fijo enchaquetado
EI: Enzima inmovilizada
VC: Válvula de control de flujo de alimentación
3.5.7.1. CARACTERÍSTICAS DE LA ENZIMA INMOVILIZADA

La cantidad de pellets se obtiene, haciendo un conteo sobre una
placa de vidrio; el diámetro promedio se consigue con la ayuda de un
vernier; El peso total de pellets se realiza con una balanza analítica;
el volumen y la densidad se calcula con la ayuda de una probeta y
utilizando el método de desplazamiento de líquidos.
78
3.5.7.2. CARACTERÍSTICAS DEL REACTOR EMPACADO CON LA

ENZIMA INMOVILIZADA
El diámetro y la altura se obtienen con la ayuda de un vernier y el
volumen de lecho empacado y el volumen total de reactor se calculan
con los datos anteriores usando fórmulas geométricas.
3.5.7.3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PARA LA HIDRÓLISIS

ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN
El procedimiento experimental tiene la siguiente secuencia de
trabajo:
 Cargar el reactor con la enzima inmovilizada de tal manera que
quede uniformemente distribuido dentro de este.
 Cargar el tanque de disolución de almidón que se va ha hidrolizar
en el tanque T1.
 Dejar ingresar la solución de almidón al reactor e inundar el lecho
empacado.
 Encender el baño termostático y programar la temperatura de
trabajo
 Una vez que la temperatura se mantiene constante abrir la válvula
V y dejar que fluya la solución de almidón.
 Dejar pasar un volumen que sea aproximadamente 10 veces el
volumen del reactor, para poder empezar a medir la absorbancia
del fluido que sale del reactor. Mientras esto sucede, ajustar el
caudal según lo requerido con la válvula V y con la ayuda de un
cronómetro y una probeta.
 Cuando el reactor está trabajando a un caudal constante retirar
muestras cada 20 ml y medir su absorbancia con un
espectrofotómetro UV-Visible a una longitud de onda de 575 nm.
 Para hacer la medición de absorbancia, puede ser necesaria la
dilución para estar en el rango de la curva de calibración.
 El procedimiento es similar para las otras condiciones.
79
3.6. DISEÑO EXPERIMENTAL

El diseño experimental es el diseño factorial multinivel, con 12 ejecuciones
o pruebas experimentales, con un error de 4 grados de libertad, con el
orden de experimentos no aleatorizado. Esto se realiza con la ayuda del
Programa estadístico para diseño de experimentos, el Statgraphics 5.1.
Los valores de los factores se han elegido en base a referencias de

investigaciones realizadas en procesos similares al presente trabajo de
investigación y que ya se han comentado en la parte de antecedentes del
presente trabajo.
El flujo de alimentación se evaluará en el rango de 100 ml/h a 500 ml/h; la

Temperatura se evaluará en el rango de 30 °C a 50 °C y la concentración
de almidón al ingreso del reactor se evaluará en el rango de 1 g/l a 5 g/l.
El diseño factorial completo y multinivel muestra cuántos experimentos y

qué experimentos realizar, como mínimo, de tal manera que sea confiable
y tenga en cuenta los errores que suceden en este tipo de procedimientos.
El diseño Factorial se muestra a continuación:
Tabla 11. Factores o variables del Proceso

Factores Bajo Alto Niveles Unidades
Flujo de Alimentación 100,0 500,0 3 Ml/h
Temperatura 30,0 50,0 2 ºC

Concentración inicial de
1,0 5,0 2 g/l
almidón
Respuestas Unidades
Conversión %
El pH se mantiene constante, en un valor de pH = 7,0

80
Tabla 12. Diseño de Experimentos, Factorial Multinivel

Flujo de Concentración
Experimento Temperatura Conversión
alimentación inicial de
Nº (ºC) (%)
(ml/h) almidón (g/l)
1 100 30 1,0
2 300 30 1,0
3 500 30 1,0
4 100 50 1,0
5 300 50 1,0
6 500 50 1,0
7 100 30 5,0
8 300 30 5,0
9 500 30 5,0
10 100 50 5,0
11 300 50 5,0
12 500 50 5,0
81
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La parte experimental se ha desarrollado de acuerdo a la metodología

propuesta y los resultados obtenidos han sido registrados y procesados tal
como se muestra en a continuación:
4.1. CARACTERÍSTICAS DE LA ENZIMA INMOVILIZADA

Antes de cargar las enzimas inmovilizadas (pellets) al interior del reactor
se registraron las siguientes características:
 Cantidad de pellets = 100 unidades
 Diámetro promedio = 5 mm
 Peso total de pellets = 11,9322 g
 Volumen ocupado por los 100 pellets = 11 ml
 Densidad de los pellets = 1,0847 g/ml
4.2. CARACTERÍSTICAS DEL REACTOR EMPACADO CON LA ENZIMA

INMOVILIZADA
Luego de cargar las enzimas inmovilizadas (pellets) al reactor, se
registraron las siguientes características del reactor empacado:
 Diámetro interno de la columna = 9 mm
 Altura de lecho empacado = 17 cm
 Volumen de lecho empacado = 10,81 cm3
 Volumen total de reactor = 12 cm3
4.3. SELECCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA DE MEDIDA

Para la selección de la longitud de onda, se ha registrado las lecturas de
absorbancia, para diferentes concentraciones de almidón, en el rango de
500 a 700 nm. A continuación se muestra el barrido de longitudes de
onda cada 15 nm, los cuales se han extraído del barrido realizado cada
3 nm:
82
Tabla 13. Barrido de Longitudes de Onda

Absorbancia
Longitud
Para 0,004 Para 0,020 Para 0,032 Para 0,044
de Onda
g/l de g/l de g/l de g/l de
(nm)
almidón almidón almidón almidón
500 0,051 0,265 0,438 0,622
515 0,056 0,284 0,470 0,667
530 0,061 0,302 0,500 0,708
545 0,067 0,325 0,537 0,760
560 0,071 0,341 0,563 0,795
575 0,073 0,349 0,577 0,814
590 0,073 0,348 0,576 0,813
600 0,072 0,343 0,568 0,801
615 0,068 0,331 0,549 0,774
630 0,065 0,317 0,527 0,744
645 0,061 0,303 0,506 0,714
660 0,057 0,287 0,479 0,678
675 0,052 0,271 0,455 0,645
690 0,047 0,254 0,426 0,605
699 0,044 0,242 0,408 0,580
0,004g/l 0,020g/l 0,032g/l 0,044g/l
0,9
0,8
0,7
Absorbancia
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
500 525 550 575 600 625 650 675 700
Longitud de onda (nm)
Figura 28. Barrido de Longitud de Onda

83
En la tabla 13 y la figura 28 se observa que, para distintas

concentraciones del almidón soluble utilizado, la máxima absorbancia se
sitúa entre los 550 a 600 nm. Por lo tanto se selecciona 575 nm como la
longitud óptima de medida para realizar el seguimiento de la variación de
la concentración de almidón en la hidrólisis enzimática.
La Ley de Lambert-Beer, en el metódo de análisis espectrofotométrico

UV-Visible, relaciona la absorbancia de una sustancia determinada en
función de su concentración y tiene la siguiente expresión:
A   CA (50)
Donde: A es la absorbancia
ε es el coeficiente de absortividad
ℓ es la longitud de la celda, ℓ = 1 cm
Al plotear los datos concentración en el eje x y los datos de absorbancia

en el eje y se obtiene una gráfica donde la pendiente es (ε)(ℓ).
En la tabla 14 se presenta las lecturas de absorbancia en función de la

concentración de almidón para diferentes longitudes de onda y su
correspondiente coeficiente de absortividad
Tabla 14. Coeficientes de absortividad para

diferentes longitudes de onda
CA (g/l) 500 nm 575 nm 675 nm

0,000 0,000 0,000 0,000
0,004 0,051 0,073 0,052
0,020 0,265 0,349 0,271
0,032 0,438 0,577 0,455
0,044 0,622 0,814 0,645
ε (lg-1cm-1) 14,076 18,381 14,613
84
Los coeficientes de absortividad se han obtenido luego de haber

realizado una regresión lineal de los datos de la tabla 14 y hallado la
pendiente tal como se muestra en la figura 29.
500 nm 575 nm 675 nm
0,9
0,8
0,7
A = 18,381C
Absorbancia
0,6
R2 = 0,9992
0,5 A = 14,613C
0,4 R2 = 0,9988
0,3 A = 14,076C
0,2 R2 = 0,999
0,1
0
-0,1 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
Concentración de almidón, g/l
Figura 29. Coeficiente de Absortividad para diferentes longitudes

de onda
La figura 29 demuestra que la longitud de onda óptima se da cuando el

coeficiente de absortividad es mayor; esto en la gráfica es representada
por la linea que tiene la mayor pendiente y corresponde a 575 nm.
Por lo tanto, se demuestra que para las condiciones de la presente

investigación, la longitud de onda para el seguimiento de la hidrólisis
enzimática las lecturas de absorbancia corresponde a 575 nm.
4.4. CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN

Para la construcción de la curva de calibración se ha registrado las
lecturas de absorbancia a 575 nm, con el espectrofotómetro UV-Visible,
para las 12 fiolas, tal como se muestra en la tabla 15.
Para obtener la curva de calibración se requiere la relación entre las dos

últimas columnas de la tabla 15 y estos se representan en la figura 30; en
ordenadas la absorbancia, frente a la concentración del almidón, g/l, en
abscisas.
85
Tabla 15. Lecturas de Absorbancia para curva de calibración

Almidón de Tampón H2O Concentración
0,2%I2 – 2%KI Absorbancia
1 g/l fosfato 0,1M destilada de almidón
(ml) (575 nm)
(ml) (ml) (ml) (g/l)
0,0 2,5 1,0 46,5 0,000 0,000
0,2 2,3 1,0 46,5 0,004 0,073
0,4 2,1 1,0 46,5 0,008 0,144
0,6 1,9 1,0 46,5 0,012 0,211
0,8 1,7 1,0 46,5 0,016 0,281
1,0 1,5 1,0 46,5 0,020 0,348
1,2 1,3 1,0 46,5 0,024 0,422
1,4 1,1 1,0 46,5 0,028 0,503
1,6 0,9 1,0 46,5 0,032 0,575
1,8 0,7 1,0 46,5 0,036 0,636
2,0 0,5 1,0 46,5 0,040 0,705
2,2 0,3 1,0 46,5 0,044 0,817
0,900
0,800
Absorbancia a 575 nm
0,700
A = 18,076CA
0,600
R2 = 0,9984
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0,000 0,004 0,008 0,012 0,016 0,020 0,024 0,028 0,032 0,036 0,040 0,044 0,048
Concentración de Almidón, (g/l)
Figura 30. Curva de Calibración
De la figura 28, se obtiene la ecuación ajustada para relacionar la

absorbancia con la concentración:
A = 18,076·CA (51)
Donde: A es la absorbancia
CA es la concentración del almidón en g/l
86
Relacionando las ecuaciones (50) y (51), se tiene:

18,076 18,076l / g
  18,076      18,076lg 1cm1 (52)
1cm
Luego el coeficiente de absortividad, a 575 nm, es:

  18, 076lg 1cm1 (53)
Este valor del coeficiente de absortividad es muy aproximado al valor

obtenido con el barrido de longitudes de onda que se presentó en la tabla
14, para 575 nm.
4.5. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA A 30 ºC y CAo = 1g/l

La hidrólisis enzimática a tres diferentes flujos de alimentación de una
solución de almidón de concentración CAo = 1 g/l y a una temperatura de
30 °C se ha llevado a cabo siguiendo el procedimiento descrito en la parte
experimental. Para calcular la concentración de almidón en la salida del
reactor se debe tener en cuenta el correspondiente factor de dilución.

distintos flujos de alimentación, habiendo diluido 50 veces.
Almidón Almidón
Flujo de hidrolizado hidrolizado
Almidón
Alimentación (g/l) (g/l)
Absorbancia sin hidrolizar
de almidón (sin tener en (teniendo en
(g/l)
(ml/h) cuenta la cuenta la
dilución) dilución)
INGRESO AL REACTOR:
0 0,357 0,020 1,000 0,000

SALIDA DEL REACTOR:
103,281 0,092 0,005 0,255 0,745
298,424 0,106 0,006 0,293 0,707
532,301 0,122 0,007 0,338 0,662

87
En la tabla 16 se muestra las lecturas de absorbancia y su

correspondiente concentración de almidón a la salida del reactor, también
se muestra la concentración de almidón sin hidrolizar.
La figura 31 muestra en barras las concentraciones de almidón sin

hidrolizar y el almidón hidrolizado a la salida del reactor. La primera barra
en el punto 0 es la concentración inicial de almidón que ingresa al reactor
y nos sirve de referencia para realizar comparaciones.
Concentración de almidon a la
1,200 Almidón (g/l) Hidrolizado (g/l)

salida del reactor (g/l)
1,000 0,000
0,800
0,707 0,662
0,600 0,745
1,000
0,400
0,200 0,338
0,255 0,293
0,000
0 103 298 532
Flujo de alimentación de A (ml/h)

CAo = 1 g/l
El análisis de la figura 31 conlleva a decir que a medida que aumenta el

flujo de alimentación del almidón a través del reactor enzimático,
disminuye la concentración de almidón hidrolizado a la salida del reactor,
esto porque mientras aumenta el flujo de alimentación de la solución de
almidón, disminuye el contacto que debe tener el almidón con la enzima
inmovilizada y por lo tanto no hay reacción enzimática eficiente. Pero con
un flujo menor sí se logra el suficiente contacto enzima sustrato y por ello
hay una mayor hidrólisis del almidón.
4.6. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA A 50 ºC y CAo = 1 g/l

