Elden Steave Thompson Ramírez sección A

201700970

Sección 1: Cromatografía de gases.

La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra

se volatiliza y se inyecta en la cabeza de un mechero de una columna
cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A
diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no interactúa con las
moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la
columna.

Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la cromatografía gas-sólido

(GSC) y la cromatografía gas-líquido (GLC), siendo esta última la que se utiliza más
ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografía de gases (GC). En
la GSC la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se
produce mediante el proceso de adsorción. Precisamente este proceso de
adsorción, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografía
tenga aplicación limitada, ya que la retención del analito sobre la superficie es
semipermanente y se obtienen picos de elución con colas. Su única aplicación es la
separación de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase
estacionaria moléculas de líquido inmovilizadas sobre la superficie de un sólido
inerte.

1.1 Funcionamiento del cromatógrafo

Se comenzará viendo en detalle cuáles son las partes más importantes de un
cromatógrafo gaseoso.
El puerto de inyección (o ínlet), es el sitio en donde la muestra ingresa al
sistema, introduciendo una jeringa a través de un sello llamado septum.
El horno, es el lugar en donde se encuentra la columna cromatográfica. Las
columnas suelen tener un largo que varía según la aplicación, siendo las más
comunes las de 30 metros. Y el diámetro de la columna suele ser menor a medio
milímetro. Lo que distingue a una columna de otra es la fase estacionaria, que es el
polímero que recubre sus paredes internas. Esta fase va a ser la encargada de
interactuar con las sustancias que componen nuestra muestra. Finalmente, el
detector es el último lugar del equipo, al que cada analito llegará una vez separado
del resto de los componentes, para ser detectado.
Para que una sustancia pueda ser analizada en un GC, debe ser lo
suficientemente volátil como para poder ser evaporada en el puerto de inyección. En
general, los puntos de ebullición de todos los componentes de las muestras serán
menores a los 300 grados Celsius. Además, no debe descomponerse por el
calentamiento (por lo que no podríamos introducir en un GC una mezcla de
azúcares, por ejemplo).
Un gas carrier - o portador - se encarga de transportar la muestra a través de la
columna, desde el inlet hacia el detector. Una cañería lleva a este gas Carrier desde
el cilindro hasta la entrada del GC. Este gas debe ser inerte, y generalmente se
utiliza como Carrier: Helio, Nitrógeno, o Hidrógeno. La presión de trabajo de un GC
está normalmente entre 5 y 25 psi (o libras por pulgada cuadrada).
Volvamos a nuestro cromatógrafo, y vamos a verlo funcionar. Mediante una
microjeringa, vamos a inyectarle un microlitro de una muestra de solvente, en este
caso alcohol etílico absoluto. Pero este alcohol etílico va a tener contaminantes. De
hecho, vamos a usar nuestro cromatógrafo para ver cuál es la pureza de nuestro
alcohol, y cuáles son las concentraciones de los contaminantes.
Cuando ese microlitro de alcohol llegue al puerto de inyección, se va a
evaporar completamente en una fracción de segundo, dado que en esa zona del
equipo la temperatura será de unos 200 ºC. Ese vapor de alcohol (que en realidad
va a contener una mezcla de alcohol con sus contaminantes), va a ir avanzando por
la columna, y mediante distintos mecanismos de interacción con la fase de la
columna, cada uno de los componentes va a ir llegando al detector a distinto tiempo,
ya que cada especie química tiene una polaridad y un punto de ebullición
específicos. Además, el equipo va a ir controlando la temperatura del horno (es
decir, la temperatura de la columna), comenzando por temperaturas más bajas (por
ejemplo, 50 grados Celsius), hasta temperaturas mayores (digamos, unos 200 ºC).
La velocidad de calentamiento (conocida como "rampa de temperaturas") también
es controlada por el equipo. Como resultado, el detector va a registrar un aumento
de la señal cada vez que detecte a una sustancia. Un software se encarga de
controlar al cromatógrafo, pero además registra la señal producida por el detector en
todo momento. El registro de la señal durante el análisis, en el que en el eje "x" se
representa al tiempo transcurrido, y en el eje "y" a la abundancia de las señales, se
llama "cromatograma".
El cromatograma es simplemente una gráfica con "picos" en forma de
montañas, en los que cada uno de esos picos corresponde a cada sustancia que fue
llegando al detector. En general, los picos que salgan primero, van a ser los de las
sustancias más volátiles, y los últimos, los de las sustancias más pesadas, o las que
por alguna razón fueron más retenidas por la columna. Por otra parte, mientras
mayor sea la altura y el área de cada pico, mayor va a ser la concentración de ese
analito en la muestra. Junto con el cromatograma, obtendremos el reporte
cromatográfico, que nos dará las concentraciones de cada analito en la muestra, y
en este caso nos dirá qué tan puro era nuestro etanol, y cuál es el porcentaje de
cada contaminante.

