Capítulo 4
Replicación de virus
La comprensión de los eventos moleculares que acompañan la replicación del virus ha
sido un enfoque principal de la virología experimental, y es esencial para la comprensión y
el control adecuados de todas las enfermedades virales. El "propósito" biológico de
cualquier ciclo de replicación es la generación de nuevos genomas virales y proteínas en
cantidades suficientes para asegurar la propagación del genoma viral (un claro ejemplo
del "gen egoísta"); esto requiere que el genoma viral extracelular esté protegido de la
degradación enzimática y se pueda introducir en otras células diana para nuevas rondas
de replicación. Se sabe mucho sobre las etapas iniciales del apego, y un estudio más
detallado muestra que el reconocimiento inicial entre el virus y el huésped es más
complejo de lo que se suponía originalmente. La regulación temporal de los eventos
intracelulares es crítica en todos los virus excepto en los más simples, con alguna forma
de supresión de la respuesta inmune innata del huésped que es común a casi todos los
virus humanos. Hay ejemplos en los que la respuesta inmune innata incluso se usa para
mejorar la propagación del virus a las células que de otro modo no estarían disponibles
para el virus. En los próximos años, es probable que los límites entre los eventos dirigidos
por virus y los procesos celulares que controlan funciones celulares especializadas sean
aún más complejos; no obstante, comprender estos procesos abrirá una gama de
objetivos para el desarrollo de nuevas terapias antivirales e inmunoterapia. Hay ejemplos
en los que la respuesta inmune innata incluso se usa para mejorar la propagación del
virus a las células que de otro modo no estarían disponibles para el virus. En los próximos
años, es probable que los límites entre los eventos dirigidos por virus y los procesos
celulares que controlan funciones celulares especializadas sean aún más complejos; no
obstante, comprender estos procesos abrirá una gama de objetivos para el desarrollo de
nuevas terapias antivirales e inmunoterapia. Hay ejemplos en los que la respuesta inmune innata incluso
cultivos
celulares para mejorar
Este capítulo presenta una visión general del tema, indicando similitudes y
diferencias en las estrategias de replicación adoptadas por los virus de cada familia
que contiene patógenos humanos. Las principales características y requisitos de
replicación de virus humanos se muestran en Tabla 4.1 . Se puede encontrar
información más detallada sobre la replicación de virus individuales en los capítulos
relevantes de la Parte II de este libro.
CRECIMIENTO DE VIRUS
Antes del desarrollo de in vitro En las técnicas de cultivo, los virus de los humanos solo
podían propagarse en animales de experimentación. Por lo tanto, gran parte de nuestro
conocimiento sobre el crecimiento y la replicación de virus se basó en primera instancia
en el estudio de virus bacterianos.
En 1931 se demostró que el virus vaccinia y el virus del herpes simple
podían crecer en la membrana corioalantoidea de los huevos de gallina
embrionados. Este sistema se convirtió en rutina para el estudio de muchos virus
de mamíferos, ya que prácticamente todas las familias de virus contienen virus
que pueden ser
Fenner y la virología médica de White. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-375156-0.00004-7
© ©2017
2012 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
cultivado de esta manera. Aunque el cultivo celular ha reemplazado desde hace mucho
tiempo el uso de huevos para este propósito, la tecnología todavía está en uso para la
preparación de reservas de virus de influenza y la fabricación de vacunas contra la
influenza.
El desarrollo de in vitro El sistema de cultivo celular fue un desarrollo decisivo en
virología: no solo fue posible diseccionar los eventos intracelulares que acompañan la
replicación del virus de una manera similar a la del estudio de bacteriófagos en células
bacterianas, sino que también proporcionó un medio para cuantificar la cantidad de
infecciones virus en muestras y stocks de virus. El medio artificial se desarrolló para
mantener la viabilidad celular independiente de la especie fuente: estas células podrían
estar en forma de cultivos de órganos, cultivos de explantes, monocapas de cultivos
celulares primarios o cultivos de células monocapa inmortalizadas en líneas celulares. Los
cultivos de órganos mantienen la estructura tridimensional del tejido de origen y pueden
ser útiles para experimentos a corto plazo que dependen de preservar células
completamente diferenciadas. Por ejemplo, Las células epiteliales traqueales unidas a la
matriz del cartílago de la tráquea durante el cultivo desempeñaron un papel crítico en el
aislamiento de muchos virus respiratorios humanos. La preparación de cultivos celulares
primarios usa proteasas como tripsina o colagenasa para separar células individuales de
un tejido como riñón o pulmón fetal, y las células individuales se unen a un sustrato de
cultivo celular donde ocurrirá un número limitado de divisiones. La vida útil limitada de
estas células requiere la preparación repetida de nuevos cultivos a partir del tejido fuente,
presentando claramente problemas de reproducibilidad. En contraste, la propagación
continua de células es posible con dos tipos de cultivo a largo plazo: La preparación de
se usa primarios
usa la propagación
proteasas comodel virus ao las
tripsina células que
colagenasa deseparar
para otro modo no estarían disponibles p
células individuales de un tejido como riñón o pulmón fetal, y las células individuales se
unen a un sustrato de cultivo celular donde ocurrirá un número limitado de divisiones. La
vida útil limitada de estas células requiere la preparación repetida de nuevos cultivos a
partir del tejido fuente, presentando claramente problemas de reproducibilidad. En
contraste, la propagación continua de células es posible con dos tipos de cultivo a largo plazo: La preparación de
1) Cepas de células "semicontinuas", "diploides", por ejemplo,
pulmón humano o fibroblastos del prepucio (WI-38, MRC-5), en el que las células
eventualmente senescen después de 20 a 30 divisiones (el "número de Hayflick")
debido al acortamiento progresivo de los telómeros, y
2) Líneas celulares inmortalizadas continuas, por ejemplo, HeLa
células, células BHK-21. Estos se derivan de tumores o de células
primarias que han sufrido un evento de transformación espontánea
durante el cultivo celular, y pueden sufrir un número casi infinito de
divisiones celulares, generando consistencia, aunque a menudo
acompañado de una pérdida de funciones celulares diferenciadas. Por
ejemplo, las células HeLa se aislaron originalmente en cultivo celular
de un paciente que murió de cáncer cervical.
39
40 PARTE | yo Principios de virología

CUADRO 4.1 Características de la replicación de virus entre familias de diferentes familias

Ruta de captación Sitio de replicación de Período de Sitio de maduración o

ácido nucleico eclipse (h una) incipiente

Poxviridae Variable Citoplasma 44 Membrana de Golgi

Herpesviridae Variable Núcleo 44 Membrana nuclear

Adenoviridae Endocitosis mediada por clatrina Núcleo 10 Núcleo

Papillomaviridae Endocitosis mediada por clatrina Núcleo ? Núcleo

Polyomaviridae Endocitosis Caveolar Núcleo 12 Núcleo

Parvoviridae Endocitosis mediada por clatrina Núcleo 66 Núcleo

Circoviridae ? Núcleo ? Ninguna

Hepadnaviridae Endocitosis mediada por clatrina Núcleo / citoplasma ? Retículo

endoplásmico

Retroviridae Fusión de membrana plasmática o Citoplasma / núcleo 10 Membrana de plasma

endocitosis mediada por clatrina

Reoviridae Endocitosis mediada por clatrina Citoplasma 55 Citoplasma

Birnaviridae Incierto Citoplasma 44 Ninguna

Paramyxoviridae Fusión de membrana plasmática Citoplasma 44 Membrana de plasma

Rhabdoviridae Fusión de membrana plasmática Citoplasma 3 Membrana de plasma

Filoviridae Fusión de membrana plasmática Citoplasma 2 Membrana de plasma

Bornaviridae Endocitosis mediada por clatrina Núcleo ? Membrana de plasma

Orthomyxoviridae Endocitosis mediada por clatrina Núcleo 44 Membrana de plasma

Bunyaviridae Endocitosis mediada por clatrina Citoplasma 44 Membrana de Golgi

Arenaviridae Endocitosis mediada por clatrina Citoplasma 55 Membrana de plasma

Coronaviridae Endocitosis mediada por clatrina / fusión de Citoplasma 55 Retículo

membrana plasmática endosplásmico

Arteriviridae Endocitosis mediada por clatrina Citoplasma 55 Retículo

endoplásmico

Picornaviridae Endocitosis caveolar / inserción de Citoplasma 2 Citoplasma

membrana plasmática

Caliciviridae ¿Endocitosis caveolar / inserción de Citoplasma 3 Citoplasma

membrana plasmática?

Astroviridae ¿Endocitosis caveolar / inserción de Citoplasma 3 Citoplasma

membrana plasmática?

