RpoS integra las vías de señalización CRP, Fis y PhoP para controlar

la expresión de hlyE en Salmonella Typhi

SPI-18 es una isla de patogenicidad que se encuentra en un subconjunto de

serovares de S. enterica capaces de producir una enfermedad sistémica en
humanos, incluida S. Typhi; pero ausente en serovares generalistas como S.
Typhimurium. SPI-18 alberga solo dos ORF organizados en un operón, los genes
taiA - hlyE. TaiA es una nueva invasina implicada en el aumento de la fagocitosis
de la bacteria por los macrófagos. Por otro lado, HlyE (también llamada ClyA o
SheA) es una hemolisina bien caracterizada que se exporta a las vesículas de la
membrana externa.

RpoS participa como un regulador transcripcional positivo de hlyE en S. Typhi.

Además, el regulador global CRP regula negativamente la expresión de hlyE
durante el crecimiento exponencial. Sin embargo, no se tiene clara la manera en
que estos regulan bajo distintas condiciones ambientales, tales como temperatura,
osmolaridad o incluso el sustrato.

En el artículo leído se reportó que Fis participa como un regulador negativo

dependiente de glucosa independiente de CRP de hlyE en S. Typhi. Además, Fis y
CRP parecen ejercer la represión sobre hlyE a través de rpoS. Por otro lado, PhoP
regula la expresión de hlyE a través de rpoS en condiciones de pH bajo y Mg 2+
bajo. Por lo que se concluyó que RpoS es el regulador central en la red reguladora
hlyE, integrando múltiples señales ambientales.
Figura 1 Fis participa en la regulación negativa de la expresión de hlyE en S. Typhi.
A) RT-PCR para RNAm que examina la expresión del gen hlyE en S. Typhi (WT), Δcrp,
Δfis, doble mutante Δcrp Δfis y las cepas complementadas Δcrp pTCRP y Δfis pTFIS:
Se observó un aumento de la expresión estadisticamente significativo en las cepas
mutantes, por lo que se puede inferir que efectivamente CRP y Fis son reguladores
negativos de hlyE en S. Typhi. Sin embargo, al adicionar glucosa el efecto de CRP se
ve aliviado, mientras que el de Fis no.

B) Hemólisis relativa de la cepa WT y de las mutantes Δfis y Δcrp. Se puede observar

que la actividad hemolítica en las cepas mutantes es mucho mayor que en la cepa
silvestre, lo cual concuerda con los resultados de epresión genética, ya que al estar
involucrado hlyE en la actividad hemolítica al desreprimirse es lógico que de igual
forma aumente su actividad hemolítica.

C) Hemólisis relativa de la cepa WT y de las mutantes Δfis y Δcrp cultivados en LB +

glucosa al 0,4%. La hemólodis en la Δcrp disminuye hasta igualar a la silvestre,
mientras que la mutante Δfis sigue presentando un mayor efecto hemolítico,
concordando con los rsultados de expresión.
 D) Inmunodetección de HlyE: Se corrobora a nivel de la proteína que en las cepas
mutantes hay una mayor síntesis de HlyE, así como el aliviamiento de este efecto
en la mutante Δcrp en presencia de glucosa.

E) RT-PCR para la detección de niveles de transcripción fis en la cepa WT: Se

sospechaba que la adición de glucosa aumentaba la expresión de fis, siendo esto
corroborado al observar que a concentraciones crecientes de glucosa la expresión
de fis aiumentaba.

Figura 2. CRP y Fis participan en la represión de rpoS.