1.2 Columnas
En GC se emplean dos tipos de columnas: las empacadas o de relleno y las
tubulares abiertas o capilares. Estas últimas son más comunes en la actualidad
(2005) debido a su mayor rapidez y eficiencia. La longitud de estas columnas es
variable, de 2 a 60 metros, y están construidas de acero inoxidable, vidrio, sílice
fundida o teflón. Debido a su longitud y a la necesidad de introducirlas en un horno,
las columnas suelen enrollarse en una forma helicolidal con longitudes de 10 a 30
cm, dependiendo del tamaño del horno.
1.2.1 Columnas de relleno
Las columnas de relleno o empacadas consisten en unos tubos de vidrio,
metal (inerte a ser posible como el acero inoxidable, níquel, cobre o aluminio) o
teflón, de longitud de 2 a 3 metros y un diámetro interno de unos pocos milímetros,
típicamente de 2 a 4. El interior se rellena con un material sólido, finamente dividido
para tener una máxima superficie de interacción y recubierto con una capa de
espesores entre 50 nm y 1 μm. Para que puedan introducirse en el horno, se
enrollan convenientemente.

El material de relleno ideal consiste en pequeñas partículas, esféricas y

uniformes, con una buena resistencia mecánica, para tener una máxima superficie
donde interaccionar la fase estacionaria y el analito. La superficie específica mínima
ha de ser de 1 m²/g. Como todos los componentes de columnas para GC, debe ser
inerte a altas temperaturas (~400 °C) y humectarse uniformemente con la fase
líquida estacionaria durante el proceso de fabricación. El material preferido
actualmente (2005) es la tierra de diatomeas natural, debido a su tamaño de poro
natural. Estas especies, ya extinguidas, utilizaban un sistema de difusión molecular
para tomar nutrientes del medio y expulsar sus residuos. Por lo tanto son materiales
especialmente útiles, debido a que el sistema de absorción superficial del analito y
la fase estacionaria es parecido.

El tamaño es crítico a la hora de darse el proceso de interacción del analito, y

a menores tamaños la eficacia de la columna es mejor. Pero existe el problema de
la presión necesaria para hacer circular un caudal estable de gas portador por la
columna, ya que dicha presión es inversamente proporcional al cuadrado del
diámetro de dichas partículas. Así, el tamaño mínimo para usar presiones máximas
de 50 psi es de 250 a 149 μm.

1.2.2 Columnas capilares

Las columnas capilares son de dos tipos básicos: las de pared recubierta
(WCOT) y las de soporte recubierto (SCOT). Las WCOT son simplemente tubos
capilares donde la pared interna se ha recubierto con una finísima capa de fase
estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte interna una fina capa de
material absorbente como el empleado en las columnas de relleno (tierra de
diatomeas) donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las WCOT
frente a las SCOT es la mayor capacidad de carga, ya que en su fabricación se
emplean mayores cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de
intercambio mayor. Por orden de eficacia, en primer lugar están las WCOT, luego
las SCOT y por último las columnas de relleno.

