UNIVERSIDAD PRIVADA DE HUANCAYO

“FRANKLIN ROOSEVELT”
RES.571-2009-CONAFU / RES. 517-2010-CONAFU

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS

FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA

PRACTICA DE LABORATORIO
CROMATOGRAFIA

CURSO : FITOQUIMICA

DOCENTE : Dr. DANIEL ÑAÑEZ DEL PINO

ESTUDIANTES : ALVAREZ QUIQUIA, LIZBETH

CHOQUE DIAZ, JENNY

CICLO: VIII

2019

1 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

 ÍNDICE

I. Introducción 03
II. Marco teórico
04
2.1 Flavonoides 04
2.1.1 Características 04
2.2 Algunos Vegetales Que Aportan Flavonoides 05
2.2.1 APIO (Apigenina) 06
2.2.2 RUDA (Ruta graveolens) 07
2.3 Cromatografía Medio De Separación De Flavonoides 08
2.3.1 Característica 08
2.3.2 Factor de retardo (Retardation factor) 08
2.3.3 El gel de sílice 09
2.3.4 Proceso de Adsorción 09
2.3.5 Adsorbentes 10

III. Objetivo 11

IV. Materiales, Equipos Y Reactivos 11

4.1. Materiales 11
4.1.2. Equipos 11
4.1.3. Reactivos 12

V. Parte Experimental 13
5.1. Preparación del Extracto de Apio y Ruda 13

5.2.1 Sembrado y Revelar 14

VI. Resultado 17

VII. Conclusión 18

VIII. Referencia Bibliográfica 19

2 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

I. INTRODUCCIÓN

Los vegetales naturales poseen distintas aceites esenciales, carbohidratos,

aminoácidos y cada una de los componentes químicos tienen distintas
actividades farmacológicas, la cual mediante los reactivos ya sean generales o
específicos tratamos de identificar los componentes activos que se pueden
encontrar en ella, entonces mediante la cromatografía se realiza la separación
de los constituyentes químicos de una droga vegetal utilizando la técnica de
Cromatografía, existen tres técnicas de cromatografía: cromatografía en papel,
cromatografía en capa fina y cromatografía gas-líquido. La elección de la
técnica cromatográfica depende de las propiedades de solubilidad y volatilidad
de los compuestos a separar. Otra técnica ampliamente utilizada en la
separación de constituyentes químicos es la electroforesis, inicialmente
aplicable a compuestos que presentan carga eléctrica.
Las técnicas cromatográficas para el análisis y purificación de los productos de
reacción son ampliamente utilizadas en el laboratorio orgánico. La técnica
cromatográfica de purificación consiste en separar mezclas de compuestos
mediante la exposición de dicha mezcla a un sistema bifásico equilibrado.
Todas las técnicas cromatográficas dependen de la distribución de los
componentes de la mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase móvil, llamada
también activa, que transporta las sustancias que se separan y que progresa
en relación con la otra, denominada fase estacionaria. La fase móvil puede ser
un líquido o un gas y la estacionaria puede ser un sólido o un líquido. Las
combinaciones de estos componentes dan lugar a los distintos tipos de
técnicas cromatográficas que aparecen en la siguiente tabla .
Los ensayos bioquímicos aportan información valiosa para la identificación. La
completa identificación depende de la evaluación de todas las propiedades que
incluyen punto de fusión, punto de ebullición, rotación óptica y Rf (factor de retardo) .
Parte importante de la determinación estructural de constituyentes químicos son las
características de sus respectivos espectros: ultravioleta (UV), espectro de masas
(MS) y de la comparación de estas con la literatura científica.

3 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

II. MARCO TEORICO

II.1 FLAVONOIDES

Los flavonoides son pigmentos vegetales naturales que se encuentran

ampliamente distribuidos entre las plantas, se les puede encontrar libres como
glicósidos; estos últimos contribuyen a darle color a las flores, frutos y hojas.
Estos compuestos se sintetizan por numerosos grupos de plantas.