Togaviridae Endocitosis mediada por clatrina Citoplasma 2 Membrana de plasma

Flaviviridae Endocitosis mediada por clatrina Citoplasma 3 Retículo

endoplásmico

una Difiere con multiplicidad de infección, cepa de virus, tipo de célula y condiciones fisiológicas.

en 1951, pero las células siguen siendo un sistema importante para el cultivo de el microscopio óptico para detectar signos de cambio morfológico o muerte celular, en
virus hasta el día de hoy, y de hecho proliferan con tanto éxito que las células HeLa comparación con los cultivos celulares no inoculados que actúan como controles. La
pueden convertirse en contaminantes de cultivos celulares de otras fuentes. apariencia específica de la efecto citopático
(cpe) a menudo es diagnóstico para una determinada familia de virus, por ejemplo, los

herpesvirus pueden causar una citopatología distinta a menudo acompañada por la fusión

El reconocimiento de la presencia de un virus dependía inicialmente de la de células moribundas. Sin embargo, la dependencia de la citopatología puede dar

observación de cultivos a intervalos regulares bajo resultados falsos especialmente


FIGURA 4.1 Estrategias de replicación de virus basadas en la composición del genoma y las vías de síntesis viral de ARNm. Originario de Baltimore, D., 1971. Expresión de genomas de virus animales.
Bacteriol Rev. 35, 235–241. Entonces, modificado de Flint, SJ, et al., 2016. Principios de Virología, 4a ed. Washington,
DC, ASM Press, con permiso.
si la muestra está contaminada con toxinas bacterianas u otros agentes
adventicios no relacionados con el proceso patológico en estudio.
Usando tales sistemas, los mecanismos básicos de
La transcripción, la traducción y la replicación de ácido nucleico se han
caracterizado para todas las principales familias de virus vertebrados y se han
aclarado las estrategias de expresión y regulación génica. Cada familia de virus
emplea estrategias de replicación únicas. Un concepto unificador y simplificador
importante, como lo propuso originalmente David Baltimore en 1971, era asignar
todos los virus a una de las seis clases en función de su composición genómica y
la vía utilizada para producir ARNm para la traducción utilizando los ribosomas de
la célula huésped ( Fig. 4.1 ) Esto también refleja la propiedad parasitaria de todos
los virus al requerir una célula huésped para la síntesis de proteínas virales.
EL CICLO DE REPLICACIÓN DEL VIRUS
La mayoría de los estudios sobre la replicación de virus de humanos han utilizado células
de mamíferos cultivadas, cultivadas en suspensión o como una monocapa adherente a
una superficie plástica. Estudios clásicos
Replicación de virus Capitulo | 4 4 41
de este tipo definió el curva de crecimiento de un paso, en el que todas las células de un
cultivo se infectan simultáneamente utilizando un alto
multiplicidad de infección, y el aumento del virus infeccioso con el tiempo se mide
mediante muestreo secuencial y titulación de virus infeccioso ( Fig. 4.2 ) Es
importante comprender que, con la infección sincrónica de toda la población
celular, los eventos observados en el cultivo total pueden usarse para estudiar
eventos en una sola célula. El tiempo para alcanzar el rendimiento máximo de
virus varía de 6 horas (poliovirus) a más de 24 horas (adenovirus), en
comparación con un tiempo de generación para E. coli en caldo de cultivo de 15 a
20 minutos.
El virus liberado en el medio se puede valorar por separado del virus que
permanece asociado a las células. Poco después de la infección, el virus
inoculado "desaparece": no se pueden detectar partículas infecciosas, incluso si
las células están alteradas. Esta periodo de eclipse continúa hasta que se detectan
los primeros viriones de la progenie algunas horas después. A medida que
avanza la infección, los virus no envueltos maduran dentro de la célula y pueden
detectarse como viriones intracelulares infecciosos durante algunas horas antes
de ser liberados por lisis celular. Muchos virus envueltos, por otro lado, maduran
brotando del plasma.
42 PARTE | yo Principios de virología
FIGURA 4.2 Curva de crecimiento en un solo paso de un virus con y sin envoltura. El apego y la
penetración son seguidos por un período de eclipse de 2 a 12 horas durante el cual no se puede detectar
la infectividad asociada a las células. Esto es seguido por un período de varias horas cuando ocurre la
maduración viral. Los viriones de los virus sin envoltura (p. Ej., Adenovirus, parte superior) a menudo se
liberan tarde, cuando la célula se lisa. La liberación de viriones envueltos (p. Ej., El virus de la encefalitis
equina occidental de togavirus) ocurre simultáneamente con la maduración por brotación de la membrana
plasmática. Adaptado de Flint, SJ, et al., 2009. Principles of Virology, tercera ed. ASM Press, Washington,
DC.
membrana de la célula huésped y se liberan en el medio. La liberación del virus por
lisis celular es abrupta, mientras que la liberación por brotación puede continuar
durante un período prolongado de tiempo. El período del eclipse generalmente
varía de 2 a 12 horas para virus de diferentes familias.
Estudios tempranos, confiando en electrones cuantitativos
La microscopía y el ensayo de viriones infecciosos proporcionaron una visión
general del ciclo de replicación (fijación, penetración, maduración y liberación),
pero con pocos detalles sobre los procesos involucrados. La investigación de la
expresión y replicación del genoma viral se hizo posible después de la
introducción de métodos bioquímicos para el análisis de ácidos nucleicos y
proteínas virales. Además, los métodos de imagen también están disponibles hoy
en día que permiten el seguimiento de proteínas virales y celulares a medida que
avanza el ciclo de replicación viral.
Adjunto archivo
Para iniciar la infección, los viriones primero deben unirse a las células. La unión
se produce entre ligandos en la superficie del virión ( proteínas de unión viral) y
receptores en la membrana plasmática de la célula ( Tabla 4.2 ) Esta interacción
inicial entre el virus y la célula huésped a veces es compleja y con frecuencia
existe una falta de correlación entre los estudios de apego en células cultivadas
versus huéspedes intactos. Por ejemplo, varias glucoproteínas de la envoltura
viral de los virus del herpes pueden servir como proteínas de unión y pueden
estar involucrados varios receptores celulares, en orden secuencial, primero
logrando una unión floja a través de un receptor, luego uniéndose
irreversiblemente a través de un segundo receptor y ligando. La explotación de
más de un ligando celular proporciona redundancia y también puede ayudar a los
herpesvirus a invadir los tejidos epiteliales y neurales para apoyar los ciclos de
infección latente / reclutante.
Si bien existe un grado de especificidad sobre el reconocimiento de receptores
celulares particulares por virus particulares, virus bastante diferentes (p. Ej.,
Ortomixovirus y virus paramyxo) pueden utilizar el mismo receptor y, por el contrario,
los virus de la misma familia o género pueden usar receptores diferentes. Por lo tanto,
los virus han evolucionado haciendo un uso oportunista de una amplia variedad de
proteínas de la superficie de la célula huésped como receptores: en la mayoría de los
casos, los virus emplean como receptores las proteínas de la célula huésped que son
cruciales para las funciones celulares fundamentales, muchas de las cuales están
fuertemente conservadas durante el tiempo evolutivo.
La interacción receptor-ligando entre las células humanas y el virus de
inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) ilustra la complejidad de la interacción
entre el virus y las proteínas del huésped. Inicialmente, la fijación implica
moléculas de CD4 en la superficie de las células diana, especialmente los
macrófagos y los linfocitos T auxiliares, a través de la glicoproteína de la
envoltura gp120 viral. Esta unión induce un cambio conformacional que expone
un sitio de unión al receptor de quimiocinas de alta afinidad en gp120, que une
uno de varios receptores de quimiocinas en la superficie celular. Esta última
unión a su vez expone un dominio fusogénico de la proteína viral
transmembrana gp41. El contacto directo entre el dominio fusogénico de gp41 y
la membrana celular provoca la fusión de la envoltura viral con la membrana
plasmática de la célula, permitiendo que la nucleocápside viral ingrese al
citoplasma celular (ver Fig. 23.6).
El receptor celular para la mayoría de los ortomixovirus es el ácido siálico
terminal en una cadena lateral de oligosacáridos de una glucoproteína (o glucolípido)
expuesta en la superficie celular: el ligando viral está en una hendidura en la punta
distal de cada monómero de la glucoproteína hemaglutinina viral trimérica (ver
Capítulo 3: Estructura y composición de Virion). Los virus pueden adaptarse a
nuevos anfitriones mediante la modificación del ligando de unión relevante. Por
ejemplo, los virus de la influenza A se originan en aves acuáticas y reconocen los
residuos de ácido siálico en la superficie de las células a lo largo del tracto
respiratorio. Sin embargo, los virus de la gripe A de las aves tienen una mayor
afinidad por el ácido siálico unido al penúltimo resto de galactosa a través de α 2-3
enlaces, mientras que los de los humanos tienen una mayor afinidad por el siálico
 Replicación de virus Capitulo | 4 4 43

CUADRO 4.2 Ejemplos de receptores celulares para virus de virus de importancia médica

Familia Receptor

Virus de inmunodeficiencia humana Retroviridae CD4; Coreceptores CCR5, CXCR4, CCR3

Virus de la vacuna Poxviridae Varios (heparán sulfato, condroitín sulfato glicosaminoglicanos, laminina)

Poliovirus Picornaviridae PVR (CD155): superfamilia de inmunoglobulina (Ig)

Rinovirus humano 14 Picornaviridae Molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1); Ig superfamilia

Echovirus 1 Picornaviridae α 2 / β 1 integrina VLA-2

Virus de la hepatitis A Picornaviridae HAVCR1; miembro de la familia TIM-1 (transmembrana, Ig, mucina)

Adenovirus Adenoviridae CAR (receptor de Coxsackie y adenovirus), miembro de la superfamilia Ig; coreceptor α v integrinas

