La expresión de Arabidopsis thaliana Thioredoxin-h2 en Brassica napus mejora las defensas

antioxidantes y mejora la tolerancia a la sal

Jasbleidy Velasquez Prada

1094282770
Facultad de ciencias agrarias, Universidad de Pamplona
Biotecnología Vegetal
Ruth Romero Ivica

1. Objetivo

En el presente estudio se vio como objetivo el aislamiento de los genes de Arabidopsis que
codifican dos Trx de tipo h citosólicos proteínas, AtTrx-h2 y AtTrx-h3 y plantas transgénicas de
colza transgénica (Brassica napus) que sobre expresan AtTrx-h2 o AtTrx-h3.

2. Método de transformación utilizado

Las regiones de marco de lectura abierto de AtTrx-h2 (At5g39950) y AtTrxh3 (At5g42980)

se amplificaron y se insertaron en el vector T usando cebadores directo e inverso en los sitios de
enzimas de restricción XbaI y ClaI, respectivamente. Los fragmentos AtTrx-h2 y AtTrx-h3
cortados con XbaI y ClaI se ligaron en el vector pCAMBIA1300, que se cortó con las mismas
enzimas. Los vectores binarios se transformaron en la cepa GV3101 de Agrobacterium
tumefaciens para la transformación mediada por Agrobacterium y los brotes / raíces se
regeneraron a partir de explantes de hipocotilo inoculados con A. tumefaciens en los medios de
selección.

3. Metodología
 Materiales vegetales, condiciones de crecimiento y condiciones de estrés salino.
 Generación de plantas transgénicas de B. napus
 Generación de anticuerpo anti-AtTrx-h2
 Tinción histoquímica para aniones superóxido y peróxido de hidrógeno.
 Medición de H2O2 y análisis de actividades de enzimas antioxidantes
 PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR)
  Construcción de árbol filogenético de proteínas de tipo h AtTrx

Se tomaron semillas de B. napus esterilizadas en superficie se colocaron en medios MS y se

incubaron en una sala de cultivo bajo un fotoperíodo de 16 h a 25 ° C durante 6–7 días. Los
hipocotilos se cortaron en segmentos de 0,5 cm y se colocaron en medio de precultivo [medio
basal MS, 1 mg L − 1 NAA, 2 mg L − 1 BA, 2 mg L − 1 AgNO3, 3% (p / v) de sacarosa y 0.8 %
(p / v) Phytagar durante 2 d. Los hipocotilos precultivados se inocularon con suspensión de A.
tumefaciens (OD600 = 0.2–0.5) en medio líquido MS durante 15–20 min con agitación suave.
Los hipocotilos inoculados se secaron con papel de filtro esterilizado para eliminar el exceso de
suspensión bacteriana y se cultivaron conjuntamente en medios de cocultivo [medio basal MS, 1
mg L − 1 NAA, 2 mg L − 1 BA, 2 mg L − 1 AgNO3, 100 acetosiringona μM, sacarosa al 3% (p /
v) y Phytagar al 0.8% (p / v) durante 3 días en la oscuridad a 25 ° C.

Los hipocotilos transformados por Agrobacterium se lavaron con agua esterilizada que
contenía 100 mg L − 1 de carbenicilina y 250 mg L − 1 cefotaxima y se transfirieron a medio
selectivo [medio basal MS, 1 mg L − 1 NAA, 2 mg L − 1 BA, 2 mg L −1 AgNO3, 3% (p / v) de
sacarosa, 100 mg L − 1 de carbenicilina, 250 mg L − 1 de cefotaxima y 0.8% (p / v) de Phytagar]
suplementado con 6 mg L − 1 de fosfinotricina como agente selectivo. Los callos formados en
hipocotilos se subcultivaron en medio selectivo fresco cada 2-3 semanas. Brotes sanos y
alargados fueron extirpados y transferidos a medio MS libre de fitohormonas para inducir el
enraizamiento. Las plántulas transformadas se cultivaron en un invernadero después de la
aclimatación. Después de una vernalización de 45 días, los trasplantes se atornillaron y se
autopolinizaron para producir semillas.

4. Conclusiones

Las características antioxidantes más robustas en las plantas mejoran la protección contra el
daño oxidativo en condiciones de estrés salino. Por lo tanto, la actividad mejorada de las enzimas
antioxidantes derivadas de la expresión de AtTrx-h2 parecen aumentar la tolerancia a la sal en B.
napus. En conclusión, esto estudio demostró que la expresión heteróloga de Arabidopsis Trx-h2
en B. napus impulsó el sistema antioxidante y mejoró la tolerancia a la sal de plantas
transgénicas, al menos en la etapa de plántulas jóvenes. Nuestros resultados sugieren que AtTrx-
h2 es un recurso genético prometedor para mejorar la sal tolerancia al estrés en cultivos.

5. El cultivo se encuentra en evaluación o ya se está comercializando como OGM,

donde

La Brassica napus es una especie especialmente reconocida por sus propiedades

nutricionales, por tanto, se ve comercialmente más implicada en la industrialización de ella,
aprovechando sus contenidos de aceites esenciales; se encuentra en la OGM, pero con
modificaciones relacionadas a la resistencia a herbicidas.