BIOMEDICINA

INTEGRANTES:

• María Fernanda Alvarez

• Ximena Cajamarca
• María José Fárez
• Sofía Quito
 Detección mediante RT-PCR de células tumorales circulantes
en pacientes con melanoma maligno en estadio III

Correlación con el grosor y la histología del tumor

Evaluar la utilidad de la Transcriptasa reversa y Reacción en

cadena de la polimerasa (RT-PCR) en la detección de la
OBJETIVO enzima tirosinasa como marcador de la presencia de células
derivadas de melanocitos en pacientes con melanoma maligno
en estadio III y su correlación con factores pronósticos como el
grosor y la forma clínico-histológica del tumor.

Palabras Claves

• Melanoma maligno
• ARNm tirosinasa
• RT-PCR
• Células tumorales
circulantes
• Enfermedad metastásica
En los últimos años se ha producido un aumento en la
tasa de incidencia del melanoma maligno MM debido
a un diagnóstico más precoz y a la acción
acumulativa de carcinógenos como los rayos solares.

Sin embargo, el pronóstico del MM, aunque ha sido

relacionado con diferentes factores como el grosor del
tumor, el nivel de invasión, y la histología del tumor,
es difícil de establecer.

La detección precoz de estas células

circulantes permitiría aplicar un
tratamiento en estadios tempranos de
la enfermedad y por tanto mejorar el
pronóstico del paciente.
La enzima tirosinasa, implicada en el último
paso de la biosíntesis de melanina, es un
marcador específico para la detección de
células derivadas de melanoma debido a que
solo se expresa en grandes cantidades en
melanocitos

La utilización de la transcriptasa reversa y

reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
para amplificar el ARNm de la tirosinasa se
presenta como una metodología útil con la que
detectar células circulantes derivadas de
melanoma en pacientes afectados por esta
enfermedad
 RT-PCR
(Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real)

La PCR es un método que permite obtener un gran

número de copias de ADN a partir de un ADN molde.

• Proteína: polimerasa ⟶ múltiples copias del ADN

La PCR en tiempo real es una evaluación
⟶ ocurre normalmente en la división celular.
cuantitativa de los niveles de ARNm
presente en una muestra.
• La PCR se utiliza en áreas biológicas y de la salud
porque es necesario utilizar una gran cantidad de
ADN para su estudio y análisis.

• En estudios biomédicos se usa para el diagnóstico

de enfermedades.
 • ADN molde: fragmentos de ADN donde se obtendrá la parte de la que se desea
generar muchas copias.

• Iniciadores o “primers”: son dos secuencias cortas de ADN que se unen al ADN
molde.
Constituidos por 20 o más nucleótidos.
Función: dar inicio a la reacción de PCR.
Materiales • dNTPs: son nucleótidos que sirven para generar las nuevas cadenas de ADN.

• Polimerasa: proteína que sirve para duplicar el ADN molde.

• Iones: son elementos químicos cargados positivamente necesarios para la función

de la polimerasa.

• Termociclador: aparato que automatiza la PCR.

 MATERIALES Y METODOS

Selección de los
pacientes

El grupo de análisis ha estado formado por 28

pacientes con MM en estadio III, según la
clasificación de la AJCC, que presentaban
metástasis ganglionar sin evidencias de
enfermedad en otras localizaciones y que
habían sido sometidos a disección ganglionar.

Como controles negativos se han utilizado Utilizamos como muestra

muestras de sangre de 10 pacientes sanos biológica positiva un ganglio
sin evidencia de enfermedad, que han sido extirpado de un paciente afecto
obtenidas del Banco de Sangre del de melanoma
Hospital de San Cecilio de Granada.
 MATERIALES Y METODOS

Extracción de ARN de
muestras de sangre

• Las muestras de sangre (5-10 ml) recogidas en 5 tubos

con EDTA, se guarda a 4oC por 2-4 h.

• La sangre fue centrifugada a 2500 rpm durante 5 min,

desechando el plasma y recogiendo el suero
posteriormente transfiriendo a un tubo de policarbonato.

