Espectroscopía de infrarrojo medio para la discriminación y clasificación

de Aspergillus spp. contaminación en el maní.
 
 
Resumen
 
En este estudio, Aspergillus spp., Colonos comunes en el maní, se caracterizaron,
clasificaron y cuantificaron usando FTIR junto con el accesorio ATR. Los datos
espectrales FTIR-ATR de muestras de maní infectadas se preprocesaron (centrado en la
media, suavizando la primera derivada) y se utilizaron para el análisis de regresión PLS
para obtener resultados cuantitativos. Se obtuvieron valores muy altos de R2
(96.20e99.98%) junto con un bajo error de los valores RMSEC (0.014 e0.153 Log CFU / g
de maní) . Incluso, el espectro de la matriz de maní fue dominante en las primeras etapas
de la invasión (2.5 Log CFU / g maní), lo que resultó en la separación de secciones
( Nigri de Flavi ) y en una población más alta (> 4 Log CFU / g, separación a nivel de
especie ( Aspergillus alliaceus) , Se
observó Aspergillus caelatus , Aspergillus flavus , Aspergillus parasiticus y Aspergillus tam
ari). La precisión de la clasificación correcta aumentó proporcionalmente con el nivel de
invasión fúngica y se alcanzó una clasificación 100% correcta cuando el nivel celular fue
Log CFU / g = 4.5e5. Las muestras con metabolitos secundarios similares (productores de
toxinas) se agruparon de cerca en diagramas de puntuación de PC para todos los niveles
de crecimiento fúngico. Los resultados destacan la posible implementación del modelo
FTIR-ATR para detectar cacahuetes infectados incluso en las primeras etapas de la
invasión; Además, para demostrar la capacidad de separación potencial en términos de
especies y sus metabolitos secundarios.
 
1. Introducción
 
 
El género Aspergillus es ubicuo en la naturaleza y se distribuye en todo el mundo. Se
encuentra entre los géneros de hongos más estudiados debido a su impacto económico,
ya que es un bioproductor industrialmente importante de ciertas enzimas y un agente
causante en el deterioro de los alimentos (Bennett, 2010). El género contiene alrededor
de 250 especies y dentro del género Aspergillus hay ocho subgéneros; y una o más
secciones asignadas a cada subgénero ( Raper y Fennell, 1965; Samson y Varga ,
2010). Actualmente, hay 18 secciones nombradas, en total (Samson y Varga ,
2010). Entre ellos, la sección Flavi , que toma su nombre del miembro
infame, Aspergillus flavus , y el aspergilli negro , Aspergillus niger, se han visto con
frecuencia en los cacahuetes como colonos dominantes. A. Níger siempre ha sido
importante para las aplicaciones de biotecnología; Por ejemplo, se ha utilizado para la
síntesis de productos industrialmente valiosos como el ácido cítrico o
el ácido glucónico (Bennett, 2010). Sin embargo, A. niger también es conocido por su
potencial para producir ocratoxina ( Abarca , Bragulat , Castella y Cabanes , 1994), que se
considera un potente carcinógeno en ratas (Mantle, Kulinskaya y Nestler ,
2005). A. flavus junto con Aspergillus parasiticus son los patógenos oportunistas de
cultivos más comúnmente vistos y ocurren regularmente en suministros de alimentos con
todo incluido, pero especialmente en semillas ricas en aceite ( Diener et al., 1987) como el
maní. El maní es uno de los cultivos más vulnerables a Aspergillus spp. contaminación
( Kaaya , Harris y Eigel , 2006). Las vainas de maní están en contacto directo con el
suelo, que es la fuente de inóculo primario para Aspergillus spp., Por lo tanto, la invasión
de semillas por estas especies antes de la cosecha es común (Horn,
2005). Otras especies de Flavi en la sección de maní que se han reportado
son Aspergillus caelatus (Horn, 1997) y A tamari (Horn et al., 1996), que no
son productores de aflatoxinas ; pero Aspergillus tamari
produce ácido ciclopiazónico . Aspergillus alliaceus , que recientemente se ha colocado
en la sección Flavi (Peterson, 2008) también se ha informado como productor
de ocratoxina A ( Bayman , Baker, Doster , Michailides y Mahoney, 2002) y puede
colonizar semillas de maní dependiendo del medio ambiente. condiciones del campo
(Horn, 2005). Teniendo en cuenta la importancia de las micotoxinas en los alimentos y
piensos, existe la necesidad de una detección rápida de metabolitos tóxicos y sus hongos
de origen; y muchas técnicas bioquímicas y moleculares están disponibles hoy (Gilbert
y Anklam , 2002). La tecnología de espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier
(FTIR) ha ganado popularidad en el área.
 