II.1.1 Características
Su nombre proviene de la coloración amarilla (latín Flavus=amarillo miel u oro)
de algunas sustancias pertenecientes a este grupo.
• Son denominados también derivados del flavano o bioflavonoides.
• Representan el grupo mayor de cuerpos multifenólicos o polifenoles
distribuidos en el reino vegetal.
• Tienen 15 C, en esqueleto carbonado formado por dos anillos aromáticos
unidos por una unidad de 3C que puede ser o no aromática: C6 -C3 -C6
• Todos los flavonoides son estructuras hidroxiladas en el anillo aromático y por
tanto, son polifenólicas.
• Más comunes flavonas y flavonoles, menos frecuentes isoflavonas,
chalconas y auronas.
• Se les encuentra en forma libre (agliconas), como glicósidos (núcleo
flavonoide básico más una o varias unidades de carbohidratos), sulfatos y
algunas veces como dímeros (biflavonoides) y polímeros.Los diferentes tipos
de flavonoides se pueden identificar por medio de las reacciones coloridas y
propiedades de solubilidad.
• Pueden ser glicósidos: unión hemiacetal a través de átomo de oxígeno (o-
glicósidos) o unión C-C (cglicósidos). Más comunes los primeros.
• Pueden haber de 1 a 3 unidades de azúcar en C3 y C7 del tipo glucosa,
galactosa, ramnosa, xilosa, arabinosa, ácido D-glucurónido.

4 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

II.2 ALGUNOS VEGETALES QUE APORTAN FLAVONOIDES

II.2.1 APIO (Apigenina)

 Características del apio

La apigenina es un flavonoide natural presente en las frutas y las verduras,
como el perejil, la cebolla, el apio, el té o el pomelo.La apigenina también
está presente en el vino tinto y en la cerveza. La apigenina está reconocida
como un flavonoide bioactivo que posee propiedades antiinflamatorias,
antioxidantes, antiangiogénicas, antialergizantes, antigenotóxicas y
anticancerosas.

 Composición:

- El apio es fuente de potasio, el cual contribuye al funcionamiento normal

del sistema nervioso y de los músculos.
- También contiene flavonoides, entre los que cabe citar la miricetina,
quercetina y kaempferol (flavonoles), y la luteolina y apigenina
(flavonas).
- Por otro lado, el aceite de semilla de apio contiene ftálidos que son
sustancias de origen natural que cuenta con propiedades sobre la
mucosa gástrica y un aceite volátil, el apiol.

 Usos:
USOS COMUNES

- El apio facilita el funcionamiento de los riñones y es un excelente

depurativo porque elimina sustancias de desecho con la orina.

5 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

- Posee características antibacterianas y como purificador de la sangre
ayuda a diabéticos en el metabolismo.
- Al comerlo crudo su abundancia en fibra obliga a masticarlo bien y
proporciona sensación de saciedad, teniendo un bajísimo valor calórico.
- Los diversos compuestos del apio como los flavonoides ayudan en la
renovación de las articulaciones y el tejido conjuntivo.
- El aceite esencial del apio es usado por sus propiedades antioxidantes
pues reduce las deposiciones de colesterol insoluble en las arterias.
- El apio favorece la secreción de saliva y jugos gástricos.
- Sus aceites esenciales ayudan a controlar la hipertensión. Éste ejerce
un efecto dilatador sobre los vasos renales y de esta manera aumenta el
volumen de orina favoreciendo la eliminación de agua y de sustancias
tóxicas.
- El apio aporta sustancias que protegen la piel y se activan con la luz
ultravioleta aumentando la disponibilidad de células productoras de
pigmento en la superficie de la piel.
- En resumen por sus propiedades y beneficios se usa para:
Diurético y depurativo. Contra la diabetes. Para bajar de peso.
- Como antiinflamatorio y para dolores en las articulaciones.
- Como antioxidante para el colesterol.
- Para los problemas digestivos (inapetencia, digestiones lentas).
- Para la hipertensión y retenciones de líquido.
- Para problemas de piel (psoriasis, vitíligo).