A. RT-PCR del gen rpoS de S. Typhi WT, Δcrp, Δfis, doble mutante Δcrp Δfis y las cepas
complementadas Δcrp pTCRP y Δfis pTFIS. La transcripción de rpoS aumentó en el
mutante Δcrp en comparación con la cepa WT. Sin embargo, este efecto se vió
aliviado en presencia de glucosa, siguiendo el mismo patrón que hlyE. Este
resultado sugiere que CRP participa como represor transcripcional de rpoS en S.
Typhi. Dado que rpoS está regulado en múltiples niveles.
B. Inmunodetección de RpoS. RpoS era prácticamente indetectable bajo las
condiciones probadas, de manera consistente con el hecho de que la acumulación
de RpoS se evita en la fase logarítmica. Por otro lado, la falta de CRP condujo a una
 evidente acumulación de RpoS, sugierendo que CRP es un represor de rpoS y en
presencia de glucosa, hay otro represor independiente de CRP.
C. Análisis de secuencia in silico de cajas de unión de CRP y Fis en promotor rpoS de S.
Typhi CT18. Las secuencias subrayadas segmentadas indican cuadros de CRP
putativos. Las secuencias subrayadas indican supuestos cuadros de Fis. El asterisco
muestra una región compartida de cada cuadro en la posición marcada. En negrita,
el sitio de inicio de la transcripción y las secuencias subrayadas cortas indican las
regiones promotoras -35 y -10 predichas.
D.
En conjunto, estos resultados sugieren que CRP y Fis son capaces de reprimir la expresión
de rpoS mediante unión directa, regulando así la expresión de hlyE en S. Typhi.

Figura 3. El sistema regulador de dos componentes PhoPQ participa en la inducción de

hlyE a través de rpoS.
A) RT-PCR del gen hlyE en S. Typhi WT, ΔrpoS, ΔphoPQ, la mutante doble ΔrpoS
ΔphoPQ, y las cepas complementadas ΔrpoS pBRPOS y ΔphoPQ pBPHOPQ a pH de
7 y 12. El pH 5.0 es una condición inductora de la expresión de hlyE. Sin embargo,
la expresión relativa de hlyE en la mutante ΔrpoS es casi cero, incluso a pH 5.0.
 Este resultado sugiere que rpoS es necesario para la inducción de la expresión de
hlyE a pH bajo, pero también para mantener una expresión basal de hlyE. Este
sugiere fuertemente que phoPQ no puede inducir la expresión de hlyE a pH bajo
cuando rpoS está ausente, siendo esto reforzado con los resultados de la doble
mutante. Por otro lado, la mutante ΔphoPQ muestra la mitad de la inducción a pH
5.0 en comparación con la cepa WT, lo que sugiere que rpoS, por sí mismo, es
suficiente para ejercer una inducción parcial a un pH bajo. Por lo tanto, tanto rpoS
como phoPQ son necesarios para lograr una inducción completa a pH bajo de hlyE
en S. Typhi. Sin embargo, la regulación positiva de phoPQ se produce a través de
RpoS.

B) RT-PCR del gen hlyE de S. Typhi WT, ΔrpoS, ΔphoPQ y la doble mutante ΔrpoS
ΔphoPQ a diferentes concentraciones de Mg 2+. La expresión relativa de hlyE en
ΔrpoS es casi cero bajo una concentración alta o baja de Mg2+, lo que respalda el
hecho de que rpoS es esencial para la expresión de hlyE en diferentes condiciones
de cultivo. Además, la inducción por debajo de 10 μM Mg 2+ es completamente
abolida en el mutante ΔphoPQ, lo que sugiere fuertemente que phoPQ es esencial
para aumentar la transcripción de hlyE a bajas concentraciones de Mg 2+. Además,
rpoS por sí solo no es suficiente para aumentar la transcripción hlyE en las mismas
condiciones de prueba.
Todos estos resultados juntos sugieren fuertemente que RpoS es esencial para la
transcripción de hlyE en todas las condiciones probadas. Por otro lado, phoPQ
participa en la inducción de hlyE a pH 5.0 y bajas concentraciones de Mg 2+ de una
manera dependiente de RpoS.

Figura 4. Modelo que muestra que CRP, Fis y PhoPQ regulan la expresión del operón
taiA-hlyE a través de RpoS. RpoS integra múltiples señales ambientales a través de
diferentes reguladores globales para regular la expresión del operón taiA-hlyE. Al igual
que hlyE, la expresión de taiA está regulada por RpoS y PhoPQ a un pH bajo y
concentraciones bajas de Mg2+.
RpoS es el regulador más importante en la red de hlyE ya que integra múltiples señales
ambientales y reguladores globales, incluidas las vías de señalización CRP, Fis y PhoP,
para controlar la expresión de hlyE en S. Typhi.