de identificación y clasificación de microorganismos en comparación con los métodos
laboriosos y lentos existentes; y aplicaciones exitosas se construyeron incluso en el nivel
de subespecie en años. Muchos autores han informado el uso de datos espectrales de
infrarrojo medio y quimiometría como una poderosa herramienta de discriminación para
microorganismos y han sido revisados en otros lugares
( Mariey , Signolle , Amiel y Travert , 2001). FTIR en combinación con accesorios de
reflectancia como reflectancia total atenuada (ATR) (Kos, Lohninger y Krska , 2003)
o espectroscopía fotoacústica (PAS) (Gordon, Jones, McClelland, Wicklow y Greene,
1999) se han propuesto para Fusarium graminearum y Detección de A. flavus en maíz,
respectivamente. Recientemente, un grupo de investigación en Alemania ha demostrado
el uso exitoso de FTIR para identificar hongos en el aire y rápidamente caracterizó
la mancha de “ microfungi ” (Fischer, Braun, Thissen y Dott , 2006). Fischer y sus colegas
también han demostrado diferentes protocolos de preparación de muestras para obtener
procedimientos reproducibles y datos espectrales repetitivos de las células vivas de
micelios (Fischer et al., 2006). En todos estos estudios de clasificación taxonómica,
la calidad de identificación de células bacterianas ( Naumann , 2000) de los modelos de
regresión o clasificación multivariados desarrollados depende de la compatibilidad de los
datos, que se proporcionó al estandarizar los procedimientos de preparación de muestras
( Beekes , Lasch y Naumann , 2007) . En este estudio, el objetivo fue interpretar las
características espectrales de Aspergillus spp. creciendo en maní. Se propuso que
diferentes especies de Aspergillus tienen un perfil de crecimiento diferente y un
metabolismo diferente que puede ser detectado por FTIR-ATR en combinación con
modelos de análisis multivariados. Al hacerlo, se minimizó el paso de preparación de la
muestra (no es necesario aislar los hongos), se usó la matriz de maní como medio a
granel y se diseñó la clasificación de especies.
 
2. Metodología
 
2.1. Aspergillus spp. preparación de la solución de esporas
 
Ocho cepas diferentes, a saber: A. alliaceus NRRL 4181, A. caelatus NRRL 25528,
A. flavus NRRL 1957 ( mutante que no produce aflatoxinas ), A. flavus NRRL 3357
( productor de aflatoxinas ), A. parasiticus NRRL 21369 ( UV
que no produce aflatoxinas mutante de color), A. parasiticus NRRL 5862 ( productor
de aflatoxinas ), A. tamari NRRL 20818 y A. niger NRRL 326 fueron amablemente
proporcionados por el Dr. Bruce Horn (USDA National Peanut Research Lab., Georgia,
EE. UU.). Los conidios de cada cepa de cultivos de reserva se inocularon adicionalmente
en agar de dextrosa de patata y se incubaron a temperatura ambiente durante 7 días para
permitir que tenga lugar una esporulación significativa . Después de la incubación, se
añadieron asépticamente 5 ml de agua destilada estéril a cada placa. Se usó un asa de
inoculación de plástico estéril para aflojar las colonias de las placas de PDA. La
suspensión creada se filtró luego a través de una tela de queso estéril en un tubo Falcon
estéril de 50 ml de capacidad.
 
