Memorias del Instituto de Biología Experimental vol.

4:21-24 (2005) © Ediciones IBE

Producción, caracterización y fosforilación de mutantes de

calmodulina deficientes en tirosina.
VALENTINA SALAS1, 2, JUAN SÁNCHEZ-TORRES2, DAVID M. CUSIDÓ-HITA2,
YAEL GARCÍA-MARCHAN1, 2, 3, FELIPE SOJO1, ANTONIO VILLALOBO2
Y GUSTAVO BENAIM1, 2, 3
1
Laboratorio de Biofísica, Centro de Biología celular
Instituto de Biología Experimental, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela
Apartado 47114. Caracas 1041A, Venezuela. E-mail@: vsalascuevas@yahoo.es
2
Instituto de Investigaciones Biomédicas, Consejo Superior de Investigaciones
Científicas y Universidad Autónoma de Madrid, Arturo Duperier 4, E-28029 Madrid,
3
Centro de Biociencias, Instituto de Estudios Avanzados IDEA, Caracas.

En este trabajo reportamos la producción de variantes de la calmodulina (CaM) mediante mutagénesis sitio-
dirigida, sustituyendo uno o ambos residuos de tirosina (Y) por fenilalanina (F). La CaM silvestre (wt) y sus
formas mutadas fueron expresadas en Escherichia coli y purificadas con un alto rendimiento. Los mutantes
simples CaM(Y99F) y CaM(Y138F) presentaron una reducción significativa del pico de absorción a 276 nm con
respecto a la CaMwt. Este pico desapareció en el doble mutante CaM(Y99F/Y138F). Los tres mutantes
presentaron un cambio de movilidad electroforética inducida por Ca2+ característico de la CaMwt. No obstante,
esta movilidad fue ligeramente superior en los mutantes CaM(Y138F) y CaM(Y99F/Y138F), tanto en ausencia
como en presencia de Ca2+. Los tres mutantes presentaron actividad biológica, ya que activaron a la 3',5'-AMPc
fosfodiesterasa y a la Ca2+ATPasa. Utilizando Tb3+, un análogo fluorescente del Ca2+, demostramos que este ión
está más próximo a la Y99 que a la Y138 y que el Tb3+ presenta una ligera mayor afinidad por la CaM(Y138F)
que por la CaMwt. Las CaMs mutantes fueron fosforiladas por la tirosina quinasa c-p60src y el receptor del factor
de crecimiento epidérmico (EGFR), observándose una menor fosforilación de los mutantes simples con respecto a
la CaMwt, mientras el doble mutante no es fosforilado. Estas CaMs mutadas podrían ser de gran utilidad para
estudiar la funcionalidad de la fosfo(Y)CaM en la señalización celular.

La calmodulina (CaM) es una proteína ubicua, que
une calcio, actuando como un sensor intracelular de
este catión divalente en células eucariotas, la cual
modula una gran cantidad de funciones en el interior
celular (6,11). La CaM puede sufrir diferentes
modificaciones post-traduccionales, entre ellas, la
fosforilación por diversas proteína-serina/treonina y
proteín-tirosina quinasas. Esta fosforilación ocurre in
vitro e in vivo. Las diferentes CaMs fosforiladas (P-
CaMs) presentan diferentes actividades biológicas
cuando actúan sobres los distintos sistemas
dependientes de CaM (2) Se ha descrito la
fosforilación de CaM por receptores con actividad
tirosina quinasa, tales como el receptor de insulina
(IR) (8, 9) y el EGFR (3, 19); y por proteínas tirosina
quinasas no asociadas a receptores, tales como las
tirosina quinasas de la familia Src (7, 14), Jak2 (15), y
p38Syk (14). De manera que la fosforilación de la
CaM es un fenómeno ampliamente descrito. La CaM
de mamíferos contiene dos residuos tirosinas en
posiciones 99 y 138. Por lo tanto, la disponibilidad de
mutantes de CaM carentes de uno o ambos de estos
residuos podría ser una herramienta útil para dilucidar
el papel de cada una de estas tirosinas fosforiladas y
así como su efecto sobre las proteínas blanco. En este
trabajo describimos la caracterización de tres
mutantes de CaM, en los cuales se han cambiado las
tirosinas por fenilalanina, sustituciones que hemos
denotado como: CaM(Y99F), CaM(Y138F), y
CaM(Y99F/Y138F). Los resultados muestran
interesantes diferencias entre los mutantes, lo que
representa nuevos datos en la caracterización de la
CaM y por lo tanto de su interacción con diferentes
enzimas blanco.
La mutagénesis en el vector pETCM conteniendo la
secuencia de codificación de la CaM salvaje (CaMwt)
se realiza usando la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), con DNA polimerasa Pfu Turbo y
los siguientes oligonucleótidos complementarios:
5’GCTCTGCTGCACTGATGAAGCCATTGCCATCG-3’
(oligo99c), 5’GGATGGCAATGGCTTCATCAGTGCA
GCAGAGC-3’ (oligo 99) para el cambio de la tirosina
99 a fenilalanina; y 5’-GGGGATGGTCAGGTAAAC
TTCGAAGAGTTTGTACAAATG-3’ (oligo 138), 5’-
CATTTGTACAAACTCTTCGAAGTTTACCTGACCAT
CCCC-3’ (oligo 138c) para el cambio de la tirosina
138 a fenilalanina. Para obtener la doble substitución
Y99F/Y138F, se realizó una mutagénesis secuencial.

