UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE BIOLOGIA Y MICROBIOLOGIA

PRÁCTICA DE LABORATORIO Nº 05

“RECUENTO DE Salmonella”

PRESENTADO POR:
VICTOR VENEGAS CUAILA 2012-36129

CURSO
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

DOCENTE
DR. CESAR JULIO CACEDA QUIROZ

TACNA – PERÚ
2017
 DETECCIÓN DE Salmonella

1. INTRODUCCIÓN
El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae,
integrada por bacilos Gram negativos anaerobios facultativos.
Poseen, por lo tanto, las características generales de las
enterobacterias: son fermentadores de la glucosa, catalasa positiva,
oxidasas negativo, reducen nitratos a nitritos y suelen ser móviles;
representa una excepción Salmonella gallinarum y Salmonella
pullorum, siempre inmóvil.
La Salmonella es una bacteria que puede causar una infección
gastrointestinal conocida como salmonelosis. Esta infección puede
ocurrir en los humanos y animales. Son viables en diferentes
condiciones ambientales sobreviven a la refrigeración y congelación,
mueren por calentamiento (mayor a los 70°C). La mayoría de las
personas infectadas dura entre cuatro a siete días. La persona puede
enfermar lo suficiente como para requerir hospitalización. Las
complicaciones graves y la muerte son raras, y más probablemente
suceden en las personas muy jóvenes, muy viejas y en las que
tienen otros problemas de salud.
La Salmonella debería ser considerada como potencialmente
patógena para el hombre. La única vía de entrada de estos
microorganismos en el cuerpo humano es la oral, por lo que es de
suma importancia el análisis de los alimentos para detectar su
presencia.
2. FUNDAMENTO
i. Enriquecimiento no selectivo: se utiliza cuando se cree que un
tratamiento (deshidratación, irradiación o congelación), o ciertas
condiciones (bajo pH), hayan lesionado las salmonelas en los
alimentos.
ii. Enriquecimiento selectivo: estimula la multiplicación de las
salmonelas y reduce o inhibe el crecimiento de los organismos
competitivos, tales como los coliformes, Proteus y Pseudomonas,
cuyo crecimiento superaría al de las salmonelas. La Comisión
recomienda el uso de caldo selenito-cistina y de caldo tetrationato
verde brillante, ambos incubados a 43°C. El caldo tetrationato
junto con el tiosulfato inhibe los coliformes mientras que las
bacterias reductoras de tetrationato como Salmonella y Proteus
pueden crecer sin dificultad. Las sales biliares inhiben a todos los
M’os intestinales acompañantes y el verde brillante inhibe la flora
Gram positiva.
iii. Siembra en Medios Selectivos y Diferenciales:
Agar MacConkey: es un medio selectivo y diferencial para aislar
M’os fermentadores y no fermentadores, de baja selectividad para
usar con inóculos pequeños. Las sales biliares y el cristal violeta
inhiben M’os Gram positivos. La presencia de lactosa permite el
desarrollo de las cepas lac (+), que se manifiesta por el viraje del
indicador debido a la producción de ácido, luego se absorbe el
rojo neutro dando color rojo a la colonia y un halo por la
precipitación de las sales biliares por acidez del medio.
Las bacterias no fermentadoras de lactosa (Salmonella Typhi, S.
Paratyphi, Shigella dysenteriae), no alteran el medio, dando
colonias incoloras y transparentes.
Agar SS (Salmonella-Shigella): es un medio selectivo para
Salmonella y Shigella a partir de materia fecal, alimentos y
animales, sirve para diferenciar fermentadores de lactosa de los
no fermentadores. La presencia de verde brillante a alta
concentración de tiosulfato y el citrato inhiben la flora
acompañada. Los que fermentan lactosa producen ácido que en
 presencia del rojo neutro propicia colonias de color rojo, los que
no fermentan lactosa forman colonias incoloras El Tiosulfato y la
sal de hierro ponen en evidencia la formación de sulfuro de hierro.
La degradación de la lactosa a ácido provoca el viraje del
indicador rojo neutro a rojo.
iv. Pruebas Bioquímicas
Agar Triple Azúcar Hierro (TSI): es un medio diferencial,
compuesto de tres azúcares: Glucosa, lactosa y sacarosa. El
color original de este medio es rojo ladrillo. El hierro es el
indicador para poner en evidencia la producción de hidrogeno
sulfurado (H2S), la producción de H2S se manifiesta por color
negro en el medio se simboliza de acuerdo a la intensidad de 1 +
á 4 +.La presencia de gas se manifiesta por el resquebrajamiento
del medio o por lo que el medio se elevada, se simboliza según
su intensidad de 1 + á 4 +. La acidez se pone de manifiesto por
su cambio al color amarillo, se simboliza con la letra A. La
alcalinidad en este medio se manifiesta por su cambio al color
grosella, se simboliza con la letra K. El ataque de glucosa se
manifiesta por la alcalinidad en la parte inclinada (K) y acidez en
el fondo (A), se simboliza K/A. El ataque de lactosa y/o sacarosa
se manifiesta por el cambio total del medio al color amarillo, se
simboliza A/A. Los M’os que no atacan ninguno de los azúcares,
el color del medio, a pesar del crecimiento bacteriano, es casi
igual y se simboliza N/N.
Agar Lisina Hierro (LIA): Puede utilizar la lisina del medio LIA,
por los mecanismos de descarboxilación, desaminación o bien ser
negativos frente a este aminoácido. Para diferenciar estas
reacciones el medio tiene en su composición glucosa y el
indicador azul de bromocresol. El color original del medio es
ligeramente azulado. La descarboxilación de la lisina produce
alcalinidad en todo el medio, por lo que tanto, el color azulado se
intensifica, se simboliza K/K y se considera como Lisina Positiva.
La desaminación empieza en la parte inclinada variando esta
porción al color rojo ladrillo, el fondo se tornará amarillo y se
 interpreta como Lisina Negativa, se simbolizará R/A. Si no se
produjera ninguna de las dos reacciones descarboxilación o
desaminación el medio LIA se observará azulado en la parte
inclinada y amarillo en el fondo por fermentación de la glucosa, se
simbolizará K/A puede presentarse amarillo en su totalidad, es
A/A. Estas dos lecturas se interpretan como Lisina Negativa. Si no
ha variado el color del medio, a pesar del crecimiento bacteriano,
se simbolizará N/N. Se presenta por la acidez, producto del
ataque a la glucosa, se neutraliza por la alcalinidad producida por
la decarboxilación o bien por que el gérmen ha sido incapaz de
utilizar la glucosa. Por lo tanto no corresponderán a la familia
Enterobacteriaceae.
3. OBJETIVO
 Realizar la detección de Salmonella sp. en una muestra determinada
(Huevos crudos) y hacer la confirmación con las pruebas
bioquímicas.
4. MATERIALES Y MÉTODO
4.1 MATERIALES
4.1.1 MATERIAL
 Matraz de 250 y 500ml Tubos de ensayo
 Placas Petri de 100 x 15 mm.
 Pipetas de 1 ml.
 Aguja y Asa de Kolle
 Espátula
 Papel Kraft
4.1.2 EQUIPOS
 Estufa a 35 – 37°C.
 Balanza.
 Cocina eléctrica.
4.1.3 MEDIOS DE CULTIVO
 Agua Peptonada Tamponada.
 Caldo tetrationato sin distribuir y en tubos con 10 ml.
 Agar SS
  Agar MacConkey
 Agar triple azúcar hierro (TSI) inclinado.
 Agar lisina hierro inclinado (LIA).