6 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

 II.2.2 RUDA (Ruta graveolens)

 Característica de la ruda
Ruta graveolens (ruda) es un arbusto pequeño, de hojas carnosas y de flores
amarillas en cimas terminales. Tiene un intenso olor desagradable, sabor
amargo y acre. Las hojas poseen glándulas que contienen una esencia irritante
y la manipulación de ellas estando frescas producen ampollas en la piel.
 Composición:
Las hojas contienen:
• 1 % de aceite esencial: metil nonil cetona, metil heptil cetona, metil octil
cetona
• 2 % de rutósido = rutina (ramnoglucósido del quercetol)
La ruda se usa como antiespasmódico por su contenido de aceite esencial. Se
ha observado que a concentraciones mayores (0,05 – 0,10 g) es emenagoga.
Se conoce además, desde hace mucho tiempo como abortiva. La toxicidad se
le atribuye a la metil nonil cetona.

7 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

La rutina o rutósido es muy poco tóxica. Este flavonoide también se encuentra
en: cáscara de naranjas, trigo sarraceno (hojas), grosellas negras y otras, y en

la Sophora japonica.
 USO:
En el tratamiento de la fragilidad capilar, encontrándose en formulaciones
farmacéuticas con ese fin. En el presente experimento se describen los
ensayos para detectar y separar la rutina de la “ruda” es a través de
cromatografías de capa delgada y de columna la cual usaremos en este
ensayo; y un siguiente ensayo para su determinación cuantitativa por
cromatografía líquida de alta eficiencia o rendimiento.

II.3 CROMATOGRAFÍA MEDIO DE SEPARACIÓN DE FLAVONOIDES

II.3.1 Característica:
La cromatografía en fase reversa reversa se caracteriza por tener una columna
cromatográfica con una fase estacionaria no polar, con frecuencia se trata de
un hidrocarburo, y la fase móvil es relativamente polar (como el agua, metanol,
acetonitrilo). En la fase reversa los componentes más polares aparecen
primero, y un aumento de la polaridad de la fase móvil acorta el tiempo de
retención. La interacción que se produce es según la polaridad de los
componentes de la muestra; el componente más polar eluye con la fase móvil
saliendo primero y el componente menos polar eluye al final.
La elución de los componentes de una muestra puede realizarse de dos
maneras: isocráticamente, es decir, una separación que utiliza un solo
disolvente de composición constante, o bien, usando una elución en gradiente

8 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

que utiliza dos o más disolventes con polaridad significativamente distinta,
variando la relación de los disolventes en forma programada durante el tiempo
de elución. Este tipo de elución en gradiente presenta ventajas considerables
como mejor separación y tiempos cortos de retención.
Debido a la variedad de flavonoides y su similitud en términos de polaridad y
peso molecular, fue necesario utilizar una gradiente de solventes que
presentan las siguientes ventajas:
- Separa mezclas complejas con gran precisión.
- Separa componentes muy similares.
- Separa prácticamente cualquier especie.
- No destruir la muestra.

II.3.2 Factor de retardo (Retardation factor): Rf

Indica la posición de la zona de la sustancia (mancha) en una placa
cromatográfica. Se define como el cociente obtenido dividiendo la distancia
entre la mancha y la línea de origen con ladistancia entre el frente de solvente y
la línea de origen.
Rf : Factor de retardo
Zs : Distancia entre la zona de la sustancia y la línea de
origen [mm]
Zf : Distancia entre la zona de frente del solvente y la
línea de orígen [mm]
Z0 : Distancia entre el nivel del solvente y la línea de origen [mm]
El valor de Rf será siempre ≤ 1 el cual puede ser amplificado por 100,
obteniendo como número entero lo que en literatura se puede encontrar como
hRf para describir cualitativamente las placas de c.c.f
Al contar con estándares y/o literatura de referencia, a través de c.c.f., se
pueden realizar identificaciones preliminares confirmando la presencia de
compuestos en la muestra o también observar que o cuantos compuestos
existen.
II.3.3 El gel de sílice
es un ejemplo de fase estacionaria polar, por lo que al utilizarla para separar
compuestos de una muestra, los polares presentarán mayor afinidad por ella y
obtendrán Rfs de menor valor en comparación a los compuestos de naturaleza
más apolar los cuales avanzarán de acuerdo a la afinidad que tengan por la
fase móvil