21
La cepa bacteriana E. coli BL21(DE3)pLysS
transformada con los vectores de expresión, fue
crecida en 800 ml de cultivo líquido LB, con
ampicilina 100 µg/ml y cloranfenicol 34 µg/ml, y la
expresión de las CaMs fue inducida con IPTG
(isopropil β-tiogalactopiranósido) 1mM. Se incuba el
cultivo a 37 oC, durante 3h y se procede a la
purificación de las CaMs según el método descrito en
(10).
El EGFR se aisló tomando ventaja de la propiedad
este receptor de unir CaM (13,19). Así, a partir de
membranas de hígado de rata se obtuvo una fracción
enriquecida en el receptor mediante cromatografía de
afinidad con CaM-agarosa, como fue descrito en (19).
Para fosforilar los mutantes de CaM por el EGFR,
los ensayos se realizan a 37 oC, durante 2 min, en un
volumen total de 100µl, en un medio que contiene:
Hepes-NaOH 15 mM (pH 7,4), MgCl2 5mM, EGTA
0,2-0,4 mM, glicerol 1-2 % p/v, Tritón X-100 0,2-0,4
% p/v, EGF cuando se añade: 1µM, CaM: 2µg,
histona: 12µg, 10 µM (2µCi) [γ-32P]ATP y 20-40µl
de fracción de la preparación de EGFR. La reacción
se inicia por la adición del ATP y se detiene mediante
la adición de TCA frío al 10%. Las proteínas
precipitadas, son procesadas para SDS-PAGE. Para
fosforilar con la tirosina quinasa c-Src, los ensayos se
realizan de manera similar, durante 20 min o más, en
100µl de un medio que contiene: Hepes-NaOH 15
mM (pH 7,4), MgCl2 5mM, EGTA 1mM, DTT
1mM, CaMwt o el respectivo mutante: 2 µg, histona:
2,4 µg, 10 µM (2µCi) [γ-32P]ATP y 1-2 unidades de
c-Src.
Para determinar la actividad de fosfodiesterasa de
cerebro de cerdo dependiente de CaM se utilizó
2.5mM AMPc como substrato y 8µg/ml de las
diferentes especies de CaM en ausencia y presencia
de 0.1mM Ca2+ libre (16). Fantasmas de eritrocito
humanos fueron obtenidos como se describe en (1) y
la actividad de Ca2+ATPasa en los fantasmas fue
determinada como se describe en (5).
Para la determinación de la afinidad por terbio de la
CaM recombinante wt y de los mutantes nos basamos
en el método descrito en (20). Brevemente, las
diferentes especies de CaM fueron ensayadas a una
concentración final de 10 µM en un buffer que
contiene: 10 mM Pipes (pH 6.5), 100 mM KCl y
diferentes concentraciones de TbCl3. La fluorescencia
de las tirosinas fue medida en un fluorímetro, usando
280 y 307 nm como longitudes de onda de excitación
y emisión respectivamente.
Las electroforesis en geles de poliacrilamida se
realizan según el método descrito en (12). El Western
blot fue descrito en (16). El anticuerpo primario es un
22
monoclonal anti-fosfotirosina (4G10) y el anticuerpo
secundario es anti-IgG conjugado con peroxidasa.
En cuanto a los resultados obtenidos, la expresión de
la CaMwt y las tres variantes de CaM en E. coli
BL21(DE3) pLysS, inducidas por IPTG, fue bastante
similar. Las cuatro variantes de CaM recombinantes
fueron purificadas a homogeneidad con un alto
rendimiento, mediante cromatografía de intercambio
hidrofóbico dependiente de calcio. A partir de 331 ±
30mg (n = 3) proteínas del extracto bacteriano, se
obtuvieron 35 ± 4mg (n = 4) de CaM purificada. Los
datos se expresan en promedio ± SEM. La Fig. 1,
muestra los mutantes purificados a homogeneidad.
Los mutantes CaM(Y138F) y CaM(Y99F/Y138F)
muestran una movilidad electroforética ligeramente
mayor que la CaMwt y CaM(Y99F) tanto en ausencia
como en presencia de Ca2+. Asimismo, los tres
mutantes presentan un cambio de movilidad
electroforética mayor en presencia de Ca2+,
característico de la CaM nativa (4).
+EGTA +Ca2+
PM
21.3
Figura 1: Movilidad electroforética de los mutantes.
Las diferentes CaMs recombinantes purificadas y un
control de CaM purificada de cerebro de bovino (2
µg), fueron procesadas para SDS-PAGE en un gel en
gradiente entre 5 al 20 % de acrilamida en presencia
de 5 mM EGTA o 5 mM CaCl2 .
También se observa aquí la doble banda de todas las
CaMs en presencia de Ca2+. La misma es una
característica bien documentada y podría deberse a la
migración diferencial de diversos complejos Ca2+-
CaM (18).
En el espectro de absorción en el ultravioleta
cercano, la CaMwt muestra un pico prominente a
276 nm, el cual se debe principalmente a la
presencia de los dos residuos tirosina (21). Como
se esperaba, en ambos mutantes CaM(Y99F) y
CaM(Y138F) que presentan una sola tirosina, este
pico presenta una disminución significativa en el
espectro y está totalmente ausente en el doble
mutante, tal como se muestra en la Fig. 2.