4.2 MÉTODO
4.2.1 AISLAMIENTO DE SALMONELAS
Esta parte incluye tres etapas fundamentales:
a) ENRIQUECIMIENTO PREVIO DE SALMONELAS
(FDA, 2 007)

Cuadro N° 01: Métodos de enriquecimiento previo para salmonelas.

Producto Caldo de preenriquecimiento

Huevos completos desecados, Caldo lactosa o agua de peptona
yemas de huevo desecadas, clara de tamponada.
huevo desecadas, huevos líquidos
pasterizados y congelados, mezclas
preparadas en polvo, galletas,
fórmula para niños, huevos crudos,
carnes crudas, pasta conteniendo
huevo, tintes y sustancias colorantes.
Levadura desecada (inactivada) Agua destilada
Leche en polvo descremada y leche Agua destilada con 2 ml de solución
en polvo entera al 1% de verde brillante por litro.
Caramelos y bombones Leche en polvo reconstituida con
verde brillante
Sub productos grasos animales Caldo lactosa con 1% de Tergitol o
fundidos, coco. agua de peptona tamponada con
0.22% de Tergitol.
Fuente: ICMSF, 2000.

Preparación de Muestra: Huevo entero

Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un

recipiente estéril de boca ancha o en otro recipiente
apropiado y agregar 225 ml de Agua Peptona
Tamponada. Agitar suavemente hasta disolución sin
grumos.
 Dejar 60 minutos + 5 minutos a temperatura
ambiente, incubar 24 h + 2 h a 35°C.

b) ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO DE
SALOMONELLAS (ICMSF, 2 000)
Pasar 1 ml del cultivo de preenriquecimiento a 10 ml.
de caldo Tetrationato verde brillante. Incúbese a 43
+ 0.05°C durante 24 horas.
c) SIEMBRA EN PLACA EN MEDIO DE AGAR
SELECTIVO PARA SALMONELAS (ICMSF, 2 000)