• Se añadieron 45 ml de DEP y PBS-10x, agitando y

centrifugando a 2500 rpm, durante 5 min, para obtener
un pellet exento de glóbulos rojos.

• Para la extracción de ARN de linfocitos se utilizó el Kit

isoRNA-FAST PLUS.

• La cuantificación del ARN se realiza mediante un

espectrofotómetro de luz ultravioleta a una densidad
óptica entre 260 nm y 280 nm.

• Posteriormente, el ARN se chequea mediante

electroforesis en mini gel de agarosa al 1%.

• Los geles se visualizan con un transiluminador de

ultravioletas y se puede fotografiar.
 MATERIALES Y METODOS

Oligonucleótidos

Los oligonucleótidos utilizados para la

amplificación del gen de la tirosinasa fueron:

• ME-1 (sentido): 5'-TTG GCA GAT TGT

CTG TAGCC-3'

• ME-2 (antisentido): 5' AGG CAT TGT GCA

TGCTGCTT-3', que amplifican un
fragmento de 284pb.

La integridad del ARN fue determinada usando

los primers correspondientes al ADNc de ß-
actina:

• 5' ATC ATG TTT GAG ACC TTC AA 3'

(sentido)

• 5' CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA 3'

(antisentido). Estos primers amplifican un
fragmento de 248 pb8
 MATERIALES Y METODOS

Transcriptasa reversa

• Las muestras de ARN se incubaron con la

enzima de transcripción inversa

• En presencia de cebadores y dNTP

catalizan la reacción de síntesis de las
cadenas de ADN complementarias a las
ARN

• Temperatura de transcripción de 42ºC

PROCESO
• Se realiza mediante un kit comercial:
• Cada tuvo de reacción contenía un volumen total de 20
ul compuesto de:
• ARN, tampón de transcriptasa reversa, proteína
inhibidora de ARNasa, transcriptasa reversa, Poli T,
dNTPs y agua
• La transcriptasa reversa se realizo en el Autociclador
LINUS Autocycle 32 a 42ºC durante 15 min
MATERIALES Y METODOS

Reacción en cadena de
la polimerasa

El resultado de la transcriptasa reversa se

diluyo a 1/10 en H2O-DEP, utilizando una
alícuota de 5 ul para la PCR

Cada tubo de la reacción contiene:

• Resultado de la transcriptasa reversa 5 ul,

tampón de la enzima Taq polimerasa,
dNTPs, enzima Taq,, primers ME-2 Y ME-2
y agua
• Los ciclos usados para la amplificación del
gen de la tirosinasa fueron 1 min para la
desnaturalización del ADN
• 2 min de acoplamiento entre cebadores y
el final de 7 min a 72ºC
• El resultado de la PCR se realizó mediante
electroforesis en gel de agorosa al 2%
 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

• Garbe C, Orfanos CE. Epidemiology of malignant melanoma in central Europe:

Risk factors and prognostic predictors. Results of the Central Malignant
Melanoma Registry of the German Dermatological Society. Pigment Cell Res
1992;2:285-294.

• Breslow A. Thickness, cross-sectional areas and depth of invasion in the

prognosis of cutaneous melanoma. Ann Surg 1970;172:902-908.

• Clark WH Jr, From L, Benardino EA, Mihm MC. The histogenesis and biologic
behaviour of primary human malignant melanomas of the skin. Cancer Res
1969;29:705-727.

• Hoon DS, Wang Y, Dale PS, et al. Detection of occult melanoma cells in blood
with a multiple-marker polymerase chain reaction assay. J Clin Oncol
1995;13:2109-2116.

• Stevens GL, Sheer WD, Levine EA. Detection of tyrosinase mRNA from the blood
of melanoma patients. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1996;5:293-296.

• Alao JP, Mohammed MQ, Slade MJ, Retrsas S. Detection of tyrosinase mRNA by
RT-PCR in the peripheral blood of patients with advance metastatic melanoma.
Melanoma Res 1999;9:395-399.