88


Almidón Almidón
Almidón
(g/l)
INGRESO AL REACTOR:
0 0,357 0,020 1,000 0,000

SALIDA DEL REACTOR:
98,205 0,006 0,000 0,016 0,984
303,109 0,047 0,003 0,130 0,870
490,280 0,084 0,005 0,233 0,767

Concentración de almidón a la

1,000 0,000
0,800
0,600 0,767
0,870
1,000 0,984
0,400
0,200
0,233
0,130
0,000 0,016
0 98 303 490

CAo = 1 g/l
En la tabla 17 se presentan las lecturas de absorbancia y su

correspondiente concentración de almidón sin hidrolizar y almidón
hidrolizado a la salida del reactor.
89
La figura 32 muestra que, cuando ingresa al reactor una solución de

almidón con una concentración de 1 g/l y a 50 ºC, a medida que aumenta
el flujo de alimentación aumenta la cantidad de almidón sin hidrolizar y
que vuelve a salir del reactor; es decir que a menor flujo de alimentación
se obtiene una mayor hidrólisis del almidón. Esto nos confirma que la alfa
amilasa inmovilizada cataliza mejor la reacción de hidrólisis cuando tiene
el suficiente tiempo de contacto de su sitio activo con el almidón.


Almidón Almidón
Almidón
(g/l)
INGRESO AL REACTOR:
0 0,718 0,040 5,000 0,000

SALIDA DEL REACTOR:
99,823 0,345 0,019 2,389 2,611
300,205 0,486 0,027 3,359 1,641
501,308 0,627 0,035 4,333 0,667
La tabla 18 muestra las concentraciones de almidón sin hidrolizar y de

almidón hidrolizado a la salida del reactor, donde también se ha tenido en
cuenta las diluciones realizadas para las correspondientes lecturas de
absorbancia.
90

5,000 0,000
0,667
4,000 1,641
2,611
3,000
5,000
2,000 4,333
3,359
2,389
1,000
0,000
0 100 300 501

CAo = 5 g/l
La figura 33 representa en barras las concentraciones de almidón sin

hidrolizar y almidón hidrolizado para diferentes flujos, teniendo en cuenta
que la concentración inicial del almidón es 5 g/l. Se nota la influencia del
flujo de alimentación de almidón al reactor en el proceso de la hidrólisis
enzimática y se encuentra que un mayor flujo de alimentación representa
insuficiente contacto enzima – sustrato, y por ello hay almidón que solo
pasa por el reactor haciendo que el proceso de hidrólisis tenga un bajo
rendimiento.

En la tabla 19 se presenta las concentraciones de almidón a la salida del

reactor para distintos flujos de alimentación y con la figura 34 demuestra
que en un proceso de hidrólisis de almidón en un reactor empacado con
alfa amilasa inmovilizada, la hidrólisis es mayor cuando el flujo de
alimentación de solución de almidón es menor, debido a que en estas
91
condiciones la alfa amilasa inmovilizada al tener el suficiente contacto con

el polímero, puede romper más enlaces α(1-4) del almidón y obtener más
producto hidrolizado a la salida del reactor.

Almidón Almidón
Almidón
(g/l)
INGRESO AL REACTOR:
0 0,718 0,040 5,000 0,000

SALIDA DEL REACTOR:
105,323 0,142 0,008 0,984 4,016
312,434 0,184 0,010 1,270 3,730
510,381 0,223 0,012 1,544 3,456


5,000 0,000
4,000
3,730 3,456
3,000 4,016
5,000
2,000
1,000
1,270 1,544
0,984
0,000
0 105 312 510

CAo = 5 g/l
92
4.9. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN INICIAL DE ALMIDÓN

Para evaluar la influencia de la concentración inicial del almidón en el
proceso de hidrólisis enzimática, se ha trabajado con dos concentraciones
iniciales: 1 g/l y 5 g/l; ambos a diferentes temperaturas (30 ºC y 50 ºC).
Por criterios de comparación fue necesario trabajar con porcentajes de

conversión del almidón, con ayuda de la siguiente expresión:
C Ao  C A
%X A  x100 (54)
CA
Donde: %XA es el porcentaje de conversión de almidón en producto
hidrolizado; CAo es la concentración al ingreso del reactor y CA es la
concentración a la salida del reactor.

temperatura constante de 30 ºC.
(CAo = 1g/l y T = 30 ºC) (CAo = 5g/l y T = 30 ºC)
Flujo de A (ml/h)
%XA %XA
100 74,55 52,20
300 72,62 49,44
500 70,68 39,75
100 1g/l, 30 ºC 5g/l, 30 ºC

90
Almidón hidrolizado (%)
80 74,55 72,62 70,68

70
60 52,20 49,44
50
39,75
40
30
20
10
0
100 300 500

hidrólisis, a 30 ºC
93
En la tabla 20 se muestra los porcentajes de conversión obtenidos en dos

procesos de hidrólisis enzimática, ambos a 30 ºC y para tres flujos de
alimentación diferentes.
La figura 35 muestra que a cualquier flujo de alimentación de almidón,

dentro del rango trabajado, mayor porcentaje de almidón hidrolizado se
obtuvo cuando menor fue la concentración inicial de almidón que ingresó
al reactor. Si aumenta la concentración inicial de almidón que ingresa al
reactor disminuye el porcentaje de almidón hidrolizado, esto porque hay
un exceso de almidón el cual no va a reaccionar con la enzima y pasa a
través del reactor sin que llegue a hidrolizar.
Esto nos indica que la alfa amilasa inmovilizada, en un proceso de

hidrólisis a 30 ºC, cataliza la reacción enzimática con el almidón, sin
embargo puede ocurrir la saturación de la enzima debido al exceso de
almidón de la que puede catalizar.
Como la cantidad de enzima es limitada, a altas concentraciones de

sustrato toda la alfa amilasa inmovilizada está formando complejos con el
almidón y no podrá mejorarse la reacción enzimática poniendo más
almidón.
A bajas concentraciones de almidón, la adición de almidón aumenta la

cantidad del complejo enzima-sustrato, pero no llega a la saturación y la
alfa amilasa continua catalizando la reacción.
La alfa amilasa como las demás enzimas, tienen una actividad catalítica y
esta varia con la temperatura; por lo que fue necesario evaluar la hidrólisis
enzimática a 50 ºC para las mismas concentraciones iniciales de almidón,
1 g/l y 5 g/l.
En la tabla 21 se muestra los porcentajes de conversión obtenidos en dos

procesos de hidrólisis enzimática, ambos a 50 ºC y para tres flujos de
alimentación diferentes.
94

temperatura constante de 50 ºC.
Flujo de A (ml/h)
%XA %XA
100 98,29 80,47
300 92,75 77,71
500 87,22 74,94
120 1g/l, 50 ºC 5g/l, 50 ºC