Las columnas WCOT se fabrican a partir de sílice fundida, conocidas como

columnas tubulares abiertas de sílice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a
partir de sílice especialmente pura, sin apenas contenido de óxidos metálicos.
Debido a la fragilidad inherente a este material, en el mismo proceso de obtención
del tubo se recubre con una capa de poliimida, de esta forma la columna puede
enrollarse con un diámetro de unos pocos centímetros. Estas columnas, con
propiedades como baja reactividad, resistencia física y flexibilidad, han sustituido a
las WCOT clásicas.

Las columnas FSOT tienen diámetros internos variables, entre 250 y 320 μm
(para columnas normales) y 150-200 μm para columnas de alta resolución. Estas
últimas requieren menor cantidad de analito y un detector más sensible, al eluir
menor cantidad de gas. Existen asimismo columnas macrocapilares con diámetros
de hasta 530 μm, que admiten cantidades de analito comparables a las de relleno
pero con mejores prestaciones.

En estas columnas existe un problema debido a la adsorción del analito sobre

la superficie de la sílice fundida, adsorción debida a la presencia de grupos silanol
(Si-OH), los cuales interaccionan fuertemente con moléculas polares orgánicas. Se
suele solventar este inconveniente inactivando la superficie por sililación con
dimetilclorosilano (DMCS). La adsorción debida a los óxidos metálicos se ve paliada
en gran parte por la elevada pureza de la sílice empleada.
1.3 Fases móviles:
Existen como mucho una docena de disolventes con estas características.
Para elegir uno, debe tenerse en cuenta la polaridad del analito, ya que a mayor
polaridad del analito, mayor polaridad deberá tener la fase estacionaria. Algunas
fases estacionarias utilizadas actualmente son:

 Polidimetilsiloxano, fase no polar de uso general para hidrocarburos,

aromáticos, polinucleares, drogas, esteroides y PCB.
 Poli(fenilmetildifenil)siloxano (10% fenilo), para ésteres metílicos de
ácidos grasos, alcaloides, drogas y compuestos halogenados.
 Poli(fenilmetil)siloxano (50% fenilo), para drogas, esteroides,
pesticidas y glicoles.
 Poli(trifluoropropildimetil)siloxano, para aromáticos clorados,
nitroaromáticos, bencenos alquilsustituidos.
 Polietilenglicol,sirve para compuestos polares, también para
compuestos como glicoles, alcoholes, éteres, aceites esenciales.
  Poli(dicianoalildimetil)siloxano, para ácidos grasos poliinsaturados,
ácidos libres y alcoholes.
Generalmente, en columnas comerciales, la fase estacionaria se presenta
enlazada y entrecruzada para impedir su pérdida durante las operaciones de elución
o lavado. De esta forma se obtiene una monocapa adherida químicamente a la
superficie de la columna. La reacción implicada suele ser la adición de un peróxido
al líquido a fijar, iniciándose una reacción por radicales libres que tiene como
resultado la formación de un enlace carbono-carbono que además incrementa su
estabilidad térmica. Otra forma es la irradiación con rayos gamma.
Otro tipo de fase estacionaria son las quirales, lo cual permite resolver
mezclas enantioméricas. Este tipo de fases suelen ser aminoácidos quirales o algún
derivado adaptado al trabajo en columna.
El grosor de la película varía entre 0,1 y 5 μm; el grosor depende de la
volatilidad del analito. Así, un analito muy volátil requerirá una capa gruesa para
aumentar el tiempo de interacción y separar más efectivamente los diferentes
componentes de la mezcla. Para columnas típicas (diámetros internos de 0,25 o
0,32 mm) se emplean grosores de 0,25 μm, y en las columnas macrocapilares el
grosor sube hasta 1 μm. El grosor máximo suele ser de 8 μm.

1.4 Gas inerte:

La fase móvil es un gas inerte, por lo general nitrógeno o helio que transporta
la muestra volatilizada en el inyector a través de la columna cromatográfica.