0.6
∆Absorbancia
0.5
(unidades
arbitrarias)
0.4
CaM(wt)
0.3
CaM(Y99F)
0.2
CaM(Y138F)
0.1
CaM(Y99F/Y138F)
0.0
240 280 320 360 400
Longitud de onda (nm)
Figura 2: Espectro de absorción de las CaMs
mutantes.
Se estudio la interacción del Tb3+ con los dominios
de unión de Ca2+ de los diferentes mutantes.
Tomando en cuenta el hecho de que los aminoácidos
Y99 y Y138 forman parte de la secuencia
involucrada en los dominios III y IV de unión de
Ca2+ respectivamente, se determinó la fluorescencia
de las tirosinas utilizando el Tb3+ como un sustituto
del Ca2+ (20), excitando a 280 nm y registrando la
emisión a 307 nm. Los resultados expresados como
el “quenching” relativo de fluorescencia de los
residuos “tirosina” inducido por el Tb3+ muestran un
aumento del “quenching”, el cual es dependiente de
la concentración de Tb3+ en el caso de las CaMwt y
CaM(Y138F). Por otra parte, las dos mutantes
modificadas en la Y99 no presentaron un cambio
significativo respecto al la concentración de Tb3+.
Estos resultados indican que el Tb3+, se encuentra
muy cercano a la Y99, pudiendo ocurrir
transferencia de energía de resonancia de la
fluorescencia (FRET) mientras que esto no ocurre en
la Y138. De hecho, se ha demostrado que la Y99
contribuye con la coordinación de los enlaces que
unen Ca2+ en este dominio, mientras que la Y138,
no.
Por otra parte, para analizar el efecto de las
sustituciones de las tirosinas por fenilalaninas, en la
actividad biológica de la CaM, se determinó la
capacidad de los mutantes para activar la
fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos dependiente de
CaM, utilizando AMPc como sustrato. Los resultados
muestran que todos los mutantes en concentraciones
saturantes, estimulan la actividad de la enzima en
23
presencia de Ca2+, al mismo nivel que la CaMwt y la
CaM de cerebro de bovino, usadas como controles.
Además, se determinó si los mutantes estimulan a la
Ca2+-ATPasa de membrana plasmática de eritrocitos
humanos, encontrándose que todos los mutantes
estimulan la actividad de la enzima. Curiosamente,
el doble mutante CaM(Y99F/ Y138F), fue mas
efectivo en estimular la actividad de Ca2+-ATPasa
que la CaMwt, ya que se produjo un incremento
significativamente estadístico en la Vmax con respecto
a las otras CaMs.
Para determinar el efecto de las diferentes mutaciones
en la fosforilación de la CaM por proteínas-tirosina
quinasas, se fosforilaron las mutantes mediante EGFR
y c-Src. Los resultados mostraron, que en presencia
de EGF, el EGFR es capaz de fosforilar a las
CaM(Y99F) y CaM(Y138F) pero no a la
CaM(Y99F/Y138F). Las CaMwt y CaM nativa
