Universidad Industrial de Santander

Facultad de Salud
Escuela de Microbiología
Fitopatología
2019

Fuente: http://foroantiguo.infojardin.com/

Guía Práctica #5
Pruebas de Patogenicidad

Introducción

Postulados de Koch.

En fitopatología es necesario comprobar si los microorganismos aislados se encuentran en estado patogénico,

para lo cual se realizan diferentes evaluaciones denominadas “pruebas de patogenicidad” (Rivera y Gómez,
2012). Así mismo, cuando se trata de aislar el agente infeccioso de material vegetal infectado, se recuperan
diversos microorganismos (hongos y bacterias), por tanto es necesario comprobar cuál es el agente infeccioso
involucrado en la patología de la planta. Por ello se deben buscar mecanismos que permitan comprobar su
patogenicidad, determinar cuál es el agente infeccioso, si es secundario, invasor o patógeno (Cardona y
González, 2008).

Para comprobar que el microorganismo aislado es el agente infeccioso se utilizan los postulados de Koch, así:

1. Determinar si el patógeno ha estado asociado con la enfermedad en este tipo de plantas. (se puede
realizar haciendo revisión de literatura).
2. En caso de parásitos no obligados, se aísla y desarrolla en cultivo puro y se describen sus características.
Para parásitos obligados realizar su inoculación en las plantas hospedantes y registrar los efectos que
produzcan sobre la planta.
3. El microorganismo que se desarrolle en cultivo puro debe inocularse en otra planta sana de la misma
variedad y especie y determinar si los síntomas obtenidos son los mismos que los de la enfermedad
original.
4. Realizar el re-aislamiento del patógeno en la planta inoculada y compararlo con el aislamiento original
(coincidencia con las características descritas en el paso 2). (Avila).

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Métodos de inoculación.

Los métodos de inoculación de microorganismos en las plantas se utilizan para fitopatógenos o para
controladores biológicos. Es importante tener en cuenta que las inoculaciones en el caso de los fitopatógenos
deben ser realizadas en la parte de la planta por donde generalmente penetra el patógeno y se inicia la
enfermedad. Por ejemplo: Phytophthora en hojas, Fusarium en raíces y hojas, Helminthosporium – raíz,
tallo, panículas y grano, Rhizoctonia- raíz.

Para realizar la inoculación se deben considerar las siguientes condiciones:

1. El inóculo debe ser viable.
2. Permitir que el inóculo este en contacto con la parte de la planta que es afectada por el patógeno
3. La planta debe estar en un estadio susceptible.
4. Satisfacer las condiciones ambientales para que el inóculo colonice la planta y se produzca la
enfermedad.
5. Inocular en el sitio en el que generalmente penetra el patógeno. Cuando se ha descrito que el
microorganismo penetra por heridas se debe causar una herida para facilitar la penetración.
6. Es necesario conocer la cantidad de inoculo necesaria para producir la enfermedad.
7. Las inoculaciones deben ser iguales para todas las plantas que se están analizando.
8. Se deben mantener las condiciones ambientales para favorecer el establecimiento de la enfermedad
(condiciones de humedad y temperatura apropiadas). (Mondino, 2012).

Inoculación de frutos. En el caso de hongos a partir de una colonia esporulada se realiza una suspensión de
esporas conocida. Para el caso de bacterias se realiza comparando con la escala de MacFarland. Se hacen
pequeñas heridas 1 a 2 mm de profundidad con un objeto cortopunzante en la zona ecuatorial de los frutos a
evaluar. Cada herida se inocula con 10 µL de una suspensión de esporas de 104 esporas.mL-1 y se incuba en
condiciones de humedad por 10 días (Contreras, 2006).

Inoculación de semilla. Se prepara una suspensión conocida del microorganismo, semillas previamente
desinfectadas son sumergidas en la suspensión por 10 minutos, posteriormente se colocan en cámara húmeda y
se evalúa su germinación o en su defecto se colocan en semilleros y se evalúa el crecimiento de las mismas.

Inoculación de hojas. Puede realizarse por aspersión de esporas o por inoculación de micelio. En el primero se
realiza una suspensión de esporas de concentración conocida, se humedece el sitio de inoculación y se aplica
por aspersión. En el segundo, a partir de un cultivo de cinco días de crecimiento se realizan cortes de círculos
de 10 mm, los círculos se colocan en contacto con la hoja, a la que previamente se le ha causado herida, para
facilitar la penetración, posteriormente se cubre con vinilpel. Se debe mantener condiciones de humedad de
80 a 90%. Se marca el sitio de inoculación y se evalúa diariamente la presencia de signos y síntomas.