Virus del herpes simple 1 Herpesviridae HveA (mediador de entrada de herpesvirus A), proteoglicano de heparán sulfato

Citomegalovirus humano Herpesviridae Proteoglicano de sulfato de heparán

Virus de Epstein Barr Herpesviridae CD21, receptor 2 del complemento (CR2)

Virus adenoasociado 5 Parvoviridae α ( Ácido siálico 2,3) ligado

Virus de la influenza A Orthomyxoviridae α ( 2,3) - o α ( 2,6) - α ácido siálico ligado

Virus de la influenza C Orthomyxoviridae 9- O- acido acetilsialico

Virus Hendra Paramyxoviridae Efrina-B2

Rotavirus Reoviridae Diversas integrinas

Reovirus Reoviridae JAM (moléculas de adhesión de unión)

Virus del dengue Flaviviridae Proteoglicano de sulfato de heparán

Virus de la rabia Rhabdoviridae Acetilcolina, NCAM (molécula de adhesión neural)

Los poliomavirus Polyomaviridae Varios gangliósidos (glucosfingolípidos con ácido siálico terminal)

ácido unido a través de un α Enlace 2-6; Esto refleja diferencias en la abundancia
relativa de los dos vínculos en las diferentes especies hospederas. Hay una
considerable sutileza en estas interacciones, y al igual que con muchos virus humanos
y animales, un solo cambio de aminoácidos dentro de un sitio receptor puede
manifestarse como un cambio significativo en el rango y la epidemiología del huésped.
Las reacciones proinflamatorias en el huésped también pueden afectar la expresión
de los receptores y, por lo tanto, modificar indirectamente las interacciones entre el virus y
las posibles células huésped. Por ejemplo, el adenovirus humano 5 reconoce tanto el
receptor de Coxsackievirus como el receptor de adenovirus (CAR) y α v β 3/5 de integrina
para infectar células, sin embargo, ninguno de los dos está normalmente expuesto en las
superficies apicales de las células hasta que los macrófagos responden a la infección y
secretan IL-8. Esto a su vez mueve el CAR y
α v β 3/5 receptores de integrina lejos de las uniones estrechas de las células polarizadas
hacia la superficie celular apical y, por lo tanto, quedan expuestos y disponibles para la
unión del virus.
Penetración y sin recubrimiento
La mayoría de las células de mamíferos participan continuamente endocitosis Varios otros virus importantes envueltos, por ejemplo filovirus, tienen
mediada por receptor para la captación
de macromoléculas a través de receptores específicos. Muchos virus envueltos
y no envueltos usan esta función celular esencial para iniciar la penetración y el
recubrimiento ( Fig. 4.3 ) La unión de Virion a esos receptores agrupados en recubierto
de clatrina
pozos es seguido por endocitosis en vesículas recubiertas de clatrina. Las
vesículas ingresan al citoplasma y, después de retirar la cubierta de clatrina, se
fusionan con los endosomas (vacuolas prelysosomales ácidas). La acidificación
dentro de la vesícula desencadena cambios en las proteínas del virión y las
estructuras superficiales. Por ejemplo, el pH ácido dentro del endosoma induce
a las moléculas de hemaglutinina de los virus de la gripe a sufrir un cambio
conformacional. Esto permite que se produzca la fusión entre la envoltura viral y
la membrana endosómica y da como resultado la liberación de la nucleocápside
viral en el citoplasma. Muchos otros virus no envueltos y envueltos sufren
cambios comparables.
La fusión a pH neutro es un mecanismo alternativo. La glicoproteína
F (fusión) de los paramixovirus hace que la envoltura viral se fusione
directamente con la membrana plasmática de la célula, incluso a pH 7.
Esto permite que la nucleocápside se libere directamente al citoplasma.
44 PARTE | yo Principios de virología

FIGURA 4.3 Mecanismos endocíticos para la entrada de virus. La endocitosis en las células animales puede ocurrir a través de cuatro mecanismos principales: endocitosis mediada por clatrina (CME); macropinocitosis;

caveolae / balsas lipídicas; y fagocitosis (partículas más grandes,> 0.75 μ METRO). Tenga en cuenta que las vías IL-2, GEEC (compartimento endosómico temprano enriquecido con GPI), Flotillin y Arf6 (ADP-ribosylation factor

6) importan carga celular específica, pero actualmente no se sabe que los virus usen estas rutas.

VSV virus de estomatitis vesicular; SFV, Virus del bosque Semliki; HSV virus del herpes simple; LCMV, virus de la coriomeningitis linfocítica; SV40, virus simio 40; mPy, poliomavirus de ratón; VPH virus
del papiloma humano. Reproducido de MacLachlan, NJ, Dubovi, EJ, 2011. Veterinary Virology, cuarta edición. Academic Press, Londres (Fig. 2.5), con permiso.

FIGURA 4.4 Mecanismo de entrada de poliovirus. El virus se une a receptores específicos en la membrana plasmática de la célula huésped (CD155 = receptor de poliovirus Pvr). Los receptores inducen cambios
conformacionales en el virión (el virión infeccioso 160S se convierte en una partícula 135S), con la pérdida de VP4 y la externalización del extremo N-terminal de VP1. Las partículas 135S se internalizan luego
por un mecanismo independiente de clatrina y caveolina, pero dependiente de actina y tirosina quinasa. La liberación del genoma viral tiene lugar solo después de la internalización desde un compartimento
endocitótico localizado dentro de 100 a 200 nm de la membrana plasmática. Tras la liberación del genoma de ARN, la cápside vacía (80S) se transporta a lo largo de los microtúbulos. Reproducido de
Brandenburg, B., et al., 2007, entrada de imágenes de poliovirus en células vivas. PLoS Biol 5 (7), e183. doi: 10.1371 / journal.pbio.0050183, con permiso.

La capacidad de fusionarse con la membrana plasmática de la célula huésped,
permitiendo así la entrada de ácido nucleico viral en el citosol.
Un tercer mecanismo de entrada ("entrada directa") es utilizado por algunos
virus no envueltos (por ejemplo, poliovirus, adenovirus).
Esto implica la unión del virus a los receptores en la membrana endosómica, lo que
induce cambios conformacionales en la cápside viral; Estos cambios luego
exponen regiones que reaccionan con la membrana endosómica para inducir
canales para el transporte del genoma a través de la membrana plasmática ( Fig.
4.4 )

FIGURA 4.5 Dos mecanismos de síntesis de genomas de virus de ADN. Los pacientes con papilomavirus, poliomavirus y herpesvirus usan una horquilla de replicación. Esto implica el inicio de un cebador de
ARN; La síntesis a lo largo de la cadena principal es continua, pero discontinua a lo largo de la cadena retrasada con la formación de fragmentos de Okazaki que posteriormente se ligan. Con genomas
circulares de ADN, la síntesis procede bidireccionalmente desde el sitio de origen. Alternativamente, los genomas de ADN de adenovirus, parvovirus y poxvirus se replican por desplazamiento de cadena,
utilizando como cebadores proteínas (adenovirus) u horquillas de ADN (parvovirus y poxvirus). Reproducido de Flint, SJ, et al., 2009. Principles of Virology, tercera ed. ASM Press, Washington, DC, con
permiso.
Para que los genes virales estén disponibles para la transcripción, es necesario que
los viriones estén al menos parcialmente sin recubrimiento. En el caso de los virus de
ARN envueltos que ingresan por el proceso de fusión, la nucleocápside se descarga
directamente en el citoplasma y la transcripción comienza desde el ácido nucleico viral
mientras aún está asociada con la (s) proteína (s) de la nucleocápside. Con los reovirus
icosaédricos sin envoltura, solo se eliminan ciertas proteínas de la cápside y el genoma
viral expresa todas sus funciones sin ser liberado del núcleo del virión. Sin embargo, para
la mayoría de los otros virus, la eliminación del recubrimiento continúa hasta su
finalización, de lo contrario no se puede realizar la duplicación del genoma. Para algunos
virus, la eliminación del recubrimiento se lleva a cabo en el núcleo donde ocurren las
etapas posteriores de replicación.
Replicación de ácidos nucleicos virales
Replicación de ADN viral
Cada familia de virus de ADN emplea diferentes mecanismos de
replicación del ADN ( Fig. 4.5 ) Estos implican la síntesis de cadenas hijas
a través de un horquilla de replicación
(papilomavirus, poliomavirus, herpesvirus) o vía desplazamiento del
hilo (adenovirus, parvovirus,
poxvirus). Dado que las ADN polimerasas celulares no pueden iniciar la síntesis de una
nueva cadena de ADN, sino que solo pueden extender la síntesis a partir de un cebador
corto (p. Ej., ARN), se puede esperar que un extremo de las moléculas de ADN viral
recién sintetizadas retengan una región de cadena sencilla corta. Varios virus de ADN
han desarrollado diferentes estrategias para sortear este problema. Los virus de algunas
familias tienen un genoma de ADN circular, otros tienen un genoma lineal con terminales
complementarios que sirven como cebadores de ADN, mientras que otros tienen un
cebador de proteínas unido covalentemente a los 5 ʹ- terminal de cada cadena de ADN.
Replicación de virus Capitulo | 4 4 45
Generalmente se requieren varias actividades enzimáticas codificadas por virus
para la replicación del ADN viral: una helicasa (con actividad ATPasa) para
desenrollar la doble hélice; una proteína desestabilizadora de hélice para mantener
separadas las dos hebras separadas hasta que se haya copiado cada una; una ADN
polimerasa para copiar cada cadena del origen de replicación en un 5 ʹ- a 3 ʹ- dirección;
una ARNasa para degradar el cebador de ARN después de que haya cumplido su
propósito; y una ADN ligasa para unir los fragmentos de Okazaki. A menudo, una sola
enzima grande realiza dos o más de estas actividades.
Los genomas de los virus del papiloma y los poliomavirus se asemejan
estructural y funcionalmente al ADN celular al unirse a las histonas celulares. El
genoma viral utiliza la ADN polimerasa del huésped α- primasa para sintetizar el
cebador de ARN para la replicación del genoma. Entre los poliomavirus, un
antígeno viral temprano, T grande, se une a la secuencia reguladora, y en el caso
de los virus del papiloma E1 y E2, iniciando así la replicación del ADN. La
replicación de estas moléculas circulares de ADN de doble cadena comienza a
partir de una secuencia palindrómica única y continúa simultáneamente con
horquillas de replicación en ambas direcciones. Se producen síntesis de ADN
continuas y discontinuas (de cadenas principales y secundarias, respectivamente)
en las dos horquillas en crecimiento en cuanto a la replicación de ADN de
mamíferos. La síntesis discontinua de la cadena rezagada implica la síntesis
repetida de cebadores de oligoribonucleótidos cortos, que a su vez inician cadenas
nacientes cortas de ADN ( Fragmentos de Okazaki), cada uno se une
covalentemente por una ADN ligasa para formar una de las cadenas en
crecimiento.
La replicación de los adenovirus es distinta de la de otros virus de
ADN. El genoma de ADN de adenovirus es lineal, el 5 ʹ- El extremo de
cada cadena es idéntico al otro (secuencias invertidas repetidas
terminalmente) y está unido covalentemente a una proteína, cuyo
precursor sirve como el
46 PARTE | yo Principios de virología

