Normas que publican los comités de estandarización de ensayos in vitro, tanto europeo

(EUCAST) como americano (CLSI).

CLSI: métodos de referencia para levaduras, M27-A3 y M44-A, y para hongos
filamentosos, M38-A. Básicamente, consisten en cuantificar la inhibición de crecimiento
producida por el antifúngico comparada con el crecimiento de la levadura o moho en el
mismo medio pero sin antifúngico (control).
El medio de cultivo, pH, tampón, inóculo, tiempo y temperatura de incubación deben
ajustarse estrictamente a lo recomendado en dichos documentos puesto que cualquier
variación de estos parámetros puede afectar los resultados.

1.Método de dilución en caldo para levaduras (CLSI):

*Diseñado para Candida spp y Cryptococcus neoformans

EUCAST VS CLSI PARA MÉTODO DE DILUCIÓN EN CALDO PARA LEVADURAS:

Variables CLSI EUCAST

Preparación inoculo
Subcultivo en agar
dextrosa Sabouraud o agar
papa dextrosa
Suspensión en solución
salina 0.85% o agua estéril
Método
espectrofotométrico
Subcultivo en agar
dextrosa Sabouraud o agar
papa dextrosa
Suspensión en solución
salina 0.85% o agua estéril
Método
espectrofotométrico

Medio de cultivo Medio de cultivo RPMI- medio RPMI 1640 con

1640 con MOPS 0.165 M MOPS 0.165 M con 2%
 0.2% glucosa glucosa

pH 7.0 ± 0.1 7.0 ± 0.1

Concentración inoculo 0.5-2.5 × 102 UFC/ml 2.5 10^5 CFU/m
Temperatura incubacion 35°C 35°C
Lectura CMI Métodos Método visual
espectrofotométricos

de turbidez visible
2.Métodos de dilución en caldo para hongos filamentosos
*El procedimiento detalla la metodología de macrodilución y microdilución en caldo para la
determinación de susceptibilidad en los hongos filamentosos más comunes que causan
micosis invasivas como Aspergillus spp., Fusarium spp., Rhizopus spp., Pseudallescheria
boydii y Sporothrix schenckii.

EUCAST
se diferencia del procedimiento recogido en el documento M27 del estadounidense CLSI
(Clinical and Laboratory Standards Institute) sobre pruebas de sensibilidad de levaduras
[(1)], en que recomienda:
  una concentración de glucosa más elevada en el medio (para
 optimizar el crecimiento),
 un mayor inóculo (lo que asegura la lectura a las 24 horas para la mayoría de
las especies)
 placas con pocillos de fondo plano para permitir la lectura
espectrofotométrica en lugar de la lectura visual para la determinación de los
puntos finales (endpoints).
LEVADURAS:
Preparación del inoculo: Subcultivo en agar dextrosa Sabouraud o agar papa dextrosa
Suspensión en solución salina 0.85% o agua estéril
Método espectrofotométrico
Medio de cultivo: RPMI-1640 con glutamina (Tabla 1) y suplementado con glucosa en
una concentración final de 20g/L (2%). (MOPS) en una concentración final de 0,165 mol/L,
pH: 7,0 a 25ºC con 1M de hidróxido sódico
Concentración del inoculo: 0,5x105 - 2,5x105 UFC/mL
Temperatura de incubación 35 ± 2ºC en aire ambiente durante 24 ± 2 h.
Lectura CMI Espectofotometria
Control de calidad

HONGOS FILAMENTOSOS
Preparación del inoculo Subcultivo en agar dextrosa Sabouraud o agar papa dextrosa
Suspensión en solución salina 0.85% o agua estéril Con algunas cepas será necesario un
mayor tiempo de incubación para una correcta esporulación
Método espectrofotométrico
Medio de cultivo RPMI-1640 (con glutamina y un indicador de pH sin bicarbonato)
suplementado con glucosa en una concentración final de 2% (RPMI 2% G) (MOPS) en
una concentración final de 0,165 mol/L,
pH: 7,0 a 25ºC con 1M de hidróxido sódico
Concentración del inoculo 1,5 x105 UFC/mL y 2,5x105 UFC/ml
Temperatura de incubación 35 ± 2ºC en aire ambiente durante 24. No se recomiendan
incubaciones más largas. Los hongos mucorales deben leerse a las 24 h. Otros hongos
deben leerse a las 48 h
Lectura CMI Los puntos finales se leen visualmente, mediante registros del grado de
crecimiento para cada pocillo empleando un espejo de aumento
Control de calidad
EUCAST VS CLSI PARA MÉTODO DE DILUCIÓN EN CALDO PARA HONGOS
FILAMENTOSOS FORMADORES DE CONIDIAS:

Variables CLSI EUCAST

Preparación inoculo Subcultivo en agar
dextrosa Sabouraud o agar
papa dextrosa
Suspensión en solución
salina 0.85% o agua estéril
Método
espectrofotométrico
Subcultivo en agar
dextrosa Sabouraud o agar
papa dextrosa
Suspensión en solución
salina 0.85% o agua estéril
Método
espectrofotométrico

Medio de cultivo Medio de cultivo RPMI- medio RPMI 1640 con

1640 con MOPS 0.165 M MOPS 0.165 M con 2%
0.2% glucosa glucosa

pH 7.0 ± 0.1 7.0 ± 0.1

Concentración inoculo No dermatofitos: 0.4-5 × 2.5 10^5 CFU/m
104 UFC/ml
Dermatofitos: 1-3 × 103
UFC/ml
Temperatura incubacion 35°C 35°C
Lectura CMI Métodos Método visual
espectrofotométricos