Inoculación de suelo. Se puede realizar con partes de planta infectadas, por aspersión de una suspensión del
microorganismo o con cortes de círculos de micelio mezclados en el sustrato. Se siembran las semillas o las
plántulas y se evalúa el crecimiento.

Parámetros de evaluación

Porcentaje de germinación

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Biomasa de raíces y hojas
Tamaño de crecimiento de la parte foliar y radicular
Porcentaje de Incidencia
Porcentaje de Severidad
Viabilidad del microorganismo patógeno

Objetivo
Realizar pruebas de patogenicidad en frutos, semillas o plántulas y evaluar la capacidad patogénica de los
aislamientos obtenidos previamente en el laboratorio de aislamiento de fitopatógenos

Materiales

1. Tubos delgados estériles de 13 x 100 envueltos en papel (Paquetes por 2 envueltos en papel Kraft/1 por
grupo)*
2. Agar PDA (20 cajas)*
3. Agua destilada estéril (1 frasco con 500 mL por grupo)*
4. Asas*
5. Bandeja para fruta o bandeja de cartón de huevos vacía.
6. Bolsa plástica grande para mantener humedad. El número y tamaño depende del material vegetal que
estén trabajando.
7. Cajas estériles (4 por grupo)*
8. Cámara de Neubauer
9. Cinta de enmascarar*
10. Encendedor
11. Estereomicroscopio*
12. Frasco de compota estéril (4 por grupo)*
13. Frascos de mayonesa estériles de 500 mL de capacidad* (20 en total)*
14. Gasa estéril* (4 por grupo)
15. Hongos fitopatógenos cultivados en agar PDA con 7 días de incubación*.
16. Implementos de protección personal (gafas, guantes, tapabocas, gorros, polainas)
17. Jeringa de 10 mL (2 por grupo)
18. Jeringas de insulina (2 por grupo)
19. Bisturí estéril (2 por grupo)*
20. Lápiz de cera
21. Mechero de gas*
22. Micropipetas de 5 a 50 µl y de 100 a 1000 µl*
23. Microscopio*
24. Muestras de la planta de la que se obtuvo el microorganismo al que se le va a confirmar su
patogenicidad.
25. Palillos estériles*.
26. Palos para pincho de madera estériles*.
27. Pape vinipel
28. Paquetes de toallas de papel estéril (5 por grupo)*
29. Pinzas estériles (2 por grupo)*
30. Platos desechables
31. Puntas estériles azules y amarillas* (1 de cada uno por grupo)*

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32. Semilla de fríjol verde*
33. Solución de hipoclorito al 0,05% (25 mL)*
34. Solución de hipoclorito al 0,525% (100 mL por grupo)*
35. Solución salina 0,85% con 10 mL (1 por grupo)*
36. Solución salina 0,85% con 5 mL* (4 por grupo)*
37. Solución salina 0,85% estéril (50 mL por grupo)*
38. Suelo estéril* Se coloca en autoclave 3 veces durante 30 minutos, se debe esperar dos días entre cada
esterilización.
* proporcionados por el docente

Procedimiento
Preparación del inóculo
Hongo
Inóculo 1.
1. A partir de un cultivo en PDA de cinco días de crecimiento realizar la inoculación de 10 mL de solución
salina al 0,85%, con ayuda de un asa homogenizar y recuperar en el tubo estéril donde venía la solución
2. Realizar recuento de propágulos en cámara de Neubauer.
3. Ajustar el inóculo a 5 x 104 propágulos por mililitro en 50 mL de solución salina al 0,85%

Inóculo 2.
1. Con ayuda de un tubo estéril delgado, realizar 3 cortes de micelio

Bacterias
Inóculo 1.
1. Preparar una suspensión bacteriana en un tubo con 5 mL de solución salina 0,85% estéril con una
turbidez similar al tubo 1 de la Escala de Mac Farland (3 x 108 UFC. Ml-1)

Prueba de patogenicidad en frutos u hojas

Se utilizaran cinco frutos, dos de los cuales serán usados como controles. Los frutos se someterán al siguiente
procedimiento:
1. Lavar la superficie con agua y jabón para retirar partículas contaminantes y fungicidas
2. Desinfectar la superficie con una solución de hipoclorito de 0,525% durante dos minutos
3. Retirar el exceso de hipoclorito con agua destilada estéril
4. Secar con toallas estériles
5. Con un lápiz de cera realizar cuatro círculos a cada fruto los cuales corresponderán a los siguientes
tratamientos.
Tratamiento 1. Agar con crecimiento micelial sobre una herida realizada en el fruto
Tratamiento 2. Inóculo de 10 µl de esporas sobre una herida realizada en el fruto
Tratamiento 3. Agar con crecimiento micelial sobre el fruto sin herida
Tratamiento 4. Inóculo de 10 µl de esporas sobre el fruto sin herida
En los controles los tratamientos se realizara utilizando en reemplazo agar y solución salina al 0,85%,
Las heridas serán pequeñas de 1 a 2 mm de profundidad y se realizaran con aguja de disección estéril o
con aguja hipodérmica.
6. Colocar en cámara húmeda durante 10 días a temperatura ambiente. Realizar seguimiento y evaluar
presencia de síntomas o signos.
7. Realizar aislamiento de los tejidos infectados.