98,29
100 92,75
87,22
80,47 77,71
80 74,94
60
40
20
0
100 300 500

hidrólisis, a 50 ºC
La figura 36 presenta la influencia de la concentración inicial de almidón

en el porcentaje de almidón hidrolizado. Los porcentajes de conversión
han aumentado respecto al proceso a 30 ºC, pero continúa
demostrándose que el aumento de la concentración inicial del almidón que
ingresa al reactor provoca la disminución del porcentaje de almidón
hidrolizado. La hidrólisis del almidón con la alfa amilasa ocurre debido a
que tanto la enzima como el sustrato reaccionan de manera
estequiométrica, como todas las reacciones bioquímicas; y la reacción es
aprovechada solo por el reactante en menor cantidad, en este caso la alfa
amilasa está actuando catalíticamente y en menor cantidad respecto al
almidón, pero debido al exceso de almidón el proceso de hidrólisis tiene
bajo rendimiento.
95
4.10. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA

La influencia de la Temperatura en el proceso de hidrólisis enzimática
del almidón se muestra en la tabla 22 y en la figura 37.
Tabla 22. Influencia de la temperatura, manteniendo constante C Ao = 1 g/L.

Flujo de A (ml/h)
%XA %XA
100 74,55 98,29
300 72,62 92,75
500 70,68 87,22
120 1g/L, 30ºC 1g/L, 50ºC

98,29
100 92,75
87,22
80 74,55 72,62 70,68
60
40
20
0
100 300 500
Figura 37. Influencia de la temperatura de hidrólisis, cuando C Ao = 1 g/l
La figura 37 refleja el comportamiento de la actividad enzimática de la

alfa amilasa con el cambio de temperatura. A una misma concentración
inicial de almidón, 1 g/l, a mayor temperatura mayor es el porcentaje de
almidón hidrolizado a la salida del reactor. Esto se cumple para cualquier
flujo de alimentación de almidón en el rango trabajado.
Si la temperatura de proceso de hidrólisis de almidón aumenta, de 30 ºC

a 50 ºC, entonces la conversión por hidrólisis aumenta en un promedio
de 20%, esto porque a una temperatura de 50 ºC, la enzima está en
mayor actividad de tal manera que hay una mayor eficiencia en la acción
de la enzima en el almidón para su hidrólisis.
96
La figura 37 refleja el comportamiento de la actividad enzimática de la

alfa amilasa con el cambio de temperatura. A una misma concentración
inicial de almidón, 5 g/l, a mayor temperatura mayor es el porcentaje de
almidón hidrolizado a la salida del reactor. Esto se cumple para cualquier
flujo de alimentación de almidón en el rango trabajado.
Tabla 23. Influencia de la temperatura, manteniendo constante la

concentración inicial, CAo = 5 g/l.
Flujo de A (ml/h)
%XA %XA
100 52,20 80,47
300 49,44 77,71
500 39,75 74,94
5g/l, 30 ºC 5g/l, 50 ºC
90
80,47
77,71 74,94
80
70
60 52,20 49,44
50
39,75
40
30
20
10
0
100 300 500
Figura 38. Influencia de la temperatura de hidrólisis, cuando C Ao = 5 g/l
La figura 38, confirma que la temperatura es directamente proporcional

al porcentaje de almidón hidrolizado. Si la temperatura de proceso de
hidrólisis de almidón aumenta de 30 ºC a 50 ºC, entonces la conversión
por hidrólisis aumenta en un promedio de 30%, esto porque a una
temperatura de 50 ºC, la enzima tiene mayor actividad enzimática de tal
manera que hay una mayor eficiencia en la acción de la enzima en el
almidón para su hidrólisis.
97
4.11. EVALUACIÓN COMPARATIVA DEL EFECTO DE LA

CONCENTRACION INICIAL DE ALMIDÓN, EL FLUJO DE
ALIMENTACIÓN Y LA TEMPERATURA SOBRE EL PORCENTAJE DE
ALMIDÓN HIDROLIZADO
Para comparar y dar conformidad a los resultados discutidos en los
puntos anteriores se presenta la tabla 24, en la que se hace un resumen
de los factores que influyen en el porcentaje de almidón hidrolizado
obtenido en la hidrólisis con alfa amilasa inmovilizada del almidón, en un
reactor empacado.
Tabla 24. Conversión del almidón, para distintos flujos de

alimentación, distintas concentraciones iniciales y diferentes
temperaturas
(CAo = 1g/l y (CAo = 1g/l y (CAo = 5g/l y (CAo = 5g/l y
Flujo de A
T = 30 ºC) T = 50 ºC) T = 30 ºC) T = 50 ºC)
(ml/h)
%XA %XA %XA %XA
100 74,55 98,29 52,20 80,47
300 72,62 92,75 49,44 77,71
500 70,68 87,22 39,75 74,94
120 1g/l, 30 ºC 5g/l, 30 ºC 1g/l, 50 ºC 5g/l, 50 ºC

98,29
100 92,75
87,22
80,47 77,71
80 74,55 72,62 74,94
70,68
60 52,20 49,44
39,75
40
20
0
100 300 500
Figura 39. Influencia de la Concentración inicial de almidón, el flujo

de alimentación y la temperatura en el porcentaje de almidón
hidrolizado
98
Un resumen de los resultados mostrados en las figuras 35, 36, 37 y 38

se presenta en la figura 39, la cual es de utilidad para una evaluación
comparativa de los efectos de las tres variables independientes de la
parte experimental del presente trabajo de investigación.
Este resumen de resultados demuestra que en un proceso de hidrólisis

de una solución de almidón en un reactor empacado con alfa amilasa
inmovilizada, se cumple que:
1. A una misma temperatura, con menor flujo de alimentación de

solución de almidón, se obtiene mayor porcentaje de almidón
hidrolizado; esto porque se permite mayor tiempo de contacto enzima
– sustrato y la reacción de hidrólisis se ve favorecida.
2. A una misma temperatura, con menor concentración inicial de

almidón a la entrada al reactor, se obtiene mayor porcentaje de
almidón hidrolizado; esto porque se evita la saturación de la enzima.
3. A mayor temperatura se obtiene mayor porcentaje de almidón

hidrolizado, pero solo en el intervalo que la enzima es estable, por
que al seguir aumentando la temperatura las enzimas se
desnaturalizan.
4. El porcentaje de almidón hidrolizado es inversamente proporcional

con el flujo de alimentación y con la concentración inicial de la
solución de almidón y es directamente proporcional con la
temperatura de proceso de hidrólisis.
5. Para lograr mayor porcentaje de almidón hidrolizado se debe trabajar

con bajo flujo de alimentación (100 ml/h), baja concentración de
almidón (1 g/l) y moderada temperatura (50 ºC)
99
4.12. DETERMINACIÓN DE LA CONSTANTE DE MICHAELIS – MENTEN

La constante de Michaelis – Menten se ha calculado ordenando los
resultados presentados en los puntos anteriores y adecuando a la
expresión matemática según la ecuación (40), donde la pendiente es la
constante K3 y la intersección con la ordenada es la Constante de
Michaelis – Menten.

