Exposición biotecnología:

1. Cepa de Azospirillum brasilense spp:

1.1. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA:
1. Extraer muestras de la rizosfera (10cm de profundidad) de plantacion de caña de azúcar
2. Lavar con agua destilada
3. Sembrar en matraces con caldo NFb libre de nitrógeno y con malato (fuente de carbono)
NFB: semigelificado "libre" de nitrógeno y con malato como fuente de carbono (52). No obstante, en este medio de
cultivo son aisladas predominantemente cepas de las especies A. lipoferum y A. brasilense.
4. Incubar a 33ºC en estufa de cultivo hasta observar el desarrollo de una película blanca, densa y ondulada por
debajo de la superficie
5. Extraer 1mL de la pelicula
6. Realizar diluciones seriadas al décimo con solución fisiológica (CINa, 0.85%), hasta llegar a una dilución de 10 -4
y 10-5 del cultivo original
Una dilución en serie es la reducción progresiva, paso a paso, de la concentración de una sustancia en disolución.1
Por lo general, el factor de dilución en cada paso es constante, lo que da como resultado una progresión
geométrica de la concentración, en forma logarítmica. Las diluciones en serie se utilizan para crear disoluciones
muy diluidas con precisión, así como disoluciones para experimentos en los que se pretenda estudiar curvas de
concentración con una escala logarítmica. Las diluciones en serie son ampliamente utilizadas en las ciencias
experimentales, incluyendo bioquímica, química, farmacología, microbiología y física.

SOLUCION FISIOLÓGICA
Se puede utilizar un diluyente isotónico para diluir las células bacterianas con el fin de proporcionar una
concentración adecuada para observación al microscopio, determinar recuentos de células, analizar propiedades
genéticas o metabólicas, lavar las células en preparación para su estudio o preparar inóculos normalizados
La solución salina se utiliza de manera sistemática como diluyente para ajustar la turbidez de las suspensiones de
células bacterianas y así mantener la integridad y viabilidad de las células.

7. Sembrar las diluciones en agar rojo Congo ácido málico a 33ºC por un periodo de 96 h
*Se considerarán muestras positivas aquellas colonias aisladas, rojas escarlatas, con abundante crecimiento,
consistencia seca, superficie rugosa y borde irregular

1.2. SELECCIÓN DE LAS CEPAS AZOSPIRILLUM BRASILENSE SPP (Cárdenas et al.,2010)

1.2.1. PRODUCCIÓN DE SUSTANCIAS INDÓLICAS (Cárdenas et al.,2010)
El indol es un compuesto orgánico heterocíclico, con estructura bicíclica que consiste en un anillo de seis miembros
(benceno) unido a otro de cinco miembros (pirrol). La participación de un par aislado
de electrones de nitrógeno en anillo aromático refieren a que el indol no es una base y no representa
una amina simple.Es sólido a temperatura ambiente. Ayuda en el crecimiento de las plantas, en especial
alcaloides indólicos
1. Replicar las cepas en Agar Rojo Congo para obtener suspensiones celulares ajustadas a una concentración celular
de 1*107 UFC/mL (UFC= Unidades Formadoras de Colonias) Muy simplificada es la reproducción bacteriana o
fúngica en agua durante un tiempo

2. Inocular 30 mL de caldo DYGS al 2%

3. Incubar a 32ºC y 120 rpm durante 48 h.

4. Centrifugar la biomasa obtenida a 8000 rpm durante 10 minutos.
5. Descartar el sobrenadante
6. Las células son suspendidas en 30 mL de buffer fosfato estéril 0,06 M y pH 7
El buffer de fosfatos, BPS o buffer fosfato salino es una solución amortiguadora e isotónica, cuya función es
mantener el pH y la presión osmótica lo más parecido al ambiente biológico natural (fisiológico).
Si las células son trasladadas a un medio hipertónico (es aquella que tiene mayor osmolaridad en el medio externo,
por lo que una célula en dicha solución pierde agua (H2O) debido a la diferencia de presión, es decir, a la presión
osmótica, llegando incluso a morir por deshidratación) se deshidratarán, ya que el gradiente de agua se transportará
al lado donde hay mayor concentración de solutos. Si por el contrario se colocan células en un medio hipotónico(es
aquella que tiene menor concentración de soluto en el medio exterior en relación al medio interior de la célula, es
decir, en el interior de la célula hay una cantidad de sal mayor que se le encuentran en el medio en la que ella
habita), las células absorberán líquido hasta lisarse.
Es por ello que se utiliza el buffer PBS para protocolos de laboratorio que requieren el mantenimiento de células in
vitro, de esta manera las células no se dañarán.

7. Se toman 100 mL de la suspensión celular y se inoculan en 50 mL de caldo NFb sin azul de Bromotimol y
solución de vitaminas, con una concentración de 200 mM de triptófano (precursor del ácido indolacético) y 0,2 g/L
de NH4Cl (cloruro de amonio) (fuente de N).
l azul de bromotimol (BTB, a partir de su nombre en idioma inglés bromothymol blue) es un indicador de pH que
en solución ácida presenta un color amarillo, en solución básica presenta un azul y en solución neutra presenta un
color verde.
El azul de bromotimol actúa como un ácido débil en solución. Por lo tanto puede presentarse en su
forma protonada o deprotonada, amarilla y azul, respectivamente.
El precursor de la forma activa de la auxina, el ácido indolacético (IAA) proviene del aminoácido L-triptófano; el
grupo indol permanece constante, pero para alcanzar la forma de ácido indol-acético debe sufrir una
descarboxilación y una desaminación. Esto puede ocurrir por dos vías.
La primera se da en todas las plantas superiores; el L-triptófano transfiere su grupo amino a una molécula de 2-
oxoglutarato, dando glutamato e indol-piruvato-indol-piruvato es una molécula muy inestable que no tarda en
descarboxilarse. El producto de esta hormona es el crecimiento.
Las auxinas son fitohormonas producidas o sintetizadas en el ápice del tallo.

8. Incubar en oscuridad por 48 h, 120 rpm y 32ºC

9. Centrifugar 10 mL del cultivo a 8000 rpm por 10 minutos
10. Tomar 2 mL del sobrenadante y adicionarle 8 mL de reactivo de Salkowsky
El reactivo de Salkowski empleado en el método colorimétrico permite la oxidación del compuestos indólicos por
sales férricas >24@; cuando la respuesta es positiva se obtiene una coloración rosada que va desde el rosa claro a
intenso dependiendo la concentración del ácido indol acético presente
11. Realizar la lectura de la absorbancia de las muestras a 535 nm en un espectrofotómetro
*La concentración de compuestos indólicos se calcula utilizando la ecuación de la curva de calibración en diferentes
concentraciones de ácido indolacético (25, 50, 100,150, 200, 250 y 300 µM) con la adición del reactivo de
Salkowsky

1.2.2. CUANTIFICACIÓN DEL A FIGACIÓN BIOLÓGICA DE NITRÓGENO(Cárdenas et al.,2010)

1. Los aislamientos se inoculan en frascos de 10 mL con 3 mL de (NFb) y se incubarán durante 24 horas a 32ºC
2. Reemplazar el tapón por uno de caucho sellándolo herméticamente, se sustituye el 10% de su atmósfera por
acetileno y se incuba durante 1 hora a 32ºC
Supuestas las necesidades de agua cubiertas, el nitrógeno es el factor limitante más importante para el
desarrollo de las plantas que lo necesitan para formar proteínas, ácidos nucléicos, etc
Por un lado, la introducción para su detección y medida de la técnica de la reducción de acetileno a etileno
(ARA), basada en la capacidad de la nitrogenasa de reducir compuestos de triple enlace (algo sobre
evolución) y, por otro, la aplicación a las investigaciones en curso de las herramientas propias de la biología
molecular.
La determinación de ARA permitió hacer medidas de la actividad enzimática fidedignas con un simple
cromatógrafo de gases, eliminando la nunca precisa observación del crecimiento bacteriano en medios de
cultivo libres de nitrógeno o la poco asequible espectrometría de masas para determinar la incorporación
de 15N2. Esta última técnica es muy usada en los experimentos que se realizan para conocer el nitrógeno de la
planta que procede de la atmósfera o del suelo y/o fertilizante aplicado, especialmente en ensayos de campo.

3. El etileno se mide inyectando 1 mL de la atmósfera del frasco de cultivo en un cromatógrafo de gases con
detector de ionización de llama y una columna Poropak
*La actividad de reducción de acetileno se calcula según la altura del pico de etileno en el cromatograma,
extrapolando la ecuación obtenida de la regresión lineal de una curva de calibración en concentraciones de etileno de
1, 1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10 000, en las mismas condiciones del cromatógrafo

1.2.3. IDENTIFICACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS POR MEDIO DEL ANÁLISISDEL GEL 16S(Cárdenas et
al.,2010)
1. Las cepas seleccionadas serán cultivadas en caldo LB por 14 h a 150 rpm y 30ºC
El Caldo de Lisogenia (abreviado LB en inglés) es un medio nutricionalmente rico que se utiliza principalmente
para el cultivo de bacterias.

2. Tomar 25µL y mantener en baño termostatado durante 15 minutos

El baño termostatico se utiliza habitualmente para atemperar los medios de cultivos, bufferes, etc…. a una
temperatura constante de 37ºC para su uso en cultivo celular.
3. Centrifugar a 13000 rpm por 1 min
4. Descartar el sobrenadante
5. Resuspender el precipitado en 1mL de agua Milli-Q estéril
El agua milliQ es ultra pura, grado molecular sin nada que afecte los estudios ni interfiera con los ensayos.
Lo qué pasa es que la sesión usada es muy agresiva con mérales incluso los inoxidables, por eso debe almacenarse
en plástico o vidrio, la milliQ solo se recomienda almacenar en vidrio aunque podría en metálico ya que no tiene
nada de nada
6. Amplificación de 16rRNA:
7. Mezcla de 25µL de Buffer (1x), MgSO4 (1,5 mM), dNTP (0,2 mM), Primer 27F (Edwards et al., 1989) y 1492R
(0,2 mM) (Weisburg et al., 1991), 0,25µL de Taq DNA Polimerasa y 1,5µL de DNA molde (muestra del
aislamiento).
MgCl2 es un cofactor para la enzima Taq y también ayuda a corregir los DNTP correctos
complementarios a la secuencia en la cadena de nueva síntesis al unirse a los DNTP. por lo tanto, es
importante mantener una concentración equilibrada tanto en la mezcla de reacción para una
amplificación efectiva.

8. Condiciones del termociclador: Un ciclo inicial de denaturación (94ºC por 5 min), 50 ciclos de denaturación
(94ºC por 30 seg), anillaje (66ºC por 30 seg) y extensión (72ºC por 1 min) y tres ciclos de extensión final (72ºC por
10 min).
9. Usar electroforésis en gel de agarosa al 0,8% en TAE acondicionado con 0,5 µg/mL de bromuro de etidio
(visualizar las bandas resultantes en fragmentos amplificados)
El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante (se intercala entre las bases nitrogenadas) que se usa como
colorante fluorescente para la visualización de ácidos nucleicos en geles de agarosa y poliacrilamida.
10. Purificar ADN amplificado utilizando QIAquick PCP Purification Kit Protocol,
 Este kit puede purificar directamente productos de PCR de doble o simple cadena (100 pb-10 kb) y el lavado de
ADN proveniente de otras reacciones enzimáticas con un rendimiento de hasta 10 ug y una recuperación de 90-
95%. El sistema QIAquick combina la ventaja de la tecnología de columnas de centrifugado con las propiedades de
unión selectiva de una membrana de sílica con un diseño único. En presencia de altas concentraciones de sales el
ADN se adsorbe a la membrana de sílica mientras que los contaminantes no son retenidos. Las impurezas son
lavadas eficientemente, y el ADN puro se eluye con búfer Tris o agua. 
VENTAJAS:
Permite un lavado rápido. Produce ADN purificado para realizar restricción, marcado, hibridización, PCR, ligado y
transformación, secuenciación fluorescente y radioactiva, transcripción in vitro, o microinyección.
 11. Cuantificar en NanoDrop Spectrophotometer ND-1000
Es un espectrofotómetro de espectro total (220-750nm) que mide concentraciones con 1 µl
de muestra, con gran exactitud y reproductibilidad. Utiliza una nueva tecnología que usa la
tensión superficial para mantener la muestra en su sitio y se eliminan las cubetas de
mesura. Además, el ND-1000 tiene la capacidad de medir muestras muy concentradas, sin
necesidad de diluirlas (acepta 50X más de concentración que las medidas estándars con
cubetas).

12. Analizar en el programa ND-1000 V.3.3.0. a una longitud de onda de 260 nm.
13. El producto amplificado se secuencia en un equipo ABI PRISM Genetic Analyzer (realiza la secuenciación
automática de fragmentos de DNA marcados con fluorocromos. El resultado se analiza a través de BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool) para confirmar que sea Azospirillum brasilense spp