9 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

Dependiendo de los tipos de compuestos en estudio, las placas pueden ser
reveladas con reactivos reveladores u observadas bajo luz ultravioleta
(compuestos resonantes).

II.3.4 Proceso de Adsorción

La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del mate-rial por
la acción de fuerzas electrostáticas (fuerzas de Van der Wals, puentes de
Hidrógeno, efectos inductivos, etc). Luego, cuando la capa es expuesta a un
flujo por acción capilar, se inicia una competencia de enlaces entre los sitios
activos del adsorbente y la sustancia con el solvente.

II.3.5 Adsorbentes
Los adsorbentes más utilizados en la Cromatografía de Capa Fina son:
• Sílica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones), se le en-cuentra con
o sin indicador fluorescente, algunas marcas tienen sulfato de calcio para darle
mayor adhesividad a la placa.
- Sílica gel G 13% CaCO3
- Sílica gel H
- Sílica gel GF254
- Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica), presenta las
mismas propiedades adsorbentes que la sílica gel pero a dife-rencia de
ésta la capacidad de la alúmina depende del pH. Se en-cuentra también
en el mercado con o sin adhesivo y con o sin in-dicador.

10 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

• Tierra Silícea ó Kieselguhr, es menos polar que la sílica gel y en
consecuencia menos adsorbente por lo que no se pueden hacer capas gruesas
con facilidad y la cantidad de sustancias que se puede aplicar es menor que en
la sílica.
• Celulosa (Nativa o micro-cristalina), aquí los principios de la se-paración
son los mismos que en la cromatografía de papel pero con la ventaja de que
las manchas son mas definidas y dan me-jores separaciones. Se encuentra en
el mercado con o sin adhe-sivo y con o sin indicador fluorescente.
• Poliamidas
Estos adsorbentes deber tener las siguientes características:
• Tamaño de Partícula
.- Volumen de Poro
- Diámetro de Poro
- Área Superficial
- Homogeneidad
- Pureza

III. OBJETIVO

 Identificar flavonoides del extracto de apio y ruda, mediante la técnica de

cromatografía capa fina.
 Calcular los valores de Rf del extracto de apio y extracto de la ruda.

IV. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

4.1. Materiales

11 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

tubos de ensayo

embudo

pipeta de 10 ml

mechero

gotero

4.1.2. Equipos

Cuba Cromatográfica

Sistema cerrado de vidrio donde se colocará la

fase móvil de solventes para realizar el recorrido
sin que interfiera el exterior.

Silica gel

La fase estacionaria es una capa uniforme

de un absorbente mantenido sobre una
placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio
u otro soporteexterior.

4.1.3. Reactivos

NOMBRE: ACETATO DE ETILO

PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS

 Estado físico: Liquido

 Color: Incoloro, Transparente.
 Pto. De ebullición: 350 K (77 ℃)
 Pto. De fusión: 189 K (-84 ℃)
 Inflamabilidad: 280 K (7 ℃)
 Solubilidad en agua: 8,7% a 20 °C

12 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

 NOMBRE: METANOL PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS

 Estado físico: Liquido

 Color: Incoloro, Transparente.
 Pto. De ebullición: 64,5 ºC a 769 mm Hg
 Pto. De fusión: - 97,8 ºC
 PH. (sol.10%) N.A. Densidad relativa: 0,7910 a
20 ºC/4 ºC
 Inflamabilidad: 385 ºC
 Solubilidad: Soluble en agua en cualquier
proporción.