fueron utilizadas como controles. Estos resultados
fueron los mismos tanto para la fosforilación de las
CaMs con [γ-32P]ATP y su detección por
autorradiografía como para la fosforilación con ATP
no radiactivo y revelado por Western blot con un
anticuerpo anti-fosfo tirosina. La fosforilación de los
mutantes por c-Src, mostró resultados similares a los
obtenidos con el EGFR. Las formas fosforiladas,
tanto por el EGFR como por c-Src, de las CaMs
recombinantes, presentan el cambio de movilidad
electroforética inducido por Ca2+, característico de las
formas no fosforiladas.
En conclusión, los tres mutantes de CaM descritos
en este trabajo muestran el comportamiento
esperado para la mayoría de las propiedades físico-
químicas de CaM ensayadas (18). La disminución
del pico de absorción característico de CaM a 276
nm, en el espectro UV de las CaM mutantes y el
mantenimiento del cambio de movilidad
electroforética inducido por Ca2+, típico de la CaM
nativa, son características notables. Además, dichos
mutantes conservaron la actividad biológica de la
CaMwt, tal como lo demuestran la activación de la
fosfodiesterasa y de la Ca2+-ATPasa. (18). Es
interesante que el doble mutante CaM(Y99F/Y138F)
fue ligeramente más eficiente al estimular a la Ca2+-
ATPasa que la CaMwt. En contraste, se ha
reportado, un mutante de CaM de pollo, con una
sustitución en Y138 por fenilalanina, que tiene
afinidad más baja por la Ca2+-ATPasa que la CaM
nativa (17). Entre las propiedades de los mutantes
que se diferencian de la CaMwt, la más notoria es el
cambio de movilidad electroforética observado en
CaM(Y138F) y CaM(Y99F/Y138F), comparado con
CaMwt o CaM(Y99F). Dado que CaM mantiene
parte de su conformación nativa en SDS-PAGE (4),
la sustitución de Y138 pero no la de Y99, podría
afectar la estructura tridimensional de la CaM. El
papel de las dos tirosinas fosforiladas en la CaM, no
ha sido aún establecido. Los mutantes descritos aquí
podrían ser herramientas útiles para responder cual
es el rol que tiene cada residuo tirosina fosforilado
sobre la función de CaM en una variedad de
enzimas.
Agradecimientos
Financiado por la Comisión Interministerial de
Ciencia y Tecnología (SAF2002-03258), la
Consejería de Educación y Cultura de la Comunidad
de Madrid (08.1/0027/2001-1), y la Agencia
Española de Cooperación Internacional
(2002CN0013) a A.V., FONACIT, Venezuela (S1-
1999000058 y G-2001000637 a G.B.) y CDCH-
UCV (PI-03-10-4798-01) a G.B y el Programa de
Cooperación con Ibero América a A.V. y G.B. V.S.
fue becada por el Consejo de Desarrollo Científico y
Humanístico de la U.C.V.
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