cebador para la síntesis de ADN viral. La replicación del ADN procede de ambos Replicación de ARN viral
extremos, de forma continua pero asíncrona, en un 5 ʹ- a 3 ʹ- dirección, utilizando una
La transcripción de ARN de una plantilla de ARN es un fenómeno exclusivo de
ADN polimerasa codificada por virus. No requiere la síntesis de fragmentos de
los virus ( Fig. 4.6 ), y requiere una ARN polimerasa dependiente de ARN, una
Okazaki.
enzima codificada por virus que no se encuentra en las células no infectadas.
Los virus del herpes codifican muchas o todas las proteínas necesarias para la
La replicación del ARN viral requiere primero la síntesis de ARN
replicación del ADN, incluida una ADN polimerasa, una helicasa, una primasa, una
complementario: esto a su vez sirve como plantilla para la síntesis de más
proteína de unión al ADN monocatenaria y una proteína que reconoce el origen de la
copias de ARN viral.
replicación. Los poxvirus, que se replican completamente dentro del citoplasma, son
autosuficientes en la maquinaria de replicación del ADN. Los hepadnavirus, similares a
Para virus donde el ARN viral es de sentido negativo
los retrovirus, utilizan transcripciones de ARN monocatenario de sentido positivo como
(ortomixovirus, paramixovirus rabdovirus,
intermedios para la producción de ADN de progenie mediante un proceso de
filovirus, bornavirus, arenavirus y bunyavirus), el ARN complementario
transcripción inversa. Los parvovirus de ADN monocatenario usan 3 ʹ- secuencias
es de sentido positivo y la ARN polimerasa involucrada desempeña la
palindrómicas para formar una estructura de horquilla de doble hebra para proporcionar
misma función que la transcriptasa asociada al virión utilizada para la
un cebador para la unión de la ADN polimerasa celular.
transcripción primaria de ARNm. La mayoría de las transcripciones de
tales

FIGURA 4.6 Se muestran estrategias para la replicación y la síntesis de ARNm de los genomas del virus ARN para familias de virus representativas. El ARN genómico picornaviral está vinculado a VPg en el
extremo 5 '. El ARN genómico (+) de algunos flavivirus no contiene poli (A). Solo se muestra un segmento de ARN para segmentado ( ±) virus de ARN de cadena. Las estructuras de tapa se muestran como cuadros
azules que contienen "C". Reproducido de Flint, SJ, et al., 2016. Principles of Virology, 4th ed. Washington, DC, ASM Press, con permiso.
 Replicación de virus Capitulo | 4 4 47

Los ARN virales de sentido negativo son moléculas de ARNm subgenómico, pero Descripción general de las estrategias de expresión génica viral
también deben formarse algunas cadenas de sentido positivo de longitud completa,
Distinguir las diversas estrategias utilizadas por los virus para la producción de
para que sirvan como plantillas para la síntesis (replicación) de ARN viral de
proteínas virales es fundamental para comprender la replicación del virus ( Fig.
progenie completa. Para algunos virus hay buena evidencia de que las ARN
4.1 ) Un resumen de las propiedades de las proteínas virales se da en Tabla 4.3 .
polimerasas utilizadas para la transcripción y la replicación son distintas, en otros la
Para muchos virus, la producción de proteínas virales inmediatamente después
misma enzima realiza ambas funciones.
de la entrada del genoma viral es un paso crítico. Estas proteínas tempranas
actúan para subvertir la maquinaria molecular del huésped,
En el caso de los virus de ARN de sentido positivo
(picornavirus, calicivirus, togavirus, flavivirus,
coronavirus y arterivirus), el ARN complementario es de sentido negativo, y su
único propósito es proporcionar una plantilla para la síntesis de más ARN de
CUADRO 4.3 Propiedades de las proteínas virales
sentido positivo. Se pueden transcribir simultáneamente varias moléculas de ARN
virales desde una única plantilla de ARN complementaria, siendo cada Categoría de proteínas Ejemplos y comentarios
transcripción de ARN el producto de una molécula de polimerasa unida por
Proteínas estructurales 1. Capsid, y (para algunos virus)
separado. La estructura resultante, conocida como la intermedio replicativo, del virión. proteínas centrales y / o
envolventes y de matriz
por lo tanto, es parcialmente bicatenario con colas monocatenarias. Algunas ARN
2. Enzimas asociadas a viriones,
polimerasas dependientes de ARN pueden iniciar la síntesis de ARN de novo mientras
especialmente polimerasas
que otros requieren una imprimación con un 3 gratis ʹ- Grupo OH al que se pueden (transcriptasas) una
agregar más nucleótidos. El inicio de la replicación de picornavirus y calicivirus de
Proteínas no estructurales, ADN y ARN polimerasas, helicasas,
ARN, similar al ADN de adenovirus, requiere una proteína unida como cebador,
principalmente enzimas, necesarias proteasas, etc. Los virus de ADN con
en lugar de un oligonucleótido. Esta pequeña proteína está unida covalentemente
para la transcripción, replicación de genomas complejos grandes, especialmente
a los 5 ʹ- terminal de cadenas nacientes de ARN positivo y negativo además del ácido nucleico viral y escisión de poxvirus y herpesvirus, también codifican
ARN de virión, pero no a las moléculas utilizadas como ARNm. Poco se sabe proteínas numerosas enzimas necesarias para la

sobre lo que determina si una molécula de ARN de sentido positivo de síntesis de nucleótidos

picornavirus dado será dirigida (1) a un complejo de replicación ( una estructura

unida al retículo endoplásmico liso), donde sirve como plantilla para la Proteínas reguladoras que Proteínas de unión al ADN específicas del

transcripción por la ARN polimerasa dependiente de ARN en ARN de sentido controlan la secuencia temporal sitio (factores de transcripción) que se unen a
de expresión del genoma viral. secuencias potenciadoras en el genoma viral
negativo, o (2) a un ribosoma
u otro factor de transcripción. Algunos pueden
actuar en trans (transactivadores)

donde sirve como ARNm para la traducción en proteína, o (3) a un procapsid con
el que se asocia para formar un virión.
Las proteínas regulan Por lo general, inhibiendo la
Otras ARN polimerasas requieren un oligonucleótido 5 ʹ negativamente la expresión de transcripción, a veces la traducción
estructura de la tapa, que puede ser sintetizada por enzimas virales o derivada genes celulares

de los ARNm celulares mediante un proceso de "capnatching" (p. ej., Capítulo

Productos oncogénicos Mejora la expresión de ciertos genes
25: Ortomixovirus). (oncoproteínas) e inactivadores de celulares; puede conducir a la
Los retrovirus tienen un genoma que consiste en ARN monocatenario de proteínas supresoras de tumores transformación celular y eventualmente
sentido positivo. A diferencia de otros virus de ARN, los retrovirus se replican a celulares. al cáncer. Observado con herpesvirus,
adenovirus, papovavirus y retrovirus
través de un intermedio de ADN. La transcriptasa inversa asociada al virión, que usa
una molécula de ARN de transferencia (ARNt) como cebador, hace una copia de
ADN monocatenario, mientras que la misma enzima funciona simultáneamente Proteínas que influyen en la virulencia Registrado hasta ahora principalmente en
viral, el rango del huésped, el tropismo los virus de ADN más complejos (poxvirus,
como una ribonucleasa y elimina la molécula de ARN parental de la mayoría del
de los tejidos, etc. herpesvirus, adenovirus) pero puede estar
ADN: híbrido de ARN , excepto por varios tramos cortos de ARN conocidos como
más extendido
tractos de poli-purina. Los tractos de poli-purina actúan entonces como cebadores
para copiar la cadena de ADN monocatenario de sentido negativo para formar un
Virokines, que actúan sobre las Principalmente subvirtiendo la respuesta
ADN lineal de doble cadena que contiene una secuencia adicional conocida como repetición
células no infectadas para inmune, por ejemplo, inhibiendo las
terminal larga ( LTR) en cada extremo. Este ADN bicatenario luego es procesado por modular el progreso de la citocinas, regulando negativamente la
la integrasa viral y se integra en el ADN cromosómico celular. A partir de este infección en todo el cuerpo expresión de MHC, bloqueando la

momento, la transcripción del ARN viral se produce a partir del ADN integrado cascada del complemento, etc.

(proviral) (ver Capítulo 23: Retrovirus).

una Los virus de ARN de virus de sentido positivo y de ADN que se replican en el núcleo no llevan

una transcriptasa en el virión. Viriones de algunos virus,

Por ejemplo, los poxvirus también contienen muchas otras enzimas.
48 PARTE | yo Principios de virología
para permitir la producción posterior de nuevas partículas de virus e inhibir la
activación de la inmunidad innata del huésped que de otro modo evitaría la
replicación del virus y se propagaría a las células y tejidos adyacentes.
Para la mayoría de las familias de virus de ADN, la transcripción y la
replicación de ADN tienen lugar en el núcleo celular, utilizando ARN polimerasa II
celular y otras enzimas celulares. Para virus como poxvirus y herpesvirus, es
posible identificar un número significativo de genes por deleción génica (más del
40%) que no son esenciales para la replicación del virus en las células cultivadas.
Por supuesto, en la economía estricta de los genomas virales es probable que la
mayoría o la totalidad de dichos genes sean importantes para la supervivencia del
virus en la naturaleza.
La situación es bastante diferente para los virus de ARN, ya que estos son
únicos con información genética codificada como ARN. Por lo tanto, se debe hacer
un esfuerzo para comprender las distintas estrategias de replicación y expresión,
particularmente dado que estas tienen una relación con la comprensión de la
patogénesis del virus. Los virus de ARN con diferentes tipos de genomas
(monocatenarios o bicatenarios, de sentido positivo o negativo, monopartitos o
segmentados) necesariamente han desarrollado diferentes rutas para la
producción de ARNm. Dado que las células eucariotas no contienen una ARN
polimerasa dependiente de ARN, todos los virus de ARN deben codificar una ARN
polimerasa dependiente de ARN única. En el caso de los virus de ARN
monocatenario de sentido positivo, el genoma de ARN entrante puede unirse
directamente a los ribosomas y traducirse total o parcialmente sin la necesidad de
ninguna transcripción previa; todas las otras formas de ARN viral entrante deben
primero transcribirse para producir ARNm, para comenzar el proceso de expresión
del genoma viral infectante. Por lo tanto, tanto los virus de ARN monocatenario de
sentido negativo como los virus de ARN bicatenario deben portar una ARN
polimerasa dependiente de ARN en el virión, que se origina en la ronda anterior de
infección.
En el caso de los virus de ADN que dependen del núcleo para la replicación,
la ARN polimerasa II dependiente del ADN celular realiza esta función, mientras
que los virus de ADN bicatenarios que se replican en el citoplasma llevan una
ARN polimerasa dependiente de ADN codificada por el virus.
Muchos, pero no todos, los virus expresan diferentes genes en diferentes
etapas del ciclo de replicación. Genes virales tempranos
primero se transcriben en ARN, que luego puede procesarse de varias
maneras, incluido el empalme. Los primeros productos genéticos traducidos
de este ARNm son de tres tipos principales: proteínas que desactivan la
síntesis de proteínas y ácido nucleico celular, proteínas que regulan la
expresión del genoma viral y enzimas necesarias para la replicación del ácido
nucleico viral. Después de la replicación de ácido nucleico viral,
genes virales tardíos se transcriben
Las proteínas tardías son principalmente proteínas estructurales virales utilizadas
para el ensamblaje de nuevos viriones; algunos de estos están sujetos a modificaciones
postraduccionales antes de su uso, y a menudo se realizan en exceso considerable. Las
proteínas estructurales para el recubrimiento de genomas virales nacientes se requieren
en múltiples
copias para cada nueva molécula de ácido nucleico destinada a la encapsidación.
Por esta razón, muchas estrategias virales han evolucionado para que nuevas
copias del genoma viral puedan actuar como plantillas para la transcripción y
traducción específicas adicionales de proteínas estructurales requeridas para
nuevas partículas de virus.
La existencia de marcos de lectura superpuestos, múltiples patrones de
empalme de transcripciones de ARN, escisión postraduccional de poliproteínas,
etc., significa que es demasiado simplista suponer que un gen en particular
codifica una proteína en particular. Es más apropiado referirse a un unidad de
transcripción, definido como una región del genoma que comienza con el sitio de
inicio de la transcripción y se extiende hasta el sitio de terminación de la
transcripción (incluidos todos los intrones y exones intermedios), cuya expresión
se encuentra bajo el control de un promotor particular.
Algunas proteínas virales sirven como proteínas reguladoras, modulando la
transcripción o traducción de genes celulares o regulando negativamente los genes
virales tempranos. Los grandes virus de ADN también codifican numerosas proteínas
adicionales, llamadas virokines,
que no regulan el ciclo de replicación viral per se, pero influyen en la respuesta del
huésped a la infección. Se incluyen entre estos los homólogos de proteínas
virales de las citocinas celulares.
En 1978, Walter Fiers y sus colegas presentaron la primera
descripción completa del genoma de un virus animal, a saber, el del
poliomavirus SV40 (ver Fig. 20.2). El análisis de la molécula circular
de ADN bicatenario y su transcripción reveló algunas ideas
notables, muchas de las cuales ahora son aplicables a otros virus
de ADN bicatenario. Primero, los genes tempranos y tardíos se
transcriben en direcciones opuestas, de diferentes cadenas del
ADN. Segundo, ciertos genes se superponen, los productos
proteicos generados tienen secuencias de aminoácidos comunes.
En tercer lugar, algunas regiones del ADN viral pueden leerse en
diferentes marcos de lectura (ORF), de modo que se traducen
secuencias de aminoácidos bastante distintas de la misma
secuencia de nucleótidos. Cuarto,
Los adenovirus ejemplifican algunos de los mecanismos que regulan
la expresión de genomas virales a nivel de transcripción. Hay varias
unidades de transcripción de adenovirus; en diferentes etapas del ciclo
de replicación viral, las unidades de transcripción "pre-temprana",
"temprana", "intermedia" y "tardía" se transcriben en una secuencia
temporal precisa. Un producto de la región temprana E1A induce la
transcripción de las otras regiones tempranas, incluida E1B, pero
después de la replicación del ADN viral hay un aumento de 50 veces en
la tasa de transcripción del promotor tardío principal en relación con
promotores tempranos como E1B, y una disminución en los niveles de
ARNm E1A. Un segundo control opera en el punto de terminación de la
transcripción. Al principio del ciclo de replicación, las transcripciones
terminan en un punto particular del genoma,

