La Leishmania major causa la forma cutánea de la Leishmaniasis que afecta a 21 millones de

personas en los países en desarrollo. El uso excesivo de la quimioterapia en la leishmaniasis ha

dado lugar a la aparición de resistencia a los medicamentos en el parásito. Para superar esta
amenaza emergente hemos intentado atacar las moléculas de la superficie. El
glicosilfosfatidilinositol es una de esas moléculas que está presente en abundancia y, por lo
tanto, nuestro trabajo gira en torno a la enzima mannosiltransferasa (GPI14), una enzima
esencial para añadir manosa al glicosilfosfatidil. Ha sido objeto de descubrimiento de drogas
debido a la creciente resistencia a la miltefosina en L. major. El presente documento constituye
el primer intento de detectar el gen GPI14 en L. major apoyado con la modelización y el
análisis dinámico molecular de la estructura tridimensional completa del GPI14. El análisis de la
función reveló múltiples regiones transmembranales en el GPI14 y una estrecha relación
filogenética con las especies de Trypanosoma y Schistosoma mansoni con los valores más altos
de bootstrap. El modelo de proteína obtenido se sometió a minimización para la simulación de
14 ns. Ocho derivados del N-4 (-5(triflurometil)-1-metil-1H benzo[d]imidazol-2 yl)fenil)se
acoplaron al GPI14

2.2. Modelado molecular, análisis de secuencias

El supuesto GPI14 no muestra ninguna similitud compartida con las estructuras disponibles,
por lo que se empleó un método híbrido que incluye tres convenciones para el modelado de
estructuras, a saber, modelado comparativo, enhebrado y modelado ab initio, utilizando I
TASSER (Iterative Threading Assembly Refinement) (Royetal.,2010 )En resumen, la secuencia
de aminoácidos predicha por GPI 14 (UniProt Accession no : Q4Q791_LEIMA) es enhebrada a
través de la biblioteca del Banco de Datos de Proteínas (PDB) por el programa LOMETS (Local
Meta Threading-Server) (WuandZhang,2007) y los 5 fragmentos de residuos continuos
resultantes son eliminados de las alineaciones de LOMETS. Éstos se vuelven a ensamblar por
medio de la simulación de intercambio de réplicas Monte Carlo (MC), que se ocupa del
plegado de la proteína ab initio a través de un espacio conformacional restringido. Se evaluó la
energía libre mínima de la estructura sobre la base del campo de fuerza fisicoquímico en los
frascos de potencias hidrófilas, hidrofóbicas, estéricas y de enlace de hidrógeno. Por último, se
seleccionaron las estructuras de menor energía y se perfeccionaron mediante simulación de
dinámica molecular guiada por afragmentos (MD), con el fin de optimizar la red de unión de
hidrógeno y eliminar los choques estéricos. La estructura también se evaluó utilizando ProSA
(Análisis de Estructura de Proteínas) (https://prosa.services. came.sbg.ac.at/prosa.php)
(Wiederstein y Sippl,2007) por su integridad estructural tridimensional basada en potenciales
energéticos empíricos. El servidor devuelve una media de puntuación Z para la geometría de la
estructura en la que se puede confiar si la puntuación es alta. El gráfico de Ramachandran para
el GPI 14 se obtuvo utilizando el SAVS (Servidor de Análisis y Verificación Estructural)
(http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES/) también en la web (Luthyetal.,1992). Las regiones
transmembranas (TM) del GPI14 se predijeron utilizando el PREDTMR
algorithm(Pasquieretal.,1999) (http://athina.biol.uoa.gr/PRED-TMR/input.html). El servidor
PRED-TMR es de libre acceso y sólo requiere la secuencia de la proteína. Es comparable en
términos de precisión a los métodos de predicción más populares. La secuencia de
aminoácidos de GPI14 de 28 organismos (Tabla S1) se utilizó para el análisis filogenético
basado en la conservación del motivo DXD GPI 14. Los organismos se seleccionaron sobre la
base de la ortología de la secuencia de GPI14 con L. major recuperada de la base de datos de
ORTHOMCL (http://www.orthomcl.org/cgi bin/OrthoMclWeb.cgi). Se utilizó el método de la
Cadena de Monte Carlo Markov (MCMC) utilizando el software MrBayes (3.0) (Huelsenbeck y
Ronquist ,2001) para reconstruir el árbol filogenético que busca el par de vecinos con el
criterio de evolución mínima. La matriz de tasas de Poisson y la variación de la tasa se fijaron
en gamma (las categorías de gamma se fijaron en 4). Las cadenas calentadas se fijaron en 4,
mientras que la longitud de la MCMC era de 1100.000 y la frecuencia de submuestreo se fijó
en 200. La longitud de las cadenas calentadas fue de 100.000 y la temperatura de la cadena se
mantuvo en 0,2 1K. La semilla aleatoria fue de 10.349, la longitud de rama utilizada no estaba
limitada y el parámetro de forma era exponencial. La desviación estándar media de las
frecuencias de división fue inferior a 0,01.

2.3. Simulación MD

El modelo de homología del GPI 14 se utilizó como estructura de partida para la simulación del
MD. La minimización de la estructura de GPI 14 se logró usando GROMACS (GROningen
MAchine for Chemical Simulaciones) versión 4.0(Kerrigan,1997) instalado en 48 coresIntel
Procesador de Xeón HPC cluster con el campo de fuerza estándar GROMOS96 43a2 (Mejora de
los dihedrales alcánicos)(Berendsen etal.,1995). Se esbozan cuatro pasos en la simulación de
MD:

a) Optimización de la proteína: La proteína GPI 14 fue incrustada en una molécula de agua de

carga puntual simple (SPC216) (79493) en una caja de rejilla cúbica de células 34A 34A 34A.
Dado que el entorno in vivo es de naturaleza acuosa, la SPC se utilizó como molécula de agua
utilizando el algoritmo SETTLE (Miyamoto y Kollman,1992). La proteína GPI 14 tenía + 16
cargas que fueron neutralizadas añadiendo 16Cl (Cloro) como contra iones en el sistema de
entonces (Halling, 2000).

b) Minimización de la proteína: La mini- miento del sistema se encontró utilizando el algo-

ritmo más pronunciado (Arfken, 1985) y se utilizó el algoritmo LINCS para fijar los enlaces
químicos entre los átomos del GPI 14 (Hess etal.,1997).

La convergencia del sistema se logró minimizando la energía del disolvente por encima de 10
kcal/mol, tras lo cual se puso en marcha una fase de equilibrio para calentar gradualmente el
sistema de 0 a 300 K mediante la realización de condiciones isotérmicas no restringidas (NVT).

c) Simulación de MD: El esquema de acoplamiento de Brendsen se empleó para el conjunto de

NPT a una temperatura constante de 310 K de presión constante y una constante de
acoplamiento de 0,5 ps con una duración de 14 ns (Berendsen etal.,1984). Corto - las
interacciones de rango se fijaron a una distancia de corte de 12Å. Se aplicaron condiciones
límite periódicas en conjunción con la malla de partículas Ewald para tener en cuenta las
fuerzas electrostáticas en el sistema (Darden etal.,1993).

El modelo refinado simulado de la columna vertebral del GPI 14 fue analizado más a fondo por
la desviación cuadrada media de la raíz (RMSD) y la fluctuación cuadrada media de la raíz
(RMSF). Cada ejecución de la fase de producción tomó un promedio de 1332.237h. de tiempo
de pared en una computadora de alto rendimiento con procesador Intel Xeon de velocidad de
2.4 GHz.