(CAo = 1 g/l y T = 30 ºC)
t C Ao  C A
C Eo
C Ao CA
Flujo (ml/h) CA ln ln o
CA CA
X1 Y1
100,000 0,255 0,732 0,545
300,000 0,293 0,814 0,576
500,000 0,338 0,922 0,610
0,620
0,610
0,600
0,590
y = 0,3412x + 0,2964
0,580 R2 = 0,9982
Y1
0,570
0,560
0,550
0,540
0,700 0,750 0,800 0,850 0,900 0,950
X1
Figura 40. Curva para hallar CM, cuando CAo = 1 g/l y T = 30 ºC
De la figura 40: k3  0,3412 s 1 CM  0, 2964 g / l

100

(CAo = 1 g/l y T = 50 ºC)
t C Ao  C A
C Eo
C Ao CA
CA CA
X2 Y2
100 0,016 0,242 0,238
300 0,130 0,489 0,426
500 0,233 0,687 0,527
0,600
0,500
0,400
y = 0,6531x + 0,0882
0,300
Y2
R2 = 0,9884
0,200
0,100
0,000
0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800
X2
De la figura 41: k3  0, 653 s 1 CM  0, 088 g / l

101

(CAo = 5 g/l y T = 30 ºC)
t C Ao  C A
C Eo
C Ao CA
CA CA
X3 Y3
100 2,389 1,354 3,535
300 3,359 2,514 4,125
500 4,333 6,979 4,658
5,000
4,500
4,000
y = 0,1773x + 3,4653
3,500
R2 = 0,8783
3,000
2,500
Y3
2,000
1,500
1,000
0,500
0,000
0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 7,000 8,000
X3

102

(CAo = 5 g/l y T = 50 ºC)
t C Ao  C A
C Eo
C Ao CA
CA CA
X4 Y4
100 0,984 0,615 2,470
300 1,270 0,730 2,722
500 1,544 0,851 2,941
0
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2
-2
Y4
-4
y = 1,9937x + 1,2518
-6
R2 = 0,9969
-8
-10
X4

103
4.13. CONSTANTE DE MICHAELIS – MENTEN (CM) A DIFERENTES

CONDICIONES DE CAo Y TEMPERATURA
La constante de Michaelis – Menten indica la concentración de sustrato
a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima,
además indica la afinidad de la enzima por el sustrato. Valores bajos de
CM indican que el complejo ES está unido muy fuertemente y raramente
se disocia sin que el sustrato reaccione para dar producto, también se
puede decir que CM es la medida de la concentración de sustrato
necesaria para que se produzca una catálisis eficaz.
Tabla 29. Resumen de resultados de determinación de la constante

de Michaelis – Menten para diferentes condiciones de temperatura y
concentración inicial.
CAo (g/l) T (ºC) CM (g/l) k3 (s-1)
1 30 0,296 0,341
1 50 0,088 0,653
5 30 3,465 0,177
5 50 1,251 1,993
5,0000
4,0000
3,4650
3,0000
CM (g/l)
2,0000
1,2510
1,0000
0,2964
0,0880
0,0000
1g/l, 30 ºC 1g/l, 50 ºC 5g/l, 30 ºC 5g/l, 50 ºC
CAo, T
Figura 44. CM a diferentes CAo y diferentes T

104
Según se observa en la figura 44, la constante CM varía con la variación

de la temperatura y con la variación de la concentración inicial de
sustrato (almidón). Se puede distinguir que la mayor afinidad de la
enzima por el sustrato se obtiene cuando la concentración CAo es menor
y cuando la temperatura es mayor.
No necesariamente la CM más baja es la mejor, pues se debe tener en

cuenta que a mayor afinidad de la enzima por el sustrato, también se
puede saturar la enzima, entonces se debe encontrar el proceso en el
cual la CM debe ser lo más baja posible pero sin llegar a la saturación.
Es decir se debe tener en cuenta también la conversión lograda en el
proceso de hidrólisis enzimática.
Las figuras 39 y 44, coinciden en demostrar que a un mismo flujo de

alimentación de almidón al reactor (por ejemplo a 100 ml/h), el mayor
porcentaje de almidón hidrolizado (98,29%), se alcanza cuando la
concentración inicial de almidón es menor (1 g/l), cuando la temperatura
es mayor (50 ºC) y cuando la constante de Michaelis – Menten es menor
(0,088 g/l).
Las mismas figuras citadas en el párrafo anterior demuestran que a un

mismo flujo de alimentación de almidón al reactor (por ejemplo a 500
ml/h), el menor porcentaje de almidón hidrolizado (39,75%), se alcanza
cuando la concentración inicial de almidón es mayor (5 g/l), cuando la
temperatura es menor (30 ºC) y cuando la constante de Michaelis –
Menten es mayor (3,4650 g/l).
4.14. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD Y ORDEN DE REACCIÓN

La velocidad y el orden de reacción se hallaron teniendo en cuenta las
siguientes expresiones de cinética de reacciones:
k3CEoC A
rA  rR  (55)
CM  C A
rA  rR  kC An  ln(rA )  ln k  n ln C A (56)

105
Donde: -rA es la velocidad de desaparición del almidón

CEo es la concentración inicial de enzima, 5 g/l
CA es la concentración de almidón a la salida del reactor
CM es la constante de Michaelis – Menten.
k es la constante de velocidad de reacción
n es el orden de reacción.
Con ayuda de la tabla 29 y con las ecuaciones (55) y (56), se presentan

los siguientes resultados:
Tabla 30. Datos para graficar curva para hallar constante de

velocidad y orden de reacción (C Ao = 1 g/l y T = 30 ºC)
CA (-rA) ln(CA) ln(-rA)
0,255 0,789 -1,366 -0,237
0,293 0,848 -1,228 -0,165
0,338 0,909 -1,084 -0,095
0,00
-0,05
ln(-rA) = 0,502 lnCA + 0,450
R2 = 1,000
-0,10
ln (-rA)
-0,15
-0,20
-0,25
-1,40 -1,35 -1,30 -1,25 -1,20 -1,15 -1,10 -1,05 -1,00
ln CA
Figura 45. Velocidad y orden de reacción, cuando C Ao = 1 g/l y T = 30 ºC
De la figura 45: ln k  0, 450  k  1,568 y n  0,502
Luego la velocidad de reacción es: rA  1,568C A0,502

