PRÁCTICA 1

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRE, REGULADORES DE CRECIMIENTO Y

MEDIOS DE CULTIVO

Objetivos
Conocer las instalaciones y el equipo del Laboratorio de Biotecnología de Plantas, así como su correcto
funcionamiento.
Aprender sobre la preparación de soluciones madre, reguladores de crecimiento y medios de cultivo.
Procedimiento

Preparación de soluciones madre

Macroelementos (según el medio de cultivo Murashige y Skoog 1962)

1. Para preparar una solución 10X (que será 10 veces más concentrada) multiplique por 10 la cantidad
indicada para cada uno de los macroelementos (Ver Cuadro 1).
NH4NO3 : 1650 mg*10: 16500 mg
2. Pese cada uno de los macroelementos por separado.
3. En un balón aforado de 1000 ml, agregue 500 ml de agua destilada y adicione uno a uno las cantidades
pesadas de los macroelementos. NOTA: Espere a que se disuelva cada macroelemento antes de adicionar
el siguiente.
4. Agite y afore a 1000 ml con agua destilada.
5. Transfiera la solución de macroelementos a una botella para su almacenamiento.
6. Rotule la botella con el nombre de la solución (Macroelementos 10X), fecha y nombre de la persona que
lo preparó.
7. Para recordar la cantidad de solución madre de macroelementos que se debe de adicionar por litro de
medio de cultivo: 1000 ml/10X: 100 ml de la solución madre por litro de medio de cultivo.

Microelementos (según el medio de cultivo Murashige y Skoog 1962)

1. Para preparar una solución 200X (que será 200 veces más concentrada) multiplique por 200 la cantidad
indicada para cada uno de los microelementos (Ver Cuadro 1).
H3BO3: 6.2 mg*200: 1240 mg
2. Pese cada uno de los microelementos por separado.
3. En un balón aforado de 1000 ml, agregue 500 ml de agua destilada y adicione uno a uno las cantidades
pesadas de los microelementos. NOTA: Espere a que se disuelva cada microelemento antes de adicionar
el siguiente.
4. Agite y afore a 1000 ml con agua destilada.
5. Transfiera la solución de microelementos a una botella para su almacenamiento.
6. Rotule la botella con el nombre de la solución (Microelementos 200X), fecha y nombre de la persona que
lo preparó.
7. Para recordar la cantidad de solución madre de microelementos que se debe de adicionar por litro de
medio de cultivo: 1000 ml/200X: 5 ml de la solución madre por litro de medio de cultivo.

Vitaminas (según el medio de cultivo Murashige y Skoog 1962)

1. Cada vitamina se prepara por separado.
2. Pese 50 mg de ácido nicotínico, piridoxina y tiamina por separado.
3. En un balón aforado de 100 ml, agregue 50 ml de agua destilada y adicione la cantidad pesada de la
vitamina.
8. Transfiera la solución de cada vitamina a una botella para su almacenamiento.
4. Rotule la botella con el nombre de la solución, concentración, fecha y nombre de la persona que lo
preparó.
5. NOTA: El mio-inositol se pesa y se agrega a la hora de preparar el medio de cultivo.
Hierro
1. Tome un beaker de 1000 ml y agregue 700 ml de agua destilada. Introduzca una pastilla magnética y
coloque el recipiente sobre un calentador.
2. Cuando el agua está hirviendo agregue la cantidad pesada de hierro (Ver Cuadro 1).
3. Coloque el beaker en un lugar oscuro y cuando este frío transfiera la solución a un balón aforado y
agregue agua hasta la marca de aforo.
4. Transfiera la solución de hierro a una botella ambar para su almacenamiento.
5. Rotule la botella con la nombre de la solución, concentración, fecha y nombre de la persona que lo
preparó.

Reguladores de crecimiento
1. Cada reguladores de crecimiento se prepara por separado.
2. Pese 50 mg de cada uno de los reguladores de crecimiento por separado (Ver Cuadro 3).
3. En un balón aforado de 50 ml, agregue 25 ml de agua destilada y adicione la cantidad pesada de los
reguladores de crecimiento.
4. Transfiera la solución de cada reguladores de crecimiento a una botella para su almacenamiento.
5. Rotule la botella con el nombre de la solución, concentración, fecha y nombre de la persona que lo
preparó.

Preparación de medios de cultivo

1. Tome un beaker de 1000 ml y agregue 250 ml de agua destilada. Introduzca una pastilla magnética y
coloque el recipiente sobre un agitador magnético.
2. Agregar 30 g de sacarosa y las alícuotas de las soluciones madre de macroelementos, microelementos,
vitaminas, hierro y reguladores de crecimiento (Ver Cuadro 2).
3. Agregue agua destilada al beaker sin llegar a la marca de los 1000 ml.
4. Mida el pH del medio de cultivo utilizando un pHmetro.
5. Afore el medio de cultivo a 1000 ml.
6. Pese y agregue el gelificante.
7. Antes de dispensar el medio de cultivo en frascos Gerber debe de calentarlo en el microondas por 6-7
minutos.
8. Esterilizar el medio de cultivo en una autoclave a 121 °C por 21 minutos.
9. Si el medio de cultivo contiene sustancias lábiles al calor (que se puedan degradar) después de autoclavado
en la cámara de flujo laminar permita que el medio se enfrie. Una vez frío agregue la sustancia
previamente esterilizada mediante filtración (Milipore 0.22 µM).