para producir una gama de transcripciones más largas con diferentes sitios de
poliadenilación y proteínas de diferentes funciones. Este es solo uno de los
muchos ejemplos de la economía de los genomas virales en la codificación de
funciones complejas utilizando secuencias mínimas de ácido nucleico.
Para los virus de ARN, la regulación de la transcripción, en general, no es
tan compleja como es el caso de los virus de ADN. En particular, la separación
temporal en genes tempranos transcritos antes de la replicación de ácido
nucleico viral, y genes tardíos posteriores, no está tan bien definida. En los
ejemplos más simples (p. Ej., Picornavirus), se traduce un ARNm policistrónico
de longitud completa y la poliproteína resultante se escinde posteriormente para
producir cantidades equimolares de todos los productos proteicos. Los togavirus
sintetizan cantidades excesivas de proteínas estructurales de un ARN
subgenómico separado.
Sin embargo, otros mecanismos de regulación han evolucionado entre virus
con genomas de ARN de sentido negativo no segmentados. Una vez que la
nucleocápside se libera en el citoplasma de una célula infectada, la ARN
polimerasa inicia la transcripción de los 3 ʹ- Fin del genoma. Con los
paramixovirus, los genes discretos a lo largo del ARN viral están separados por
una secuencia de consenso que incluye señales de terminación e inicio, así como
secuencias intergénicas cortas de residuos U que permiten que la transcriptasa
genere una larga cola de poli (A) para cada ARNm mediante un proceso de copia
reiterativa (también conocida como tartamudeo). Cada ARNm discreto se libera de
la plantilla mientras la enzima continúa transcribiendo el siguiente gen en
secuencia. A medida que la polimerasa se mueve de 3 ʹ a 5 ʹ a lo largo de la
plantilla, a veces se producen cantidades decrecientes de cada ARNm debido a
la disminución de la eficiencia del proceso de transcripción; por lo tanto, el orden
de los genes se convierte en una forma eficiente de modular la cantidad relativa
de cada proteína sintetizada.
Existe un considerable interés en las regiones no traducidas de los genomas
La transcripción del paramixovirus también implica un proceso conocido como Edición
de ARN. El gen P codifica dos proteínas, P y V, que comparten una secuencia de
aminoácidos N-terminal común pero que difieren completamente en las secuencias
C-terminales como resultado de un cambio en el marco de lectura provocado por la
inserción de dos G no codificados residuos en la transcripción de ARN por
tartamudeo de transcriptasa.
Las células eucariotas no están equipadas para traducir ARNm policistrónico
en varias especies individuales de proteínas, ya que las células de mamíferos
normalmente no pueden reiniciar la traducción a la mitad de una molécula de ARN.
Los virus de ADN superan esta limitación mediante el uso de mecanismos celulares
para la escisión (y, a veces, el empalme) de transcripciones de ARN policistrónico
virales para producir moléculas de ARNm monocistrónicas.
Los virus de ARN, la mayoría de los cuales se replican en el citoplasma, no
tienen acceso a las enzimas de procesamiento y empalme de ARN del núcleo
de la célula huésped, pero han desarrollado una notable diversidad de
soluciones a la dificultad de puntuar un genoma grande para producir múltiples
productos genéticos individuales. . Algunos (p. Ej., Ortomixovirus) han
desarrollado un genoma de ARN segmentado en el que cada gen es,
Replicación de virus Capitulo | 4 4 49
en general, expresado y duplicado como una molécula separada. Otros (p. Ej.,
Paramixovirus) han desarrollado un genoma policistrónico pero producen
transcripciones de ARN monocistrónico por terminación y reinicio de la
transcripción. Sin embargo, otros virus de ARN (p. Ej., Coronavirus) utilizan un
conjunto anidado de transcripciones de ARN superpuestas, cada una de las cuales
se traduce en un solo producto génico. Finalmente, algunos (p. Ej., Picornavirus)
tienen un ARN genómico policistrónico, que se traduce en una poliproteína que
luego se escinde proteolíticamente para producir los productos finales.
Con ciertos virus, el ARNm policistrónico se puede traducir directamente para
producir varios productos génicos como resultado del inicio o reinicio de la
traducción en los codones de inicio AUG internos. El inicio interno de la traducción
se ve facilitado por un motivo de ARN aguas arriba conocido como un sitio de
entrada ribosomal interno (IRES), descubierto por primera vez en 1988 en los ARN
del virus del poliovirus y la encefalomiocarditis (otro picornavirus). Cuando se inicia
la traducción en un AUG interno, también puede ocurrir un desplazamiento de
marco. Otro mecanismo, conocido como
desplazamiento del marco ribosómico, ocurre fortuitamente cuando un ribosoma se
desliza un nucleótido de un lado a otro a lo largo de una plantilla de ARN. Este
fenómeno es explotado por los retrovirus, donde la lectura de cambio de marco
conduce a que aproximadamente el 5% de las moléculas de proteína Gag se
extiendan como una poliproteína Gag-Pol. Por lo tanto, junto con el fenómeno de
empalme de ARN y edición de ARN descrito anteriormente, se puede ver que existen
varios mecanismos para explotar marcos de lectura superpuestos para maximizar el
potencial de codificación limitado de virus con genomas comparativamente pequeños.
Genes reguladores y procesamiento postranscripcional
virales, particularmente en las numerosas secuencias o motivos conservados
(consenso) que representan elementos receptivos Muchos de estos últimos
tienen un papel fundamental que desempeñar en la regulación de la
transcripción. Por ejemplo, cada unidad de transcripción de un genoma viral
tiene cerca de sus 3 ʹ- finalizar un sitio de inicio de transcripción de ARNm ( inicio
del sitio), designado como nucleótido +1. Dentro de los aproximadamente cien
nucleótidos aguas arriba del sitio de inicio se encuentra el promotor, que regula al
alza la transcripción de un gen particular o una serie de genes. Aguas arriba o
aguas abajo del sitio de inicio puede haber una secuencia larga con varios
elementos, en algunos casos repetidos, conocidos como potenciadores that
amplify transcription even further. These regulatory regions are activated by the
binding of either viral or cellular DNA-reactive proteins. Several such proteins
may bind to adjacent responsive elements to form an interactive structure, or
otherwise interact to facilitate attachment of the viral RNA polymerase. Viral
regulatory genes encoding such regulatory proteins may act in trans as well as in cis,
that is, these proteins may trans- activate genes residing on a physically separate
molecule of nucleic acid.
50 PART | I Principles of Virology
A description of the role of the regulatory genes of human immunodeficiency
virus 1 (HIV-1) serves to illustrate the sophistication of such regulatory
mechanisms. A DNA copy of the viral genome is integrated into a chromosome of
a resting T cell, and remains latent until a T cell mitogen or a cytokine induces
synthesis of the cellular NF- κ Familia B de proteínas de unión al ADN. NF- κ B
luego se une al potenciador presente en el provirus integrado, desencadenando
así la transcripción de los genes reguladores del VIH-1. Uno de estos, hacer
encaje, encontrado en todos los lentivirus, los códigos para una proteína
específica para un elemento sensible, TAR, dentro del provirus, aumentan
considerablemente ( trans- activando) la transcripción de todos los genes virales
(incluidos hacer encaje sí mismo). De este modo, se establece un circuito de
retroalimentación positiva que estimula la producción de transcripciones de ARN
del VIH. Además, al interactuar con TAR presente en todos los ARNm virales, así
como en el ADN proviral,
hacer encaje also enhances translation. The HIV-1 regulatory protein Rev
plays a different role to modulate gene expression by regulating the
nuclear export of viral mRNAs. Although the control of lentivirus
transcription may be unusually complex compared to many RNA viruses,
these viruses contain only 9 genes, compared with up to 200 in the case
of some DNA viruses.
Post-transcriptional Processing
Primary RNA transcripts from eukaryotic DNA are subject to a series of
post-transcriptional alterations in the nucleus prior to export to the
transported to the various sites in the cell where they are needed, for
cytoplasm as mRNA. First, a cap, consisting of 7-methylguanosine (m 7 Gppp),
is added to the 5 ʹ- terminus of the primary transcript; this cap structure
facilitates the formation of a stable complex with the host 40S ribosomal
subunit, necessary for the initiation of translation. Second, a sequence of
50 to 200 adenylate residues is added to the 3 ʹ- terminus. This poly(A) tail
acts as a recognition signal for processing and the transport of mRNA
from the nucleus to the cytoplasm, and assists in the stabilization of
mRNA against cytoplasmic degradation by ubiquitin. Third, a methyl group
is added at the sixth position to about 1% of the adenylate residues
throughout the RNA (methylation). Fourth, introns are removed from the
primary transcript and the exons are linked together in a process known
as splicing,
an important mechanism for regulating gene expression in nuclear DNA
viruses. A given RNA transcript can have two or more splicing sites and,
moreover, be spliced in several alternative ways to produce a variety of
mRNA species coding for distinct proteins; both the preferred poly(A) site
and the splicing pattern may change in a regulated fashion as infection
proceeds. For example, the HIV-1 protein Rev assists the nuclear export
of unspliced or singly spliced (intron-containing) viral mRNA; thus, early
in the replication cycle, the mRNA present in the cytoplasm is largely
doubly spliced, while later in the cycle after Rev accumulates, a temporal
switch in mRNA species occurs.
Special mention should be made of an extraordinary phenomenon
known as cap-snatching. The transcriptase of influenza virus, which also
carries endonuclease activity, steals the 5 ʹ- methylated caps from newly
synthesized cellular RNA transcripts in the nucleus and uses these host
cell RNA sequences as primers for initiating transcription from the viral
genome.
The rate of degradation of mRNA provides another possible level of
regulation. Not only do different mRNA species have different half-lives
but the half-life of a given mRNA species may change as the replication
cycle progresses.
Capped, polyadenylated, and processed monocistronic viral mRNAs
bind to ribosomes and are translated into protein in the same fashion as
cellular mRNAs. The sequence of events has been closely studied in
reovirusinfected cells. Each monocistronic mRNA molecule binds via its
capped 5 ʹ- terminus to the 40S ribosomal subunit and this then moves
along the mRNA molecule until reaching the initiation codon. The 60S
ribosomal subunit also binds, together with methionyl-transfer RNA and
various initiation factors, after which translation proceeds.
Post-translational Modifications
Most viral proteins undergo various sorts of post-translational
modification such as phosphorylation (for nucleic acid binding), fatty acid
acylation (for membrane insertion), glycosylation, myristylation, or
proteolytic cleavage. Newly synthesized viral proteins must also be
example, into the nucleus in the case of viruses where the nucleus is the
major site of replication. The sorting signals that direct intracellular
trafficking are only now beginning to be understood, as are the
polypeptide chain-binding proteins ( molecular chaperones) that regulate
folding, translocation, and assembly of oligomers of viral as well as
cellular proteins.
Post-translational Cleavage
The polycistronic viral RNA is translated directly into a single
polyprotein in the case of the positive-sense picornaviruses and
flaviviruses. This large molecule carries protease activity that cleaves
the polyprotein at defined recognition sites into smaller proteins. The
first cleavage steps are carried out while the polyprotein is still
associated with the ribosome. Some of the larger intermediates exist
only fleetingly; others are functional for a short period but are
subsequently cleaved by additional virus-coded proteases to smaller
proteins with alternative functions. Post-translational cleavage occurs
in several other RNA virus families, for example, togaviruses and
caliciviruses, in which polyproteins corresponding to large parts of the
genome are cleaved. Some viruses encode several different proteases.
Most are either trypsin-like (serine or cysteine
 Virus Replication Chapter | 4 51

proteases), pepsin-like (aspartyl proteases), or papain-like (thiol
proteases).
Cellular proteases, present in organelles such as the Golgi complex
or transport vesicles, are also vital to the maturation and assembly of
many viruses. For example, cleavage of the hemagglutinin glycoprotein of
orthomyxoviruses or the fusion glycoprotein of paramyxoviruses is
essential for virion infectivity.
usually N-linked (to asparagine) or less commonly O-linked (to serine or
threonine). A coated vesicle then transports the completed glycoprotein
to the cellular membrane from which the particular virus buds.
The precise composition of the oligosaccharides is determined, not
only by the amino acid sequence and tertiary structure of the proteins
concerned, but more importantly by the particular cellular glycosyl
transferases active in the type of cell in which the virus happens to be
growing.

Glycosylation
Viruses frequently exploit those cellular pathways normally used for the
synthesis of host cell secretory glycoproteins. The amino terminus of viral
envelope proteins contains a sequence of 15 to 30 hydrophobic amino
acids, known as a signal sequence, which facilitates binding of the
growing polypeptide chain to a receptor site on the cytoplasmic side of
the rough endoplasmic reticulum and its passage through the lipid bilayer
to the lumenal side. Oligosaccharides are then added in N-linkage to
certain asparagine residues of the nascent polypeptide by en bloc transfer the virion may also involve proteolytic cleavage of one or more species of
of a mannoserich core of preformed oligosaccharides, and glucose
residues are removed by glycosidases (called trimming).
The viral glycoprotein is then transported from the rough endoplasmic
reticulum to the Golgi complex. Here the core carbohydrate is further
modified by the removal of several mannose residues and the addition
of further N-acetylglucosamine, galactose, and the terminal sugars,
sialic acid, or fucose. The completed side-chains are a mixture of
simple oligosaccharides (also called high mannose oligosaccharides)
and complex oligosaccharides which are
Assembly and Release
All non-enveloped viruses of vertebrates have an icosahedral structure.
The structural proteins of simple icosahedral viruses associate
spontaneously to form structural units (called capsomers when
considered morphologically), which then self-assemble to form capsids
into which viral nucleic acid is inserted, often accompanied by
conformational changes to the nascent capsid structure. Completion of
capsid protein.
The mechanism of packaging viral nucleic acid into a
pre-assembled empty procapsid has been well elucidated for
adenoviruses. A particular protein binds to a nucleotide sequence at
one end of the viral DNA known as the
packaging sequence; this enables the DNA to enter the procapsid bound to
basic core proteins, after which some of the capsid proteins are cleaved to
produce the mature virion.
Most non-enveloped viruses accumulate within the cytoplasm or
the nucleus and are released only when the cell eventually lyses ( Fig.
4.7 ).

FIGURE 4.7 Maturation of enveloped viruses. (A) Viruses with a matrix protein (and some viruses without a matrix protein) bud through a patch of the plasma membrane in which glycoprotein
peplomers have accumulated over matrix protein molecules. (B) Most enveloped viruses that do not have a matrix protein bud into cytoplasmic vesicles (rough endoplasmic reticulum [RER] or
Golgi), then pass through the cytoplasm in smooth-walled vesicles and are released by exocytosis. Reproduced from MacLachlan, N.J., Dubovi, E.J., 2011. Veterinary Virology, fourth ed. Academic
Press, London (Fig. 2.12), with permission.
52 PART | I Principles of Virology

FIGURE 4.8 Four distinct strategies used by different viruses for budding. In type I budding, as with the alphaviruses, both the envelope glycoproteins and the internal capsid are essential. If
altered or chimeric envelope proteins reach the plasma membrane, these do not support budding, indicating that the quaternary structures of the envelope heterodimers and capsid are involved
in driving the process. Type II budding, for example Gag-dependent budding of many retroviruses, requires only the internal capsid or matrix proteins. Type III budding can be driven solely by the
envelope proteins. Finally type IV budding is driven by viral matrix proteins but requires additional components; for example, internal matrix proteins alone can drive the budding of rhabdoviruses
or orthomyxoviruses. but the process is inefficient or results in deformed particles unless envelope glycoproteins or the internal ribonucleoprotein are also present. Reproduced from Flint, S.J.,
et al., 2009. Principles of Virology, third ed. ASM Press, Washington, DC (Fig. 13.15), with permission.

All mammalian viruses with helical nucleocapsids, as well as some

with icosahedral nucleocapsids (e.g., herpesviruses, togaviruses, and
retroviruses) mature by acquiring an envelope by budding through cellular
membranes.
Enveloped viruses may bud from the plasma membrane, from
internal cytoplasmic membranes, or from the nuclear membrane;
viruses that acquire an envelope within the cell are then transported
within vesicles to the cell surface. Budding usually occurs through
patches of membrane that contain viral glycoprotein(s) inserted into the
lipid bilayer of the membrane. This occurs by lateral displacement of
cellular proteins from that patch of membrane ( Fig.

4.8 ). The cleaved single molecules of viral glycoprotein associate into

oligomers to form typical rod-shaped or clubshaped peplomers with a
hydrophilic domain projecting from the external surface of the
membrane, a hydrophobic trans-membrane anchor domain, and a short
hydrophilic cytoplasmic domain projecting slightly into the cytoplasm. In
the case of icosahedral viruses, for example togaviruses, each protein
molecule of the nucleocapsid binds directly to the cytoplasmic domain of
the membrane glycoprotein oligomer,

thus molding the envelope around the nucleocapsid. In

the more usual case of viruses with helical nucleocapsids, a matrix
protein attaches to the cytoplasmic domain of the glycoprotein
peplomer, and the nucleocapsid protein recognizes the matrix protein to
initiate budding. Release of each enveloped virion does not breach the
FIGURE 4.9 Polarity of virus release from infected cells. Viruses that bud from apical
integrity of the plasma membrane, hence many thousands of virus
surfaces can be shed in respiratory or genital secretions or intestinal contents. Viruses
particles can be shed over a period of several hours or days without budding from basal surfaces are available for systemic spread via viremia or lymphatics.
significant cell damage. Many but not all viruses that bud from the Some viruses, for example, flaviviruses, bunyaviruses, and coronaviruses, take a more
plasma membrane are only slowly cytopathic: and non-cytopathic may circuitous route in exiting the cell. Viruses that do not bud are usually released by cell lysis. Reproduced
from MacLachlan, N.J., Dubovi, E.J., 2011. Veterinary Virology, fourth ed. Academic Press,
be associated with persistent infections.
London (Figure 2.11), with permission.

Epithelial cells display polarity, that is they have an

apical surface facing the outside world and a basolateral shed to the exterior (e.g., influenza viruses) tend to bud from the apical
surface facing the interior of the body, the two separated by lateral plasma membrane, whereas others (e.g., lentiviruses, such as human
cell–cell tight junctions. These surfaces are chemically and immunodeficiency virus) bud through the basolateral membrane ( Fig.
physiologically distinct. Viruses that are 4.9 ).