106


0,016 0,506 -4,125 -0,680
0,130 1,944 -2,044 0,665
0,233 2,370 -1,456 0,863
1,20
1,00
ln(-rA) = 0,596 lnCA + 1,798
0,80
R2 = 0,991
0,60
0,40
ln (-rA)
0,20
0,00
-0,20
-0,40
-0,60
-0,80
-4,50 -4,00 -3,50 -3,00 -2,50 -2,00 -1,50 -1,00 -0,50
ln CA
De la figura 46: ln k  1,798  k  6,038 y n  0,596
Luego la velocidad de reacción es: rA  6, 038C A0,596

107

2,389 0,361 0,871 -1,018

3,359 0,436 1,212 -0,831
4,333 0,492 1,466 -0,710
0,000
-0,200
-0,400
ln (-rA)
ln(-rA) = 0,520 lnCA - 1,468

-0,600
R2 = 0,998
-0,800
-1,000
-1,200
0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60
ln CA
De la figura 47: ln k  1, 468  k  0, 230 y n  0,520
Luego la velocidad de reacción es:  rA  0, 230C A0,520

108

0,984 4,387 -0,016 1,479

1,270 5,021 0,239 1,614
1,544 5,505 0,434 1,706
1,750
1,700
1,650
ln (-rA)
1,600
ln(-rA) = 0,5049 lnCA + 1,4886
1,550 R2 = 0,999
1,500
1,450
-0,10 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
ln CA
Figura 48. Velocidad y orden de reacción, cuando CAo = 5 g/l y T =

50 ºC
De la figura 48: ln k  1, 488  k  4, 428 y n  0,504
Luego la velocidad de reacción es:  rA  4, 428C A0,504

109
Tabla 34. Resumen de los resultados de velocidad y orden de reacción.

Constante de Orden de Expresión de
CAo T
velocidad de reacción reacción velocidad de
(g/l) (ºC)
k n reacción
1 30 1,568 0,502 rA1  1,568C A0,502
1 50 6,038 0,596  rA 2  6, 038C A0,596
5 30 0,230 0,520  rA3  0, 230C A0,520
5 50 4,428 0,504  rA 4  4, 428C A0,504
1 g/l, 30 ºC 5 g/l, 30 ºC
1,800
1,600
1,400
1,200
(-rA)
1,000
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200
Concentración de almidón, (g/l)

concentraciones iniciales
1 g/l, 50 ºC 5 g/l, 50 ºC
7,000
6,000
5,000
4,000
(-rA)
3,000
2,000
1,000
0,000
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200
Concentración de almidón, (g/l)

concentraciones iniciales
110
Las figuras 49 y 50, demuestran que a una misma temperatura, cuando

menor es la concentración inicial de almidón mayor es la velocidad de
reacción y cuando mayor es la concentración inicial de almidón menor es
la velocidad de reacción.
4.15. ENERGÍA DE ACTIVACIÓN

La Energía de Activación se halló según la ecuación de Arrheniuss, tal
como se muestra en la ecuación (9):
Tabla 35. Datos para hallar Energía de Activación, cuando C Ao = 1

g/l para diferentes temperaturas.
T (ºC) T (ºK) k 1/T ln k
30 303,150 1,568 0,003299 0,450

50 323,150 6,038 0,003095 1,798
2,00
1,80
1,60
1,40
lnk = -6604,03/T + 22,23
1,20
ln k
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
3,05E-03 3,10E-03 3,15E-03 3,20E-03 3,25E-03 3,30E-03 3,35E-03
1/T
Figura 51. Curva para hallar Energía de Activación, C Ao = 1 g/l
6604, 03
De la figura 51: ln k  22, 23 
T
De donde: ln A  22, 23  A  4,5 x109
Ea J
 6604, 03  Ea  794,33
R mol
111
Tabla 36. Datos para hallar Energía de Activación, cuando C Ao = 5

g/L para diferentes temperaturas.
T (ºC) T (K) k 1/T ln k
30 303,15 0,230 0,003299 -1,470

50 323,15 4,428 0,003095 1,488
2,00
1,50
1,00
0,50 lnk = -14486,87/T + 46,32

ln k
0,00
-0,50
-1,00
-1,50
-2,00
3,05E-03 3,10E-03 3,15E-03 3,20E-03 3,25E-03 3,30E-03 3,35E-03
1/T
Figura 52. Curva para hallar Energía de Activación, C Ao = 5 g/l
14486,87
De la figura 52: ln k  46,32 
T
De donde: ln A  46,32  A  1,31x1020
Ea J
 14486,87  Ea  1742, 47
R mol
112
Según los experimentos realizados, se ha hallado dos valores de

energía de activación, para dos diferentes concentraciones iniciales de
almidón, 1 g/l y 5 g/l. En la figura 53 se muestra los resultados obtenidos.
Estos resultados demuestran que a menor concentración inicial (1 g/l), la
energía de activación es menor (794,33 J/mol) en comparación con la
energía de activación (1742,47 J/mol) que corresponde a una
concentración inicial mayor (5 g/l).
2000
1742,47
1800
1600
1400
Ea (J/mol)
1200
1000
794,33
800
600
400
200
0
1g/L 5g/L
CAo
Figura 53. Energía de Activación a diferentes C Ao
Para que ocurra la hidrólisis del almidón por acción de la alfa amilasa, es
necesaria una determinada cantidad de energía para que ocurra la
reacción enzimática, esta energía denominada energía de activación
debe ser lo más bajo posible.
113
En la tabla 37. Se da un resumen de los resultados obtenidos en el presente

trabajo de investigación; en la que se resalta las condiciones en las que se
logra el mayor porcentaje de hidrólisis del alimidón.
Tabla 37. Resumen de Resultados

F T CAo CM Ea
%X k n -rA
(ml/h) (ºC) (g/l) (g/l) (J/mol)
100 30 1 74,55
300 30 1 72,62 0,296 1,568 0,502 1,568C A0,502
500 30 1 70,68
794,33
100 50 1 98,29
300 50 1 92,75 0,088 6,038 0,596 6, 038C A0,596
500 50 1 87,22
100 30 5 52,20
300 30 5 49,44 3,465 0,230 0,520 0, 230C A0,520
500 30 5 39,75
1742,47
100 50 5 80,47
300 50 5 77,71 1,251 4,428 0,504 4, 428C A0,504
500 50 5 74,94
Donde:
F = Flujo de Alimentación de almidón
T = Temperatura del proceso de hidrólisis
CAo = Concentración Inicial de almidón
%X = Porcentaje de almidón hidrolizado
CM = Constante de Michaelis – Menten
k = Constante de velocidad de reacción
n = orden de reacción
-rA = velocidad de reacción
Ea = Energía de activación
114
4.16. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El análisis estadístico confirma la confiabilidad de los resultados
obtenidos en el presente trabajo de investigación. Para este análisis se
ha trabajado con la ayuda del software para análisis de experimentos,
Statgraphics 5.1, y luego de hacer el ingreso de datos correspondientes,
se tienen los siguientes resultados estadísticos:
4.16.1. EFECTOS ESTIMADOS PARA CONVERSIÓN POR HIDRÓLISIS