Unidades para la preparación de medios de cultivo

Concentración molar Conversión de mili molar a mgl-1

1 M: el peso molecular en gl-1
1 mM: el peso molecular en mgl-1 ó 10-3 M
1 µM: el peso molecular en µgl-1 ó 10-6 M ó o 10-3
mM
Conversión de mgl-1 a mili molar
No. mg CaCl2 2H2O/peso molecular CaCl2 2H2O
= 440 mg/147.019 = 2. 99 mM
2,4-D: peso molecular 221.0
1 M 2,4-D: 221.0 gl-1
1 mM 2,4-D: 221.0 mgl-1 = 0.221 gl-1
1 µM 2,4-D: 221.0 µgl-1 = 0.221 mgl-1
Conversión de micro molar a mgl-1
(µM * peso molecular)/106=mgl-1
 Cuadro 1. Preparación de las soluciones madre para el medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) (MS).

Componente Concentración en el medio Concentración en la solución Pesar (g)

MS (mgl-1) madre (mgl-1) para 1 litro
Macroelementos
(10X)
NH4NO3 1650 16500 16.5
KNO3 1900 19000 19.0
CaCl2 2H2O 440 4400 4.4
MgSO4 7 H2O 370 3700 3.7
KH2PO4 170 1700 1.7
Microelementos
(200X)
H3BO3 6.2 1240 1.24
MnSO4. 4H2O 22.3 4460 4.46
ZnSO4. 7H2O 8.6 1720 1.72
KI 0.83 166 0.166
Na2MoO4. 2 H2O 0.25 50 0.05
CoCl2. 6H2O 0.025 5 0.005
CuSO4.5H2O 0.025 5 0.005
Hierro (100X)
EDTANaFeO4 43 4300 4.3
Vitaminas (200X)
Ácido nicotínico 0.5 100 0.1
Piridoxina 0.5 100 0.1
Tiamina 0.5 100 0.1
Myo-inositol 100 20000 20
Otros
Glicina 2 400 *
Sacarosa 30000 Añadir fresco 30
Agar 8000 Añadir fresco 8

* Pesar 50 mg y disolver en 100 ml de agua destilada.

Cuadro 2. Cantidad de los componentes del medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) necesarias para
preparar 1 L de medio de cultivo.

Componente Concentración Cantidad a utilizar para 1 L de medio de cultivo

Macroelementos 10X 100 ml
Microelementos 100X 10 ml
Fe-EDTA 100X 10 ml
Tiamina 0.5 mgml -1 0.2 ml
Ácido nicotínico 0.5 mgml-1 1 ml
Piridoxina 0.5 mgml -1 1 ml
Glicina 0.5 mgml -1 4 ml
Inositol - 100 mg
Sacarosa - 30 g
Agar - 8g
pH - 5.6
Cuadro 3. Características de los principales reguladores de crecimiento utilizados en cultivo de tejidos.

Regulador de crecimiento Abreviación Peso molecular Solubilidad

Ácido 2,4-diclorofenoxiacético 2,4-D 221.0 Etanol 95%
Ácido 3-indolacético AIA 175.2 1 N NaOH – Etanol 95%
Ácido 3-indolbutírico AIB 203.2 1 N NaOH – Etanol 95%
Ácido naftalenacético ANA 186.2 1 N NaOH – Etanol 95%
Adenina A 189.1 H2O
Sulfato de adenina AS 404.4 H2O
6- Bencilaminopurina BAP 225.2 1 N NaOH
2-isopenteniladenina 2-Ip 203.3 1 N NaOH
Kinetina Kin 215.2 1 N NaOH
Zeatina Z 219.2 1 N NaOH - 1 N HCl
Ácido giberélico AG 346.4 Etanol
Ácido abscísico ABA 264.3 1 N NaOH

Si necesita cambiar un compuesto con un número de hidratación por otro, como por ejemplo MnSO4. 4H2O
(PM1: 223.09) por MnSO4. H2O (PM2: 169.01)

M2: (M1*PM2)/PM1

En donde:
M1: es la masa requerida del compuesto químico original
M2: es la masa requerida del compuesto químico sustituto
PM1: es el peso molecular del compuesto químico original
PM2: es el peso molecular del compuesto químico sustituto
 HOJA CONTROL PREPARACIÓN MEDIOS DE CULTIVO

Preparado por: ____________________________ Fecha: _______________

Cultivo: __________________________________ Etapa: _______________

Cantidad a utilizar
Concentración ( ____ ) L
por 1L

Macroelementos MS 10X 100 ml

Microelementos MS 100X 10 ml

Tiamina 0.5 mgml-1 0.2 ml

Ácido nicotínico 0.5 mgml-1 1 ml

Piridoxina 0.5 mgml-1 1 ml

Na-Fe EDTA 100X 10 ml

Sacarosa 30 g

Reguladores de crecimiento

Otros

Glicina 0.5 mgml-1 4 ml

Gelificante

pH