1.5 Detector:
El detector es la parte del cromatógrafo que se encarga de determinar
cuándo ha salido el analito por el final de la columna. Las características de un
detector ideal son:

 Sensibilidad: Es necesario que pueda determinar con precisión cuándo sale

analito y cuando sale sólo el gas portador. Tienen sensibilidades entre 10-8 y
10-15 g/s de analito.
 Respuesta lineal al analito: con un rango de varios órdenes de magnitud.
 Tiempo de respuesta corto: independiente del caudal de salida.
  Intervalo de temperatura de trabajo amplio, por ejemplo desde temperatura
ambiente hasta unos 350-400 °C, temperaturas típicas trabajo.
 Estabilidad y reproducibilidad, es decir, a cantidades iguales de analito debe
dar salidas de señal iguales.
 Alta fiabilidad y manejo sencillo, o a prueba de operadores inexpertos.
 Respuesta semejante para todos los analitos, o
 Respuesta selectiva y altamente predecible para un reducido número de
analitos.
Algunos tipos de detectores:
 Detector de ionización de llama (FID, Flame Ionization Detector).
 Detector de conductividad térmica (TCD, Thermical Conductivity Detector).
 Detector termoiónico (TID, ThermoIonic Detector).
 Detector de captura de electrones (ECD, Electrón-Capture Detector).
 Detector de emisión atómica (AED, Atomic Emission Detector).

Otros detectores minoritarios son el detector fotométrico de llama (PFD),

empleado en compuestos como pesticidas e hidrocarburos que contengan fósforo o
azufre. En este detector se hace pasar el gas eluido por una llama
hidrógeno/oxígeno donde parte del fósforo se convierte en una especie HPO, la cual
emite a λ = 510 y 526 nm, y simultáneamente el azufre se convierte en S2, con
emisión a λ = 394 nm. Dicha radiación emitida se detecta con un fotómetro
adecuado. Se han podido detectar otros elementos, como algunos halógenos,
nitrógeno, estaño, germanio y otros.

En el detector de fotoionización (PID), el gas eluido al final de la columna se

somete a una radiación ultravioleta con energías entre 8,3 y 11,7 eV,
correspondiente a una λ = 106-149 nm. Mediante la aplicación de un potencial a la
celda de ionización se genera una corriente de iones, la cual es amplificada y
registrada.

1.6 Rampas de temperatura:

La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el
grado de separación de los diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una
precisión de décimas de grado. Dicha temperatura depende del punto de ebullición
del analito o analitos, como también la máxima temperatura de funcionamiento de la
columna (fase estacionaria), y por lo general se ajusta a un valor igual o ligeramente
superior a él. Para estos valores, el tiempo de elución va a oscilar entre 2 y 30-40
minutos. Si tenemos varios componentes con diferentes puntos de ebullición, se
ajusta la llamada rampa de temperatura con lo cual ésta va aumentando ya sea de
forma continua o por etapas. En muchas ocasiones, el ajustar correctamente la
rampa puede significar separar bien o no los diferentes analitos. Es recomendable
utilizar temperaturas bajas para la elución, ya que -aunque a mayor temperatura la
elución es más rápida- se corre el riesgo de descomponer el analito. Se puede
progamar la rampa tanto para aumentar como para disminuir la temperatura del
horno para que no haya solapamiento de los picos.
1.7 Presión y caudal:
Generalmente la regulación de la presión se hace a dos niveles: un primer
manómetro se sitúa a la salida de la bala o generador del gas y el otro a la entrada
del cromatógrafo, donde se regula el flujo. Las presiones de entrada varían entre 10
y 25 psi, lo que da lugar a caudales de 25 a 150 mL/min en columnas de relleno y
de 1 a 25 mL/min en columnas capilares. Para comprobar el caudal se puede utilizar
un rotámetro o un simple medidor de pompas de jabón, el cual da una medida muy
exacta del caudal volumétrico que entra a la columna.

Sección 2 HPLC
La cromatografía líquida de alta eficacia o high performance liquid
chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada
frecuentemente en bioquímica y química analítica. También se la denomina a veces
cromatografía líquida de alta presión o cromatografía líquida de alta resolución (high
pressure liquid chromatography) (HPLC), aunque esta terminología se considera
antigua y está en desuso. El HPLC es una técnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones
químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.