Los resultados de la influencia de los factores: flujo de alimentación,
temperatura y Concentración inicial en el porcentaje de almidón
hidrolizado, se ha estimado en función de cuanta significancia tienen
en el proceso de hidrólisis enzimática. En la tabla 38 se muestra el
análisis de varianza para la conversión.
Tabla 38. Análisis de la Varianza para Conversión

Fuente Suma de GL Cuadrado F-Ratio P-Valor
Cuadrados medio
A:Flujo de Alimentación 135,47 1 135,47 9,36 0,0156
B:Temperatura 1928,88 1 1928,88 133,21 0,0000
C:Concentración Inicial de 1232,21 1 1232,21 85,10 0,0000
almidón
Error Total 115,84 8 14,48
Total (corr.) 3412,40 11
R-cuadrado = 96,6054 %
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 95,3325 %
La tabla de Análisis de varianza divide la variabilidad en Conversión en

distintos segmentos separados para cada uno de los efectos. En este
caso, 2 de los efectos tienen los p-valores inferiores a 0,03, indicando
que son significativamente diferentes de cero al 97,0% de nivel de
confianza.
115
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo así ajustado explica el

96,6054% de la variabilidad en Conversión. El estadístico R-cuadrado
ajustado, el cual es más adecuado para la comparación de números
diferentes de variables independientes, es 95,3325%.
En la figura 54, se observa que el efecto de la temperatura en el

proceso de hidrólisis tiene un efecto directamente proporcional a la
conversión y el flujo de alimentación y la concentración inicial de
almidón son inversamente proporcionales a la conversión. Además se
muestra que los 3 factores tienen 3% de significancia.
+
B:Temperatura
-
C:Conc I nicial
A:Flujo
0 2 4 6 8 10 12
Efectos estandarizados
Figura 54. Gráfico de Pareto estandarizado para Conversión
89
84
% Conversión
79
74
69
64
59
100,0 500,0 30,0 50,0 1,0 5,0

Flujo Temperatura Conc Inicial
Figura 55. Gráfico de Efectos Principales para Conversión

116
En la figura 55 se observa más claramente el efecto de cada factor en

el proceso de hidrólisis; la temperatura es el único factor que influye de
manera directa en lograr una más alta conversión por hidrólisis
enzimática.
4.16.2. COEFICIENTE DE REGRESIÓN PARA LA CONVERSIÓN POR

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA
La ecuación del modelo ajustado es:
% X  43, 2108  0, 020575F  1, 26783T  5, 06667CAo
Donde: %X es el porcentaje de conversión por hidrólisis enzimática

F es el flujo de alimentación de almidón al reactor, en ml/h
T es la temperatura de proceso de hidrólisis, en ºC
CAo es la concentración inicial de almidón, en g/l
Tabla 39. Resultados de la Estimación para Conversión

Nº Observados Ajustados
1 74,55 74,1217
2 72,62 70,0067
3 70,68 65,8917
4 98,29 99,4783
5 92,75 95,3633
6 87,22 91,2483
7 52,20 53,8550
8 49,44 49,7400
9 39,75 45,6250
10 80,47 79,2117
11 77,71 75,0967
12 74,94 70,9817
En la tabla 39 se comparan los valores experimentales con los valores

obtenidos del modelo matemático ajustado, y de acuerdo con el
estadístico R, se observa que hay una aproximación del 96,6054% a
los datos experimentales en Conversión. Esto nos indica que el
117
modelo es confiable para pronosticar el porcentaje de conversión en el

proceso de hidrólisis enzimática dentro de las condiciones en las que
se ha trabajado.
4.16.3. SUPERFICIES DE RESPUESTA EN EL PROCESO DE HIDRÓLISIS.

El análisis de superficies de respuesta muestra la influencia de dos
factores cuantitativos en una variable de respuesta. En la figura 56 se
observa el efecto de los factores Flujo de alimentación y Temperatura
en el porcentaje de almidón hidrolizado, cuando se mantiene constante
la concentración inicial de almidón en 3 g/l. La superficie de respuesta
nos indica que el flujo de alimentación es inversamente proporcional a
la conversión y la temperatura es directamente proporcional a la
conversión.
55, 0-59,0
% Conversión
95 59, 0-63,0
85 63, 0-67,0
75 67, 0-71,0
65 71, 0-75,0
55 75, 0-79,0
0 79, 0-83,0
100 83, 0-87,0
200 50
46 87, 0-91,0
300 42
38 91, 0-95,0
400 34 Temperatura, ºC
Flujo de Al imentaci ón, ml /h 500 30
Figura 56. Superficie de Respuesta Estimada, Concentración

Inicial de almidón = 3 g/l
En la figura 57 se observa que el efecto de los factores Flujo de

alimentación y concentración inicial de almidón en el porcentaje de
almidón hidrolizado, cuando se mantiene constante la temperatura a
40 ºC. La superficie de respuesta indica que se puede lograr una
mayor conversión por hidrólisis enzimática cuando el flujo de
alimentación y la concentración inicial del almidón son bajos, teniendo
en cuenta que el flujo de alimentación es inversamente proporcional a
118
la conversión y la concentración inicial de almidón también es

inversamente proporcional a la conversión.
55, 0-59,0
98
59, 0-63,0
% Conversión 88 63, 0-67,0
67, 0-71,0
78
71, 0-75,0
68 75, 0-79,0
79, 0-83,0
58 83, 0-87,0
0 5
100 4 87, 0-91,0
200 2 3
300 1 91, 0-95,0
400
500 0 Concentración Ini ci al , g/l
Flujo de Al imentaci ón, ml /h
Figura 57. Superficie de Respuesta Estimada, Temperatura = 40 ºC
55, 0-59,0
% Conversión
109 59, 0-63,0

99
63, 0-67,0
89
79 67, 0-71,0
69 71, 0-75,0
59
49 75, 0-79,0
30 79, 0-83,0
34 83, 0-87,0
38 5
4 87, 0-91,0
42 3
2 91, 0-95,0
46 1
Temperatura, ºC Concentración Ini ci al , g/l 95, 0-99,0
50 0
Figura 58. Superficie de Respuesta Estimada, Flujo de

alimentación = 300 ml/h
En la figura 58 se observa que el efecto de la Temperatura es

directamente proporcional al porcentaje de conversión y la
concentración inicial de almidón es inversamente proporcional al
porcentaje de conversión por hidrólisis enzimática del almidón.
119
4.16.4. RESPUESTA OPTIMIZADA