Pasar una asada del medio de enriquecimiento

selectivo a la superficie de una placa de cada uno de
los dos medios de agar selectivo (Agar SS Y Agar
MacConkey) y extender de tal manera que se
obtengan colonias aisladas.
Incubar las placas de Agar SS durante 24 horas a
35-37 °C. Las colonias típicas de Salmonella son
incoloras y en el medio se evidencia un color oscuro
evidenciando el sulfuro.
Incubar las placas de agar MacConkey a 35-37°C
durante 48 horas. Las colonias típicas de Salmonella
son icoloras, transparente.
4.2.2 EXPLORACION BIOQUÍMICA PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE SALMONELAS (FDA, 2 007)
 TSI y LIA: Picar suavemente el centro de la colonia con
aguja de inoculación e inocular el TSI por punción en el
fondo y estriar el pico de flauta.
Sin flamear inocular el LIA por punción en el fondo 2
veces y estriar el pico de flauta. Como la reacción de la
lisina decarboxilasa es estrictamente anaeróbica, el LIA
debe tener un fondo profundo (4cm). Guardar las placas
a 5°C – 8°C.
 Incubar el TSI y LIA a 35°C durante 24 h + 2 h. Tapar
los tubos sin apretar para mantener condiciones de
aerobiosis y prevenir la excesiva producción de H 2S.

 LECTURA DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS

TSI: Diferenciación de enterobacterias, en base a la
fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la
producción de ácido sulfhídrico.
 COLOR: Amarillo-Naranja (fondo ácido) y
Rojo (pico de flauta alcalino).
 INDICADOR: ROJO DE FENOL
 SUSTRATO: AGAR
 Salmonella spp. : K/A
 H2S (+)
 GAS (+)
LIA: Especialmente Salmonella spp., basado en la
descarboxilación / desaminación de la lisina y en la
producción de ácido sulfhídrico
 COLOR: Purpura (fondo alcalino)
 INDICADOR: PURPURA DE
BROMOCRESOL
 SUSTRATO: AGAR
 Salmonella spp.: K/K
 H2S: (+)
 GAS: (-)
Descartar como no Salmonella los cultivos que dan
fondo ácidos en LIA y pico de flauta y fondo ácidos en
TSI.
 Cuadro N°02: Interpretación para otras pruebas Bioquímicas y
serológicas
Resultado para
Resultado Salmonella spp
Prueba
(a)

Positivo Negativo
Glucosa (TSI) fondo amarillo fondo rojo (+)
Lisina decarboxilasa
fondo violeta fondo amarillo (+)
(LIA)
H2S (TSI y LIA) Ennegrecimiento sin ennegrecimiento (+)
Ureasa rojo- violeta sin cambio de color (-)
Caldo lisina
Violeta amarillo (+)
decarboxilasa
Caldo dulcitol rojo sin gas y sin cambio
amarillo y/o gas (+) (b)
fenol de color
Caldo KCN Crecimiento sin crecimiento (-)
Caldo malonato Azul sin cambio de color (-) (c)
color rojo fuerte en color amarillo en la
Indol (-)
la superficie superficie
Antisuero polivalente
aglutinación sin aglutinación (+)
flagelar
Antisuero polivalente
aglutinación sin aglutinación (+)
somático
Caldo lactosa rojo sin gas y sin cambio
amarillo y/o gas (-) (c)
fenol de color
Caldo sucrosa rojo sin gas y sin cambio
amarillo y/o gas (-)
fenol de color
Voges Proskauer rosa a rojo sin cambio de color (-)
Rojo de metilo Rojo amarillo (+)
sin crecimiento, sin
Citrato de Simmons crecimiento, azul V
cambio de color
Fuente: FDA, 2007
(a) (+): 90% o más positivo en 1 o 2 días, (-): 90% o más negativo en 1 o 2
días, V: variable
(b) La mayoría de las S. arizonae son negativas
(c) La mayoría de las S. arizonae son positivas

ESQUEMA DEL PROTOCOLO

1. ENRIQUECIMIENTO PREVIO DE SALMONELAS

 DIA 1
25 g de Incubar a 35-37ºC,
muestra 18-24 horas

Agua
Peptonada
Tamponada
225ml

2. ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO DE SALMONELAS

DIA 2
1 ml del cultivo preenriquecido
en 10 ml de…

Caldo Selenito Caldo Tetrationato

cistina verde brillante

Incúbese a 43 + 0.05 °C / 24 h

DIA 3 Agar MacConkey

Agar SS
Colonias típicas de
Colonias típicas de
Salmonelas son incoloras Salmonelas son
y en el medio se amarillas
evidencia un color oscuro
evidenciando sulfuro.

1. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE

Salmonella spp

DIA 4
Placa Petri
Placa Petri con
con Agar SS
Agar MacConkey

LIA TSI
5. EXPRESIÓN DE RESULTADOS
De acuerdo a los resultados de la interpretación indicar presencia o
ausencia de Salmonella spp. en la cantidad de muestra analizada
(por gramos o mililitros para muestras líquidas).
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 ICMSF. (2000). Microorganismos de los Alimentos 1. Su
significado y métodos de enumeración. Zaragoza (España):
ACRIBIA S.A.
 Bacteriological Analytical Manual. Chaper 5, Salmonella.
December 2007.Edition. FDA U.S. Food and Drug Administration.