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Prueba de patogenicidad en semillas

Se utilizaran 21 semillas, de las cuales seis serán usadas como controles. Las semillas se someterán al siguiente
procedimiento:
1. Lavar la superficie con abundante agua para retirar partículas contaminantes y fungicidas
2. Desinfectar la superficie con una solución de hipoclorito de 0,05%
3. Retirar el exceso de hipoclorito con agua destilada estéril
4. Secar con toallas estériles
5. Envolver las semillas en gasa estéril, en paquetes distintos las semillas con tratamiento y las semillas
control
6. Sumergir por 10 minutos las semillas de tratamiento en la suspensión de esporas y las semillas control
en solución salina estéril.
7. Sacar con pinza estéril y colocar sobre toallas de papel estériles
8. Colocar las semillas en cámara húmeda dentro de cajas estériles con papel filtro previamente
humedecido (3 por caja de Petri)
9. Evaluar diariamente germinación y presencia de crecimiento fúngico

Prueba de patogenicidad en plántulas

Se utilizaran granos de fríjol 4 réplicas por tratamiento.
1. Sumergir en hipoclorito de sodio al 1% por 5 minutos
2. Lavar los granos de fríjol 3 veces con agua destilada estéril
3. Secar el exceso con toallas de papel estériles
4. Distribuir de a 4 granos en cajas de petri estériles que contienen en su interior gasa la cual se humedece
previamente con agua estéril.
5. Ubicarlos en un lugar con luz natural hasta su germinación
6. Sembrar cada plántula en frascos que contienen suelo estéril hasta ¼ parte del frasco. Se obtienen
cuatro plántulas por cada tratamiento. Se humedece el suelo.
7. A partir de un cultivo de PDA con crecimiento se obtienen los propágulos, se realiza el recuento como se
describió en el inóculo 1. A partir de los 50 mL de inóculo se aplican 5 mL con ayuda de una jeringa
estéril en la parte cercana a la raíz de la plántula. Se hace un control inoculado con 5 mL de sln salina.
8. Se coloca papel vinipel en la boca de cada frasco y se colocan en una fuente natural de luz.
9. Se realiza seguimiento diariamente para observar la aparición de signos y síntomas,
10. Mantener controlada la humedad del suelo.

Al finalizar cada experimento se seleccionará el material vegetal del que se realizará nuevamente el aislamiento
de los microorganismos fitopatógenos.

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Figura 1. Prueba de patogenicidad en plántulas de fríjol

Referencias bibliográficas
1. Agrios, G. 2005. Plant Pathology. Elseiver Academy Press. ISBN 0120445654. 922 p.
2. Ávila, C. Manual de laboratorio de fitopatología- Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia,
UPTC. Facultad de Ciencias Agropecuarias. ISBN. 958-660-078-5. P. 73-80
3. Contreras, C. 2006. Caracterización y pruebas de patogenicidad cruzada entre aislamientos de
Colletotrichum spp. obtenidos d frutos de lulo (Solanum quitoense L.) Tomate de árbol (Solanum betacea
S), granadilla (Passiflora ligularis L.), Mango (Maniufera indica L) y tallos de Mora (Rubus glaucus B)
con síntomas de antracnosis. Trabajo de pregrado. Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias
Básicas, Carrera de Microbiología Agrícola y Veterinaria. Bogotá 115 p.
4. Cardona R y González S. 2008. Caracterización y patogenicidad de hongos del complejo
Helminthosporium asociados al cultivo de arroz en Venezuela. Bioagro 20 (2) 141-145.
5. Rivera, M y Gómez, L. 2012. Identificación y patogenicidad de Fusarium spp. y Rhizoctonia solani en
cultivos de arroz del Cesar. Revista Colombiana de Microbiología Tropical. Vol 2, No. 2, p. 63-68.
6. Mondino, P. 2012. Métodos de Inoculación. Curso: Métodos en fitopatología, Unidad de Fitopatología,
Departamento de Protección Vegetal Facultad de Agronomía. 10 p.
7. Saldarriaga, Y.  Pineda, F. 2001. Manual de Micología Aplicada. Editorial Universidad de Antioquía.
ISBN 958-655-081-8. p, 80– 83.

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