Un valor óptimo de porcentaje de conversión, según el modelo
ajustado se obtiene cuando se cumplen los siguientes parámetros:
Tabla 40. Respuesta optimizada

Factor Inferior Mayor Optimo
Flujo de Alimentación 100,0 500,0 100,0
Temperatura 30,0 50,0 50,0
Concentración Inicial de almidón 1,0 5,0 1,0
Esta tabla muestra la combinación de niveles de factores que

maximiza el porcentaje de almidón hidrolizado enzimáticamente.
120
CONCLUSIONES
Las conclusiones a las que se ha llegado, en el presente Trabajo de

Investigación, son:
Primera
La cinética de hidrólisis del almidón en un reactor de flujo continuo con alfa
amilasa inmovilizada como lecho fijo y la velocidad de reacción cumple con la
siguiente ecuación:
rA  6, 038C A0,596
Siendo la constante de velocidad de la reacción, k = 6.038 y el orden de la

reacción, n = 0,596.
Segunda
La influencia de la temperatura es directamente proporcional a la conversión
por hidrólisis enzimática:
 A una T = 30 ºC se ha hidrolizado hasta X = 74,55%
 A una T = 50 ºC se ha hidrolizado hasta X = 98,29%
Tercera
La influencia del flujo de alimentación es inversamente proporcional a la
conversión por hidrólisis enzimática:
 A un F = 100 ml/h se ha hidrolizado hasta X = 98,29%
Cuarta
La influencia de la concentración inicial de almidón es inversamente
proporcional a la conversión por hidrólisis enzimática:
 A una CAo = 1 g/l se ha hidrolizado hasta X = 98,29%
 A una CAo = 5 g/l se ha hidrolizado hasta X = 80,47%
121
Quinta
Los parámetros óptimos para la obtención de un alto porcentaje de conversión,
X = 98,29%, son:
 Flujo de Alimentación = 100,0 ml/h
 Temperatura = 50,0 ºC
 Concentración Inicial de almidón = 1,0 g/l
Sexta
Para un proceso de hidrólisis enzimática con los parámetros óptimos se ha
determinado que la constante de Michaelis – Menten, CM = 0,088 g/l
Séptima
La energía de activación cuando CAo = 1 g/l es 794,33 J/mol.
Octava
El coeficiente de regresión para la conversión por hidrólisis enzimática es:
% X  43, 2108  0, 020575F  1, 26783T  5, 06667CAo
Donde: %X es el porcentaje de conversión por hidrólisis enzimática

F es el flujo de alimentación de almidón al reactor, en ml/h
T es la temperatura de proceso de hidrólisis, en ºC
CAo es la concentración inicial de almidón, en g/l
122
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN

“CINÉTICA DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL

TESIS PRESENTADO POR:

Mi más sincero agradecimiento:

A Dios, de quien siempre he recibido bendiciones para mi y para mi familia, por

A mis Padres y a toda mi familia, por su apoyo incondicional e invalorable

A mis amigos de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Nacional

En el presente trabajo de investigación se ha realizado la hidrólisis de almidón

Se ha trabajado en un reactor de vidrio de doble tubo; en su interior se ha

Se ha logrado una conversión de 98,29% cuando CAo = 1 g/l, T = 50 ºC y F =

También se ha realizado un análisis de los resultados experimentales con

considerando %X (porcentaje de conversión por hidrólisis enzimática), F (flujo

A conversion of 98,29% has been achieved when CAo = 1 g/l, T = 50 ºC and F =

2.3.2.4.1. INHIBIDORES DE α-AMILASA 42

4.11. EVALUACIÓN COMPARATIVA DEL EFECTO DE LA

REFERENCIA BIBLIOGRÁFÍCA 122

Tabla 23. Influencia de la temperatura, manteniendo constante la

ej., líneas trazadas tangencialmente a los valores experimentales a

Figura 40. Curva para hallar CM, cuando CAo = 1 g/l y T = 30 ºC 99

En el Perú, hay importante reserva y fuentes de materia prima que contiene

En la Tabla 1, se muestra datos oficiales hasta el año 2008 de la producción

Tabla 1. Producción Agropecuaria en el Perú de principales materias

El almidón es un polisacárido que se encuentra abundantemente en la

Puesto que la hidrólisis enzimática es un proceso donde ocurre reacción

Los biorreactores enzimáticos de lecho empacado tienen relleno de enzimas

A nivel de investigación experimental, se puede desarrollar métodos o

Además hacen notar que la hidrólisis enzimática en un reactor de lecho fijo

En el caso de la hidrólisis del almidón con alfa amilasa inmovilizada en proceso

Estos antecedentes conducen a proponer un trabajo de investigación sobre la

Son los principales compuestos químicos almacenadores de la energía

A su vez, mediante diversas rutas bioquímicas, éste azúcar da origen a

2.5.1. CLASIFICACIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS

Su clasificación se hizo de acuerdo con diversos criterios: estructura

Tabla 2. Clasificación de los carbohidratos más importantes

Pentosas Xilosa, arabinosa, ribosa, etc.

La glucosa es el monosacárido más abundante; se encuentra en

La fructosa se encuentra principalmente en los jugos de diversas

Figura 1. Representación de la α-D-glucopiranosa (dextrosa)

Figura 2. Representación de la β-D-fructofuranosa (levulosa)

Los monosacáridos tienen un grupo aldehído o una cetona y varios

En el área de los alimentos, los más importantes son los disacáridos

En general, los disacáridos se han dividido de acuerdo con su poder

Al igual que sucede con los polisacáridos, el organismo humano sólo

través de la pared intestinal para llegar a los sitios donde finalmente

La hidrólisis química de los enlaces glucosídicos de los

Figura 3. Estructura de la sacarosa (glucosa-fructosa)

Figura 4. Estructura de la maltosa (glucosa-glucosa)

No producen verdaderas soluciones, sino más bien dispersiones de

un promedio, puesto que las moléculas no son iguales y siempre

Se encuentran como cadenas lineales, o bien, ramificadas, que a su

Su nomenclatura se basa en la adición de la terminación “ana” a las

De acuerdo con su función biológica se han dividido en dos grandes

Los polisacáridos se encuentran en forma natural en muchos

Tabla 3. Características de los polisacáridos

Tanto el almidón como los productos de la hidrólisis del almidón

El almidón se diferencia de todos los demás carbohidratos en que en la

La capacidad de formar soluciones viscosas (capacidad espesante) es

Los gránulos de almidón son insolubles en agua fría, debido a la fuerza

Las temperaturas iniciales de gelatinización son características de cada

Los geles obtenidos tienen estructuras tridimensionales y porosas.

La composición de cada una de las dos fases depende principalmente

Debido a los cambios morfológicos que se producen durante la

Cuando se dejan en reposo durante unas horas, las disoluciones de