NOMBRE: AGUA

PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS

 Estado físico: Liquido

 Color: Incoloro, Transparente.
 Pto. De ebullición: 100 ºC
 Inflamabilidad: 0

V. PARTE EXPERIMENTAL

5.1. Preparación del Extracto de Apio y Ruda

13 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

 5.1.2 Preparación
APIO(Apium de fase móvil
graveolens ) RUDA(Ruta graveolens)

1) Pesar el vegetal 5 g
Acetato de etilo : 1.6 ml
y agregamos 20 gts
de OH
Metanol
Sist. Sal. cc : 0.25 ml

Agua destilada : 0.15 ml 2) Hervir y desde punto

2 ml de ebullición un
promedio de 15
minutos y filtramos.

4)Separamos 1ml de
m.p. en un tubo de
ensayo APIO
3) Filtramos el
Y extracto mp.

RUDA

14 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

Acetato de etilo Metanol Agua destilada
l

Fase móvil se
encarga de llevar
al soluto para
determinar el
recorrido

5.2.1 Sembrado

1) Medir 0.5 cm para poder sembrar y identificar el recorrido

15 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

 0.5 cm

2) Tomamos un capilar y dejamos sumergir dentro del capilar

la solución de m.p.
3)

En el punto señalado hacer 20 puntadas en el mismo lugar con el

capilar que tiene la m.p. y secamos mediante calor

observación
Sembrar
cuidadosamente y no
presionar ni
humedecer la fase
estacionaria ya que
puede ser un factor de
salga mal el recorrido
y nos daría un falso
positivo
5.2.2 Revelado

1) Se utiliza yodo metálico dentro del vaso de precipitación y colocamos la lámina

adentro. agitamos que por sublimación revela hasta donde fue recorrido el
metabolito del solvente y separamos la lámina y finalmente observar y medir la
distancia recorrido del soluto y solvente.

16 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

 El revelado es paso muy importante ya que no permite visualizar
los metabolitos del soluto recorrido y también del solvente para
determinar el RF Y poder comparar.

VI. RESULTAD
O Hallar el
Rf

0.72
17 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA
 FRENTE DEL DISOLVENTE

Rf=distancia recorrida por el compuesto

distancia recorrida por el disolvente

EL factor de retardo nos indica la posición de la zona de la sustancia en la placa

cromatográfica . lo cual determina como el cociente obtenido dividiendo la distancia
entre la mancha y la línea de origen con la distancia entre el frente del solvente siendo
el valor menor que 1 dando positivo la presencia de flavonoides de (ruda y apio) la
práctica realizada en el laboratorio

VII. CONCLUSION

18 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

 Llegamos identificar en el extracto acuoso de flavonoides de ruda y apio
que si hay presencia de flavonoides en abundancia lo cual su uso será
de gran ayuda para las personas.

 Calculamos los valores de Rf del extracto de apio y extracto de la ruda lo

cual nos confirmó la presencia de flavonoides fue menor de 1, se
optimizo nuestro trabajo en cromatografía capa fina.

19 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

 VIII. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

1. Cabrera Suárez Hirán R, Morón Rodríguez Francisco J, Amador María

del Carmen Victoria, García Hernández Ana Ibis, Acosta de la Luz Lérida.
Composición fitoquímica de partes aéreas frescas de Phaniamatricarioides.
Rev Cubana PlantMed [Internet]. 2012 Sep [citado 2018 Abr 22] ; 17( 3 ):
268-278.

2. Sharapin.,P. et al.Fundamentos de Tecnología de Productos

Fitoterapeuticos.1 Ed.Santafé de Bogotá:Editorial Cyted.;2000.,p.198,199.

3. StermitzW.Química Orgánica.1 Ed.Barcelona: Reverté S.A.;1988.P.9-12.

4. Lock de Ugaz O. Investigación Fitoquímica: Métodos en el estudio de

productos naturales. 2 Ed. Univ.

5. Martínez Flores S, González Gallego J, Culebras JM, Tuñón MJ. (2002). Los
flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Nutr. Hosp, XVII (6): 271-
278.

20 IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA