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Raquel Callejón
1. INTRODUCCIÓN 1
1.1. EL VINAGRE 1
1.1.1. Tipos de vinagre 1
1.1.2. Historia 2
1.1.3. Las bacterias acéticas 2
1.1.4. Métodos de elaboración de vinagre 6
1.1.4.1. Métodos tradicionales de acetificación con cultivo
superficial 6
1.1.4.2. Métodos de acetificación con cultivo sumergido 11
2. MATERIALES Y MÉTODOS 31
2.1. MATERIAL 31
2.1.1. Muestras 31
2.1.2. Reactivos 32
2.1.3. Instrumentación 34
2.1.3.1. Cromatógrafo líquido de alta eficacia 34
2.1.3.2. Instrumentación y material 34
2.2. MÉTODOS 35
2.2.1. Preparación de las fases móviles 35
2.2.2. Condiciones cromatográficas 35
2.2.3. Preparación de patrones 36
2.2.4. Preparación de muestras 38
2.2.5. Reacción de derivatización 38
2.2.6. Identificación 39
2.2.7. Cuantificación 40
2.2.8. Límites de detección y cuantificación 41
2.2.9. Estudios de precisión 42
2.2.10. Estudios de recuperación 43
2.2.11. Estudios de dilución de las muestras 44
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 45
4. CONCLUSIONES 62
5. BIBLIOGRAFÍA 64
6. ANEXO 71
Introducción
1. INTRODUCCIÓN
1.1. EL VINAGRE
1
Introducción
1.1.2. Historia
En 1732, el holandés Boerhaave hace notar que la llamada “madre del vinagre”
es un organismo vivo, aunque sin precisar su papel en la acetificación. Lavoisier
demuestra que la acetificación consiste en la oxidación de etanol, pero sin sospechar la
existencia de bacterias acéticas. Persono, (1822) describe las películas grasas que se
forman en la superficie del vino, la cerveza o el vinagre como sustancias de naturaleza
vegetal, y en la “Micología europea” añade nuevas especies de Micoderma: ollare,
mesentericum, lagenoe y pergameneum. También Chaptal había observado que la
producción de vinagre va bien cuando en la superficie del vino aparecen las llamadas
“flores de vino”, cuya aparición anuncia y precede a la acetificación, pero sobre esto
Berzelius advertía que en todas las materias orgánicas en descomposición, expuestas al
aire aparece el mismo tipo de vegetación. La acetificación también llega a formar parte
de la controversia entre químicos como Berzelius y Liebig quienes mantienen que el
proceso era puramente químico (Berzelius 1829-1833) y aquellos que afirmaban que en
dicha transformación intervenía un “ser organizado”. En cuanto a la ”madre del
vinagre”, Kützing observó que la débil película que recubre la superficie del líquido
acidificado está formada por glóbulos seis veces más pequeños que los de las levaduras;
se trataba de bacterias acéticas que fueron observadas al microscopio por primera vez
por Kützing (1837) por lo que, en las primeras clasificaciones taxonómicas de estos
microorganismos, se denominó Acetobacter kützingianum a una especie de ellos
(Llaguno, 1991).
Las bacterias acéticas fueron observadas por primera vez al microscopio por
Kützing en 1837. Estas bacterias constituyen un grupo ecológico que comprende
bacterias gram-negativas (gram-positivas en cultivos viejos), aerobias estrictas y muy
sensibles al SO2. Son catalasa positiva y oxidasa negativa, pueden presentar
pigmentación en cultivos sólidos y producir diferentes tipos de polisacáridos (De Ley et
al., 1984).
2
Introducción
Etanol
2H NAD+ Cit Cit O2
Acetaldehído
2H
Acetato
3
Introducción
Durante largo tiempo se aceptó que las bacterias acéticas móviles, pertenecientes
al género Acetobacter, tenían flagelos polares monotricos, y dicho género estaba
incluido por lo tanto en la familia Pseudomonodaceae. Sin embargo, Leifson (1954)
descubrió que 30 cepas de Acetobacter no mostraban este tipo de flagelos, poniendo de
manifiesto otro tipo de disposición de flagelos: flagelación perítrica. Propuso entonces
separar Acetobacter en dos géneros: Acetobacter y Acetomonas género nov., incluyendo
en este último las especies con flagelos polares multitricos y las no flageladas, todas
incapaces de oxidar el acetato y el lactato a CO2 y H2O.
4
Introducción
Tabla 1.1. Géneros y especies de bacterias acéticas descritos según Yamada, 2003.
5
Introducción
a) Método de Orleáns
Es uno de los métodos más antiguos para fabricar vinagres. Emplea toneles de
aproximadamente 250-300 litros de capacidad, que se colocan tumbados en filas
horizontales y superpuestas, provistos de 2 agujeros de aproximadamente 5 cm en cada
extremo de los fondos de cada barril a 2/3 de la altura del fondo, que se rellenan con
6
Introducción
estopa para evitar la entrada de las moscas del vinagre, pero que dejan pasar aire
(Figura 1.2).
Figura 1.2. Pilas de botas para la acetificación en una fábrica de vinagre por el método de Orleáns.
Además, en el lateral superior se hace otro orificio que se tapa con un tapón de
corcho por donde penetra un tubo de vidrio, recto, que llega casi hasta el fondo del
líquido permitiendo renovar el sustrato sin alterar el velo bacteriano situado en la
superficie (Figura 1.3). Se trata de un procedimiento estático donde el líquido a
acetificar es una mezcla de vino de bajo grado alcohólico con un 20% de vinagre turbio.
Los rendimientos de la transformación de etanol en acético son bajos y el proceso dura
de 8 a 10 días una vez comenzada la acetificación, la velocidad depende de la
temperatura, ya que la temperatura de 30 ºC es la óptima para el crecimiento de la
bacteria acética.
7
Introducción
Indicador
de nivel
Grifo
b) Método Luxemburgués
La cuba giratoria más elemental (Figura 1.4) se prepara con un orificio grande
en el centro de uno de los fondos, para procurar la entrada de aire. En uno de los
costados de esta cuba, en la parte más alejada de la abertura, se practica un orificio
estrecho, que puede obturarse con un tapón; es una canilla de madera o vidrio para
vaciado del envase. El tonel está dividido en dos partes desiguales por un falso fondo,
agujereado, con numerosos y finos orificios. La parte menor del tonel está llena de
virutas de haya. En este compartimento penetra un largo termómetro para controlar la
temperatura, aspecto muy interesante para todo método rápido o semirrápido. Se
obtienen cantidades de vinagre, que pueden llegar como máximo, cada cuarenta y ocho
horas, a la cuarta parte del contenido de un tonel. El vinagre elaborado, que se extrae de
las cubas, se sustituye por porciones iguales de vino, continuando la elaboración
indefinidamente (Xandri-Tagüeña, 1977).
8
Introducción
9
Introducción
X X
Y Y
10
Introducción
Modelos Frings
11
Introducción
12
Introducción
13
Introducción
Por otro lado, ya que las levaduras juegan un importante papel en el contenido
de aminoácidos en el vino, otra de las aplicaciones ha sido el estudio de la influencia de
diferentes cepas de levadura sobre los cambios que sufren los aminoácidos, péptidos y
proteínas durante el envejecimiento del cava (Martínez-Rodríguez et al., 2002). En este
estudio se utilizó el mismo vino base y cinco cepas de levaduras. Con los datos
obtenidos se dedujo que los cambios que se producen en el proceso de envejecimiento
del cava ocurren en al menos cuatro fases claramente diferenciadas y además se observó
que el empleo de una cepa de levadura u otra influye en el contenido de aminoácidos
libres y péptidos.
14
Introducción
de aminoácidos con el objeto de determinar la cepa más adecuada para inocular los
mostos de esta región.
15
Introducción
16
Introducción
Las fases móviles más utilizadas en fase reversa son mezclas de agua y un
disolvente orgánico (metanol, acetonitrilo, o tetrahidrofurano, normalmente). Cuando la
muestra tiene sustancias que contienen grupos ácidos o básicos débiles, como son los
aminoácidos, se recurre al control del pH de la fase móvil mediante un tampón (Cáceres
et al., 1986).
17
Introducción
d) Electroforesis capilar
18
Introducción
19
Introducción
20
Introducción
a) Ninhidrina
b) Cloruro de dansilo
21
Introducción
c) Cloruro de dabsilo
Los derivados obtenidos con el cloruro de dabsilo tienen una absorción máxima
a 420 nm (región visible), son altamente estables y son rápidamente separados y
detectados a niveles de picomoles. Los derivados se mantienen perfectamente estables
durante cuatro semanas a temperatura ambiente.
Una limitación del método es que la presencia de una excesiva cantidad de sal,
urea, fosfato, o bicarbonato amónico alterará el pH del tampón e interferirá en la
reacción de dabsilación.
Krause et al. (1995) propusieron el uso del cloruro de dabsilo como un método
alternativo al análisis convencional de aminoácidos y aminas biógenas en alimentos y
muestras biológicas, logrando separar más de cuarenta compuestos simultáneamente.
d) Dinitrofluorobenceno
22
Introducción
e) Fenilisotiocianato
f) Ortoftaldehido
23
Introducción
Por otro lado, el OPA no reacciona con grupos amino secundarios, por tanto, si
queremos determinar prolina e hidroxiprolina simultáneamente con el resto de los
aminoácidos, hay que recurrir a una oxidación con hipoclorito sódico que rompe el
anillo y los convierte en aminoácidos primarios. Otra alternativa es utilizar OPA con
otro agente que permita derivatizar los aminoácidos secundarios. Algunos autores
usaron una doble derivatización con ortoftaldehído y 9-fluorenilmetil cloroformato para
determinar los aminoácidos primarios y secundarios en mostos y vinos (Herbert et al.,
2000; Martínez-Rodríguez et al., 2002). Pripis-Nicolau et al. (2001) desarrollaron un
método para determinar la cisteína y otros aminoácidos en mostos y vinos utilizando
una derivatización previa con ácido iodoacético (IDA) seguida de otra con OPA.
Los derivados también se pueden detectar en ultravioleta a 330 nm, pero para
una mayor sensibilidad, se utiliza con preferencia la detección por fluorescencia, cuya
emisión se mide a una λ de 430 nm.
g) 9-Fluorenilmetil cloroformato
24
Introducción
pueden eliminar sin que se pierdan los aminoácidos derivados mediante una extracción
líquido-líquido. Otra método alternativo para evitar la interferencia del FMOC-OH es
que el exceso de FMOC reaccione con una amina muy hidrofóbica para formar un
derivado que eluya después de los picos de interés (White y Hart, 1992a).
h) Etoximetilenmalonato de dietilo
Los límites de detección están por debajo de 0.4 mg/L entre los aminoácidos, y
de 0.07 mg/L entre las aminas biógenas. Con otros agentes se han conseguido límites de
detección más bajos por lo que este reactivo se debe usar cuando no se requiera una
sensibilidad por debajo de picomoles. Otro inconveniente es el tiempo de
derivatización, ya que con otros agentes se consiguen procesos de derivatización más
cortos (Alaiz et al., 1992).
25
Introducción
i) 6-Aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato
H O R1
N O
N + HN
O R2
N O
AQC Aminoácido 1º y 2º
R1 O
H
HO
N N N
+
O R2
N O
26
Introducción
O
NH O
N
+ H2O
O
N O
AQC
O
NH2
HO
+ N + CO2
N
O
AMQ NHS
Este método ha sido optimizado para su uso con un detector de fluorescencia con
el fin de lograr límites de detección de 50-300 fentomoles para los aminoácidos
existentes en péptidos e hidrolizados de proteínas (Hernández-Orte et al., 2003).
27
Introducción
de lisina, pero es bien notorio con el triptófano. En este caso la sensibilidad del método
se ve ampliamente favorecida por el uso de un detector UV.
Tanto el análisis de muestras con triptofano, como el análisis de aminoácidos libres en
una solución intravenosa, puede ser eficazmente realizado usando ambos detectores en
serie, primero el de fluorescencia para la mayoría de los aminoácidos y luego el detector
UV para el triptofano.
Mec
Reactivo Derivatiz. Tipo detec. Ventajas Inconvenientes
separación
-No reproducible en
cantidades menores a 100
-Reaciona con aa
picomoles
primarios y secundarios
Ninhid Postcolumna
Intercambio
iónico
UV
-Problemas de
interferencias con la
rinaa -Capaz de detectar
picomoles
matriz
-Sensible a la luz, O2,
cambios Tª y pH
-Reacciona con aa
-El exceso de reactivo
primarios y secundarios
interfiere en el cromatog.
-Capaz de detectar
-Los derivados son
picomoles o fentomoles
fotosensibles
Precolumna Fluorescencia -Derivados estables a la
DNS- -Reacción lenta
y Fase reversa hidrólisis
-His forma picos
Cla b Postcolumna UV -Buena reproducibilidad
múltiples
para todos aa menos para
-No es específico y
His
reacciona con otros
-Muy adecuado para
compuestos
determinar Cys
-Reacciona con aa -El exceso de reactivo
primarios y secundarios. interfiere en el cromatog.
-Derivados muy estables -Las sales y detergentes
DABS-CL Precolumna Fase reversa Visible (4 semanas a Tª presentes en las muestras
ambiente) interfieren
-Capaz de detectar -Produce múltiples
picomoles derivados
-Reacciona con aa
-Los derivados son
primarios y secundarios
fotosensibles
-Capaz de detectar bajos
Precolumna Fase reversa Fluorescencia -Reacción muy lenta.
DNFB niveles de picomoles
-Método destructivo para
-Determina aa que otros
péptidos
agentes resuelven peor
a b
Aplicado en muestras de vino Aplicado en muestras de vinagre
28
Introducción
Mec
Reactivo Derivatiz. Tipo detec. Ventajas Inconvenientes
separación
-Problemas de
interferencias con la
-Reacciona con aa
matriz en el análisis de
primarios y secundarios.
mostos
-Determina Prolina e
-No adecuado para su
Hidroxiprolina con una
automatozación
sensibilidad de picomoles
-Sensibilidad menor a
-Reacción rápida
PITCa b Precolumna Fase reversa UV otros métodos (50 veces
-Forma derivados más
menor que OPA y
estables que otros
FMOC)
reactivos
-El reactivo se puede usar
-El proceso es lento
en exceso porque no
porque necesita un paso
interfiere
de evaporación a
sequedad
-Los derivados son
inestables
-El reactivo se puede usar
-No reacciona con aa
en exceso porque no
secundarios (prolina)
Fase reversa interfiere
-Necesita una completa
Precolumna y Fluorescencia -Reacción rápida
automatización de la
OPAa b y Cromatg. -Derivados altamente
reacción
Postcolumna Intercambio UV fluorescentes
-Respuesta de la
iónico -10 veces más sensible
Lys,Hidroxilisina y Cys
que reacción con
baja
Ninhidrina
-Derivados se
descomponen
-Reacciona con aa -Produce múltiples
primarios y secundarios derivados
-Reacción rápida (30 -El reactivo es por sí
segundos) mismo fluorescente e
FMOCa Precolumna Fase reversa Fluorescencia
-Derivados estables y interfiere en el cromatog.
altamente fluorescentes -El Proceso de derivatiz.
-Muy sensible es lento ya que se tiene
que eliminar el reactivo
-Reacciona con
-Proceso de
aminoácidos primarios y
derivatización lento
secundarios
-Inestablilidad de los
-Derivatización directa
derivados de prolina e
EMMDE Precolumna Fase reversa UV-Visible sin previa preparación
hidroxiprolina
-El exceso de reactivo no
-No sensible a niveles
interfiere
inferiores a picomoles
-Sensibilidad de
picomoles
-El exceso de reactivo no
interfiere
-Reacciona con aa
-Lys y Trp muestran una
primarios y secundarios
menor fluorescencia por
-Derivados estables y
el llamado “quenching
altamente fluorescentes
Fluorescencia interno”
-Muy sensible (50-300
AQCa Precolumna Fase reversa -Si el amonio no se
fentomoles)
UV derivatiza totalmente, el
-Reacción rápida
exceso de éste puede
-Derivados se inyectan
distorsionar el análisis de
sin previa preparación de
Arg y Thr
la muestra
-Las sales y detergentes
de muestras no interfieren
a b
Aplicado en muestras de vino Aplicado en muestras de vinagre
29
Introducción
Cada uno de los métodos tiene sus propias ventajas e inconvenientes. El criterio
predominante que influirá en la selección de la derivatización y en los procedimientos
de CL son la resolución, la sensibilidad y la velocidad.
Hasta ahora los agentes derivatizantes que se han aplicado para la determinación
de aminoácidos en vinagres ha sido cloruro de dansilo, fenilisotiocianato y
ortoftaldehído. El ortoftaldehído es el más utilizado para la determinación de
aminoácidos tanto en muestras de vino como de vinagre, sin embargo, lo descartamos
ya que no reacciona con la prolina, que es uno de los aminoácidos más abundantes en
las muestras de vinagre. Además, los derivados que se obtienen son inestables. Los
otros dos agentes (cloruro de dansilo y fenilisotiocianato), también se descartaron ya
que se ha visto que dan problemas de interferencias con la matriz y el proceso de
derivatización es lento. Otro de los motivos por lo que se descartó el cloruro de dansilo
fue la fotosensibilidad de los derivados.
30
Materiales y Métodos
2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. MATERIAL
2.1.1 Muestras
X indica el vino del que proviene el vinagre, por tanto, tomará los dos posibles
valores:
Se han seguido seis acetificaciones por cada sustrato que se indican con los
dígitos YZ. Las acetificaciones de cada sustrato se llevaron a cabo en seis barricas de 60
L de capacidad que se llenaron con un total de 40 L. Estas barricas presentan diferencias
en cuanto a sus características de madera (indicado con la letra Y) y tonelería (indicado
con la letra Z). Las acetificaciones duraron entre 1.5 - 2.5 meses para las muestras del
sustrato vínico F y entre 5 - 9 meses para las del sustrato vínico T.
31
Materiales y Métodos
2.1.2. Reactivos
b) Sustancias patrón
32
Materiales y Métodos
Aminoácido Proveedor
Referencia
c) Otros Reactivos
33
Materiales y Métodos
Reactivo
Proveedor Referencia
2.1.3. Instrumentación
- Columna de sílice Luna C18 en fase reversa, tamaño de partícula 5µm, 250 x
4.6 mm “Phenomenex” (Torrance, CA, USA) (Distribuida por Jasco Analítica
SPAIN, Madrid).
34
Materiales y Métodos
2.2. MÉTODOS
35
Materiales y Métodos
Tiempo (min) %A %B %C %D
0 0 0 0 100
20 0 0 0 100
22 0 0 100 0
25 0 31 69 0
28 0 34 66 0
44 0 57 43 0
64 0 100 0 0
84 100 0 0 0
94 0 0 0 100
36
Materiales y Métodos
volumen final de 25 mL. Para algunos aminoácidos fue necesaria la adición de ácido
clorhídrico o amoniaco para su completa disolución como se indica en la Tabla 2.5.
* a
Concentración de amonio Se añadió ácido clorhídrico al 32% hasta disolución
** b
Concentración de ornitina Se añadió amoniaco al 25%hasta disolución
37
Materiales y Métodos
una temperatura entre 4 y 8ºC y los más inestables (cisteina, metionina, triptófano,
ornitina, tirosina y amonio) a –20ºC.
Antes de la derivatización, se procedió del siguiente modo, tanto para disoluciones de estándares, como
para muestras:
- Se tomaron 50 µL de α-ABA (PI) de la disolución “Patrón 2” (64.45 mg/L), 125 µL bien de las
disoluciones estándares o de las muestras diluidas y se añadió agua Milli-Q hasta un volumen final de 2.5
mL. A esta disolución se le denominó “mezcla prederivatización”.
38
Materiales y Métodos
60 µL tampón borato
20 µL AQC
Mezcla
Prederivatización
Inyectan 20 µL
20 µL
55ºC-10 min
2.2.6. Identificación
39
Materiales y Métodos
Tiempo de
Tiempo de retención relativo
retención
AMQ* 23.784 0.442
Ac Aspártico(Asp) 30.414 0.566
Asparagina (Asn) 31.566 0.588
Serina (Ser) 32.938 0.613
Ac Glutámico(Glu) 34.599 0.643
Histidina (His) 34.863 0.648
Glutamina (Gln) 35.578 0.662
Glicina (Gly) 35.914 0.668
Arginina (Arg) 38.610 0.718
+
Amonio (NH4 ) 39.881 0.742
Treonina (Thr) 41.453 0.771
Alanina (Ala) 43.773 0.814
Prolina (Pro) 47.865 0.890
Ac γ-Aminobutírico (GABA) 49.809 0.925
Ácido α-Aminobutírico (PI) 53.772 1.000
Cisteina (Cys) 57.716 1.073
Tirosina (Tyr) 60.323 1.122
Valina (Val) 64.239 1.195
Metionina (Met) 65.736 1.222
Ornitina (Orn) 67.124 1.248
Lisina (Lys) 69.727 1.297
Isoleucina (Ileu) 75.565 1.405
Leucina (Leu) 76.346 1.420
Fenilalanina (Phe) 77.165 1.435
Triptófano (Trp) 77.883 1.448
*
AMQ: derivado de la hidrólisis del reactivo AQC que tiene lugar durante la reacción de derivatización
(Figura 1.8 de “Introducción”)
2.2.7. Cuantificación
40
Materiales y Métodos
Como se señaló en el apartado 2.2.3, para realizar las rectas de calibrado de los
aminoácidos se tomaron diferentes volúmenes de la mezcla “patrón 3”, cuyas
concentraciones se muestran en la Tabla 3.2 del apartado 3.2.2 de “Resultados y
Discusión”. Para el caso del ión amonio y debido a que los estándares de aminoácidos
contienen como impureza ión amonio, se preparó de forma independiente una
disolución “patrón 3” que contenía sólo dicho compuesto, a partir de la cual, tomando
diferentes volúmenes, se construyó la recta de calibrado del amonio.
41
Materiales y Métodos
% CV = (s/x) × 100
Para los estudios de precisión se utilizó una muestra de vinagre diluida al 15%
enriquecida con una concentración de 250 µg/L de cada patrón .
a) Repetitividad
42
Materiales y Métodos
b) Precisión intermedia
43
Materiales y Métodos
Dada la elevada sensibilidad del método fue necesario diluir las muestras. Con objeto de
determinar la dilución óptima de las mismas se realizaron diferentes diluciones en agua
tanto para vino como vinagre: 5, 15, 25, 35 y 50%.
44
Resultados y Discusión
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Figura 3.1. Cromatograma de una disolución de patrones en las condiciones óptimas del
método. R: AMQ (Producto de la hidrólisis del reactivo); 1: Asp; 2: Asn; 3: Ser; 4: Glu; 5: His; 6: Gln;
7: Gly; 8: Arg; 9: Amonio; 10: Thr; 11: Ala; 12: Pro; 13: GABA; 14: Cys; 15: Tyr; 16: Val; 17: Met; 18:
Orn; 19: Lys; 20: Ileu; 21: Leu; 22: Phe; 23: Trp.
45
Resultados y Discusión
46
Resultados y Discusión
muestras de vinagre (Tabla 3.1 “Resolución B”) también fueron para casi todos los
pares de picos superiorres a 1.5 y sólo para dos de ellos entre 1.1 y 1.5 (resolución entre
Glu-His y Arg-NH4+).
3.2.2. Linealidad
47
Resultados y Discusión
Para determinar la linealidad se tomó el área relativa de los picos de cada uno
de los aminoácidos estudiados y amonio a diferentes niveles de concentración (entre 5 y
9), dentro del intervalo esperable en las muestras de vinagre, vino y sustratos de partida
para los procesos de acetificación una vez que hayan sido diluidas convenientemente
para su análisis (al 25%). Los ensayos se realizaron por duplicado.
3.2.3. Exactitud
48
Resultados y Discusión
Tabla 3.3. Ensayo de recuperación en una muestra de vinagre enriquecida con aminoácidos y
amonio a tres niveles de concentración.
49
Resultados y Discusión
Tabla 3.3. Ensayo de recuperación en una muestra de vinagre enriquecida con aminoácidos y
amonio a tres niveles de concentración (continuación)
50
Resultados y Discusión
Los resultados obtenidos, mostrados en la Tabla 3.2, fueron una media de diez
veces superiores a los obtenidos por Hernández-Orte et al. (2003) para casi todos los
aminoácidos y amonio excepto para la treonina y alanina. Los límites de detección
oscilaron entre 0.20(Ala)-45.73(Arg) µg/L y los límites de cuantificación entre 2.11
(Thr) –70.05 (His) µg/L, excepto para el caso del triptófano, el cual tuvo unos límites
superiores (LDD: 110.37 µg/L y LDC: 280.75 µg/L). Estos valores demostraron que el
método era suficientemente sensible para determinar los aminoácidos y amonio
presentes en las muestras de vinagre de vino.
Los valores de repetitividad obtenidos, medidos como CV, variaron entre 0.2
para la arginina y el amonio y 11.6 para la asparagina (Tabla 3.4). Estos valores están de
acuerdo con los propuestos por el manual de la AOAC (Huber, 1998), donde para
concentraciones comprendidas entre 1 ppm y 100 ppb se aceptan unos coeficientes de
variación entre 11 y 15%.
51
Resultados y Discusión
52
Resultados y Discusión
Dada la elevada sensibilidad del método fue necesario diluir las muestras de
vinagre. Con objeto de determinar la dilución óptima de las mismas se realizaron
diferentes diluciones (5, 15, 25, 35 y 50%) tanto para sustrato vínico como vinagre
(apartado 2.2.10 de “Materiales y Métodos”).
Para este estudio se empleó un sustrato vínico con elevada acidez volátil (0.9º
acético/100 mL), el cual se utilizó posteriormente como sustrato en la acetificación de
las muestras de vinagre analizadas, y un vinagre de Jerez.
53
Resultados y Discusión
Por último, tras la validación del método sólo queda aplicarlo a muestras reales y de características
diferentes descritas en el apartado 2.1.1 de “Materiales y Métodos”.
Al objeto de comprobar la validez del método y llevar a cabo un seguimiento de los aminoácidos durante
los procesos de acetificación, se analizaron un total de 36 muestras de diferentes características.
En el “Anexo” (Tablas de la 1 a la 12) aparecen los valores medios obtenidos en las muestras para cada
aminoácido y amonio acompañados de sus desviaciones estándares.
54
Resultados y Discusión
120
100
80
N (mg/L)
I
60
F
40
20
0
A B C D
Figura 3.2. Descenso del contenido de nitrógeno en las muestras del sustrato F
En las muestras del sustrato T (Figura 3.3) los descensos oscilaron entre 20-
52.0%. Todas las acetificaciones de este sustrato mostraron descensos mayores a los
obtenidos en el sustrato F, probablemente debido a la mayor duración del proceso de
acetificación en el sustrato T que conlleva un mayor requerimiento de nitrógeno por
parte de las bacterias acéticas.
250
200
N (mg/L)
150 I
100 F
50
0
A B C D
55
Resultados y Discusión
200
150
N (mg/L)
I
100
E
50
0
CK CL CM
Figura 3.4. Comparación de las acetificaciones “CK”, “CL” y “CM” en cuanto al descenso de
nitrógeno en las muestras del sustrato F
56
Resultados y Discusión
250
200
150
mg/L
I
F
100
50
0
DK DL DM
Figura 3.5. Comparación de las acetificaciones “DK”, “DL” y “DM” en cuanto al descenso de
nitrógeno en las muestras del sustrato T
En todas las muestras iniciales (F y T) el aminoácido mayoritario fue la prolina, seguido de la arginina,
coincidiendo con lo observado por otros autores (Herbert et al., 2000; Soufleros et al., 2003; Hernández-Orte et al.,
2003). Estos altos contenidos de prolina al inicio de la fermentación acética se deben a la dificultad con la que las
levaduras metabolizan este aminoácido durante la fermentación alcohólica, por lo que las cantidades de prolina en los
vinos son similares a la de los correspondientes mostos (Hernández-Orte et al., 2003).
La prolina aportó en las muestras del sustrato F un 34.7% del contenido de nitrógeno inicial y en las del
sustrato T un 49.9% y la arginina aportó un 20% en las muestras F y un 14% en las T (Figura 3.8). Por otro lado, en
ninguna de las muestras se detectó la asparagina, glutamina, cisteína y triptófano, coincidiendo este último con lo
descrito en la bibliografía (Llaguno y Polo, 1991b; Valero et al. 2005). Según lo observado por Hernández-Orte et
al., (2003), durante la fermentación alcohólica de los vinos el nivel de aminoácidos decrece, llegando en algunos
casos, como la cisteína, a consumirse totalmente.
57
Resultados y Discusión
isoleucina y arginina. Por tanto, en las muestras del sustrato F el aminoácido que
presenta el descenso más marcado es la prolina.
Por otro lado, el ácido glutámico aumentó en todos las acetificaciones. También
presentan tendencias al aumento en la mayoría de los casos la ornitina, valina, y
fenilalanina. Estos aumentos no fueron estadísticamente significativos en ninguno de los
casos. Para el resto de los aminoácidos no se puede indicar una tendencia clara en los
procesos estudiados.
300
250
200
mg/L
I
150
F
100
50
0
IS
4
P
LY
E
R
LU
EU
L
A
ET
H
VA
AS
PH
AL
AB
LY
SE
TY
LE
TH
R
AR
PR
H
G
G
N
M
IL
O
G
Figura 3.6. Evolución de los aminoácidos y amonio en una muestra del sustrato F
58
Resultados y Discusión
750
700
650
600
550
500
450
mg/L
400
I
350
300 F
250
200
150
100
50
0
EU
LY
S
R
IS
LU
U
ET
P
4
R
E
VA
H
LY
AS
AB
AL
TY
PH
LE
TH
R
SE
AR
PR
H
G
G
N
IL
O
G
Figura 3.7. Evolución de los aminoácidos y amonio en una muestra del sustrato T
59
Resultados y Discusión
1,8 28
1,6
Consumo del resto de aminoácidos y amonio (mg N/L)
24
1,4
20
1,0 16
0,8 12
0,6
8
0,4
4
0,2
0
Escala Izquierda
NH4
THR
ARG
PRO
LEU
ILEU
GLY
ASP
ALA
GABA
MET
Escala Derecha
5,0
4,5 50
4,0
Consumo del resto de aminoácidos (mg N/L)
40
3,5
3,0
30
2,5
2,0
20
1,5
1,0 10
0,5
0
Escala Izquierda
ORN
NH4
ARG
PRO
THR
PHE
LEU
ILEU
TYR
ASP
GLY
VAL
ALA
GABA
LYS
MET
Escala Derecha
60
Resultados y Discusión
61
Conclusiones
4. CONCLUSIONES
2. Dada la alta sensibilidad del método es necesario diluir las muestras. Después de
valorar las concentraciones de aminoácidos y amonio esperables en las muestras
tanto de vino como de vinagre y los intervalos de linealidad de dichos
compuestos, se optó por una dilución del 25%.
62
Conclusiones
63
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70
Anexo
Muestras de Vinagre
71
Anexo
Muestras de Vinagre
72
Anexo
Muestras de Vinagre
73
Anexo
Muestras de Vinagre
74
Anexo
Muestras de Vinagre
75
Anexo
Muestras de Vinagre
76
Anexo
Muestras de Vinagre
77
Anexo
Muestras de Vinagre
78
Anexo
Muestras de Vinagre
79
Anexo
Muestras de Vinagre
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Anexo
Muestras de Vinagre
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Anexo
Muestras de Vinagre
82