En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a

través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas
redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el
bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a
analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan
diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase
estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de los
componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la
composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un
compuesto en ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se
considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una
determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión en este tipo de
cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna
y reduce así su difusión dentro de la misma mejorando la resolución de la
cromatografía.
Una mejora introducida en la técnica de HPLC descrita fue la variación en la
composición de la fase móvil durante el análisis, conocida como elución en
gradiente. Un gradiente normal en una cromatografía de fase reversa puede
empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25
minutos. El gradiente utilizado varía en función de la hidrofobicidad del compuesto.
El gradiente separa los componentes de la muestra como una función de la afinidad
del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la fase
estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos
más hidrofílicos eluirán a mayor concentración de agua, mientras que los
compuestos más hidrofóbicos eluirán a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A
menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas con tal de optimizar el
gradiente de forma que permita una buena separación de los compuestos.
2.1 Diagrama de flujo HPLC
 2.2 Tabla I. Analitos.

Compuesto Fórmula Forma

Cafeína CH NO
8 10 4 2

Agua HO
2

Metanol CH OH 3

Ácido acético CH₃COOH

 Silica gel SiO 2

2.3 Tabla II. Detector UV

Modelo Utilidad
Este detector alcanza un nivel de ruido
de 0.4 x 10-5 AU. La celda SR (celda
de sensibilidad y resolución) reduce
significativamente la dispersión
máxima. Este modelo admite análisis
desde LC convencional hasta análisis
SPD-20AV ultrarrápido y UHPLC. La celda opcional
de alta sensibilidad tiene una longitud
de ruta óptica de 85 mm y es capaz de
detectar componentes traza que eran
convencionalmente difíciles de detectar.
La función TC-Optics mejora aún más
la estabilidad de la línea base.
Fuente: https://www.shimadzu-la.com/productos/an/hplc/prominence/lc20.html

2.4 Tabla III. Componentes de la cafeína respecto a los tiempos de retención.

Tiempo de retención Milivolt Temperatur

Componente
(min) s a

Cafeína 9 0.86 25 °C
Fuente: Visita de laboratorio UAI.
 Bibliografía

 Wikipedia. Cafeína. Revisado el 8 de abril de 2020. Disponible en:

https://es.wikipedia.org/wiki/Cafe%C3%ADna.
 Wikipedia. Agua. Revisado el 8 de abril de 2020. Disponible en:
https://es.wikipedia.org/wiki/Agua.
 Wikipedia. Metanol. Revisado el 8 de abril de 2020. Disponible en:
https://es.wikipedia.org/wiki/Metanol.
 Wikipedia. Acido acético. Revisado el 8 de abril de 2020. Disponible en:
https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_ac%C3%A9tico
 Wikipedia. Gel de sílice. Revisado el 8 de abril de 2020. Disponible en:
https://es.wikipedia.org/wiki/Gel_de_s%C3%ADlice
 Castro, R.M.R.P.S.; Martins, R.V., et all. (2004) "High capacity and low cost
detection of prion protein gene variant alleles by denaturing HPLC". Jorunal of
Neuroscience Methods, 139:263-269
 Skoog, Douglas A. y Leary, James J. (1994). Análisis Instrumental. Armenia:
McGraw-Hill. ISBN 84-481-0191-X.
 McNair, Harold M. & Miller, James M. (1998). Basic Gas Chromatography.
Canada: John Wiley & Sons, Inc. ISBN 0-471-17260-X (alk. paper); ISBN 0-
471-17261-8 (pbk.: alk. paper).
 Anexos.
Figura No.1
Fuente: Visita de laboratorio UAI

Figura No.2
Fuente: Visita de laboratorio UAI

Figura No.3
Fuente: Visita de laboratorio UAI

Figura No.4
Fuente: Visita de laboratorio UAI