Flaviviruses, coronaviruses, arteriviruses, and
bunyaviruses mature by budding through either membranes of the
Golgi complex or the rough endoplasmic reticulum; vesicles containing
the virus then migrate to fuse at the plasma membrane thereby
releasing the virions by exocytosis ( Fig. 4.8 ). Uniquely, the envelope of consecutive series of concatemers of first, antisense RNA and then,
the herpesviruses is acquired by budding through the inner lamella of
the nuclear membrane; the enveloped virions then pass directly from
the space between the two lamellae of the nuclear membrane to the
exterior of the cell via the cisternae of the endoplasmic reticulum.
SATELLITE VIRUSES AND VIROIDS
Satellite viruses are subviral particles that contain a DNA or RNA
genome coding for a capsid protein, but that are absolutely dependent
upon the presence of another virus for replication. The vast majority are
found among plants but a few have an impact on medical virology and
public health. Replication of the dependoviruses (family Parvoviridae,
genus Dependovirus —adeno-associated viruses, now used as vectors
for delivering heterologous genes of interest,
e.g., vectored vaccines) for example, is dependent upon co-infection with
an adenovirus—the adeno-associated virus produces coat protein but not
the enzymes necessary for genome replication. Satellite viruses share
little or no nucleotide sequence homology with the helper virus, yet can
sometimes interfere with the replication of the helper virus.
Viroids are small, rod-like single-stranded RNA molecules with a high
degree of secondary structure, approximately 250 to 450 bases in size,
all sharing a common structural feature of a conserved central genomic
region essential for replication. The RNA forms a hammerhead structure
with the enzymatic properties of a ribozyme, an autocatalytic,
self-cleaving molecule. This ribozyme function is used to cleave
multimeric RNA structures produced during the course of replication
(Chapter  22: Hepadnaviruses and Hepatitis Delta). Most are plant
pathogens, remarkable in not coding for any protein. First described by
Theodore Diener, it has been suggested that viroids may represent
crucial intermediate steps in the evolution of RNA-based life forms from
inorganic precursors.
Hepatitis Delta Virus
Hepatitis delta virus (HDV) is a unique example of a defective virus that
requires co-infection with hepatitis B virus to provide its outer
HBsAg-containing envelope. The HDV genome is a branched or
rod-like, single-stranded RNA molecule similar to plant viroids in
conformation, but unlike other viroids it codes for a single protein, the
delta antigen. This nuclear phosphoprotein exists in two forms
generated by RNA editing: the shorter form (195 amino acids) is
required for HDV genome replication whereas the
Virus Replication Chapter | 4 53
larger form (214 amino acids) is necessary for assembly and release from
infected liver cells.
The HDV genome is thought to be replicated by the host cell RNA
polymerase II enzyme via a rolling circle mechanism to produce a
RNA of genome sense. These are immediately cleaved by the ribozyme
domain in the RNA genome to generate new viral genomes: this is the
only known example of a mammalian virus utilizing a ribozyme for
genome replication (see Fig. 22.9).
GENERATION OF GENETIC DIVERSITY
A sample of any given virus inevitably contains a population of closely
related genome sequences (“quasi-species”), replicating simultaneously
at different and varying rates according to selection pressures. The molecular
mechanisms
involved in generating diversity include nucleotide substitution,
insertion, or deletion; sequence duplication or deletion; genetic
recombination; and genetic reassortment for viruses with segmented
genomes. The error rate in nucleotide copying is approximately 1 in 10 5
nucleotides for DNA viruses, and 1 in 10 4 nucleotides for RNA viruses.
This quasi-species population is then constantly varying its
composition according to the most recent selection applied, providing
the raw material for antigenic drift and for adaptation of the virus
population to new hosts.
The selection properties that are desirable in vivo
include the ability to replicate to high levels, the ability to be transmitted
from host to host, evasion of the immune response, and resistance to
host antiviral mechanisms and/or antiviral therapy. Not all of these
properties are as necessary for successful replication in cell culture as
they are in vivo, and virus stocks prepared in vitro are likely to include a
different set of variants from those produced in vivo, say in experimental
animal tissues. Serial passaging of wild-type virus through cell culture or
a foreign host species has been a long used and successful way to
generate virus strains with lowered virulence for the original host, to be
used as “modified live-virus” vaccines.
Many different viral genes may be involved in such adaptations; for
example, mutations in viral polymerases may affect replicative ability or
resistance to antiviral drugs, changes in antigenic epitopes can lead to
immune escape, changes in receptor ligands that affect receptor
preference can alter many aspects of pathogenesis, and so on. Examples
are discussed in Chapter 15: Emerging Virus Diseases.
QUANTITATIVE VIRUS ASSAYS
Advances in our knowledge of virus replication, pathogenesis,
diagnosis, vaccine production, and many other areas would not have
been possible without the tools to quantitate how much virus there is
in a given sample or
54 PART | I Principles of Virology
preparation. With the greater use of antiviral drugs, most notably in
blood-borne diseases such as HIV, hepatitis B virus, and hepatitis C
virus, the stage of disease and effectiveness of treatment are now
routinely assessed by quantifying the level of virus ( viral load) in the
blood.
There are two approaches to measuring the titer of virus, either
biological or physical. Physical assays measure actual virus particles,
and include electron microscopy, hemagglutination, and serological
assays for the amount of viral antigens; biological assays measure
some viral function, for example, infectivity, reverse transcriptase
activity. Tests performed on the same sample with different techniques
will in some cases give significantly different results, and thus it is
important to understand the reason for these differences.
The difference between the amount of virus detected using a
physical assay such as particle counting by electron microscopy and a
biological assay, for example a plaque assay ( Fig. 4.10 ), is often
referred to as the particle to plaque-forming unit (pfu) ratio. In virtually all
instances, the number of particles exceeds the number determined in a
FIGURE 4.10 Plaque assay for virus quantitation. Cell monolayers are grown, typically in
Petri dishes, and when confluent the virus inoculum is allowed to adsorb to the monolayer
in a small volume. The monolayers are overlaid with agarose to restrict diffusion of virus
particles, and incubated to allow virus replication beginning with single cells and then
spreading as more cells become successively involved. The vital stain neutral red is then
added; this is taken up by viable cells, staining the monolayer red and leaving clear holes.
Plaque sizes and rates of development depend on the replication cycle and yield of the
individual virus (see text). To determine the virus titer of the starting inoculum, serial
10-fold dilutions are inoculated on to duplicate monolayers. For those monolayers where
discrete plaques can be distinguished (typically 10 to 50 plaques per dish), plaque
numbers are counted and the original virus titer calculated by multiplying this plaque
number by the dilution factor. By harvesting virus from a single plaque, a stock of
genetically homogeneous virus can be obtained (“plaque-purifying”). Spontaneous mutants
in a virus inoculum may be recognized by plaques of abnormal size or morphology, and
can thus be harvested and separated for further study.
biological assay, often with ratios greater than 1000:1. This is due to a
number of reasons; first, not all virions may be capable of replication due
to intrinsic defects, for example, because only a partial or defective
genome is present, or the particle is empty, faulty capsid assembly, or
because of lethal mutations in the genome; second, virions may have
undergone environmental inactivation; third, the choice of cells for virus
isolation and growth may not mimic the optimum intracellular
environment of the natural target organ; fourth, the interaction between a
fully viable virus particle and a permissive cell may not always
successfully initiate infection and an excess of particles may be
necessary to achieve a statistical chance of success.
Perhaps no other procedure has contributed as much to virology as the
development of the plaque assay. The test was originally developed a
century ago by Felix d’Herelle in his initial studies of bacteriophages and
was subsequently adapted to mammalian viruses in 1953 by Renato
Dulbecco and Marguerite Vogt. The assay is elegantly simple: serial 10-fold
dilutions of a virus sample are made in a cell culture medium. These diluted
samples are then added to preformed monolayer cells and incubated under
agar or a carboxymethyl cellulose layer to prevent the spread of secreted
virus. After 24 to 48 hours (or longer, according to the virus of interest),
plaques of necrotic cells become visible under the light microscope. At an
appropriate time, fixation and staining, for example, with crystal violet,
reveals clearly visible holes in the monolayer, each corresponding to a
focus of necrotic cells initiated by one viable virus particle. Serial dilution of
the virus preparation facilitates the counting of discrete plaques so that,
knowing the dilution, volume tested, and the plaque count, the
concentration (titer) in the original sample can be determined.
Immunohistochemical staining procedures using specific antisera can be
used as an alternative for visualizing plaques formed by non-cytopathic
viruses.
With the development of real-time PCR assays, the concentration of
viral nucleic acid in a test sample can now be measured in virtually any
context. By comparison with copy number controls, the concentration of
nucleic acid in the treated sample can be determined. This type of assay
does not detect empty capsids (those that do not contain viral nucleic
acid), and, importantly, it does not necessarily relate to the infectivity of
the sample.
Chapter  10: Laboratory Diagnosis of Virus Diseases, describes a
further range of assays that are used in a diagnostic context, most of
which can be also used both quantitatively and for research
applications.
DEFECTIVE INTERFERING VIRUSES
This chapter has hitherto described how, during virus replication,
non-infectious particles that lack the full genetic information essential
for infectivity, are commonly produced—analogous to the assembly
of defective motor

vehicles from a car assembly plant. One special example involves
defective interfering (DI) particles; these (1) lack the complete genome
of the wild-type virus (deletion mutants), but (2) can still replicate in a
new cell if the cell is also co-infected by wild-type virus which provides
the missing function (by a process known as complementation).
Such defective particles may then also (3) interfere with the ongoing
replication of the wild-type helper virus, possibly due to possessing a
competitive replication advantage over wild-type virus.
The production of DI particles is encouraged by infection at high
multiplicity, where the chances of co-infection with full-length and
defective viruses occurring in the same cell are increased. In fact, this
phenomenon was first observed by Preben and Herdis von Magnus in
1944 with influenza virus; they found that very high multiplicities led to
poor virus replication and the production of “interfering” virus stocks. A
cyclical pattern may be observed, where DI particles increase in
number as long as the culture has sufficient wild-type helper virus
replication; however, as DI particles then inhibit the numbers of
wild-type virus, the whole virus population diminishes, fresh rounds of
wildtype virus replication can then occur and so a milieu for a
Virus Replication Chapter | 4 55
return to DI replication is built up again. Despite several suggestions, it is
not clear to what extent DI particles play a role in the pathogenesis of an
ongoing infection in a host, for example, in modulating recovery from an
acute infection or promoting chronic infection.
FURTHER READING
Bose, S., Jardetsky, T.S., Lamb, R.A., 2015. Timing is everything: fine-
tuned molecular machines orchestrate paramyxovirus entry. Virology 479–480,
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