2.2. Infectar semillas de maní con Aspergillus spp.
 
Se obtuvieron cacahuetes de Virginia lisos, blanqueados de minoristas locales y se
almacenaron a 4 ° C en bolsas de plástico con cierre hasta el análisis. Las vainas de maní
se esterilizaron en superficie antes del tratamiento de inoculación
usando NaOCl al 1,0% durante 3 minutos y se enjuagaron completamente con agua
destilada. Después de eliminar el exceso de agua con una toalla de papel preesterilizada,
cada cápsula se colocó en una cámara húmeda petri -húmeda (5 cápsulas por cámara, 2
cámaras para cada especie), que consiste en papel de filtro húmedo para garantizar una
alta humedad (hasta 80e100%) . Se dispersaron suspensiones de esporas de 10 ml (105
e106 UFC / ml) sobre semillas de maní esterilizadas en superficie y se incubaron en la
cámara a temperatura ambiente (23 ± 1 C) durante 3 y 5 días para obtener maní
contaminado a diferentes niveles de concentraciones de moho. El crecimiento del moho
fue visible después de 2 días. Las semillas cubiertas con masas de hongos se mezclaron
con maní previamente esterilizado para obtener muestras con concentraciones celulares
variables de Aspergillus spp. de interés que funcionará como conjunto de calibración. La
pasta se hizo para una distribución homogénea del molde moliendo maní crudo con un
procesador de alimentos (Butterfly Emerald Mixer, Gandhimathi Appliances Ltd., Tamil
Nadu, India ) equipado con una cuchilla de corte de metal y un recipiente de acero
inoxidable. La carga fúngica inicial se determinó en términos de recuento de placas de
colonias y los resultados se expresaron como promedios Log UFC / g de maní de tres
mediciones. Las muestras se mantuvieron en contenedores sellados y se almacenaron a
4 ° C hasta el análisis.
 
2.3. FTIR-ATR
 
mediciones espectrales Los espectros infrarrojos de muestras de pasta de maní
contaminada se recogieron usando un espectrómetro FTIR ( Nicholet 6700, Thermo
Fisher Scientific Inc., Madison, WI, EE. UU.) junto con el detector DTGS KBr . El
compartimento de muestras estaba equipado con un accesorio de reflectancia total
atenuada (ATR) de diamante Smart iTR (Thermo Fisher Scientific Inc., Madison, WI, EE.
UU.) Que consistía en diamante laminado como material de cristal, montado en una placa
de acero inoxidable. El cristal de diamante tiene un índice reflectante de 2,4 a 1000 cm -
1 y un ángulo de incidencia de 45. Los espectros se obtuvieron y procesaron con
el software Omnic Spectra (Thermo Scientific). Los espectros se escanearon en un rango
de 4000 e 625 cm-1 con una resolución de 4 cm-1 y una ganancia de 2.0. Se usó un
promedio de 64 exploraciones como espectro final. La transformación de Fourier se
realizó con corrección de fase Mertz, función de apodización fuerte NeB , con un factor de
llenado cero de 2. El cristal se limpió entre mediciones sucesivas con metanol al 70% y se
secó verdaderamente. El cristal limpio se verificó para evitar residuos de mediciones
anteriores observando el espectro de fondo. Se recogieron tres lecturas espectrales
repetitivas por muestra y para incluir el efecto de bloqueo, pocas de las muestras
seleccionadas al azar se volvieron a analizar analizando algunas de las muestras al día
siguiente. Todos los espectros recopilados se utilizaron para el análisis, no los
promedios. Las muestras preparadas recientemente (solo almacenadas durante el curso
del análisis FTIR) se extendieron sobre cristal de diamante hasta que se proporcionó el
contacto completo. La perilla de presión no se usó para evitar expresar el contenido de
aceite de la pasta a presión. Las muestras refrigeradas se dejaron a temperatura
ambiente (23 +/- 1 C) durante 2 h para permitir que las muestras alcancen la temperatura
ambiente antes del análisis.
 
2.4. Análisis de datos multivariados.
 
2.4.1 Regresión PLS
 
El modelado de mínimos cuadrados parciales (PLS) es una poderosa herramienta de
análisis multivariante para el análisis espectral de muestras que tienen una estructura
compleja, como es el caso del maní y el molde en sí. En este estudio, los cacahuetes se
infectaron con diferentes cepas del género Aspergillus y se mantuvieron en condiciones
de alta humedad a temperatura ambiente para acelerar el crecimiento de hongos; y las
respuestas espectrales se analizaron con la técnica de regresión PLS
( calibración TurboQuant IR y software de predicción, Thermo Fisher). Las muestras de
pasta de maní contaminada tenían valores de concentración celular que variaban entre
2,5 y 6,0 log UFC / g de maní. Lecturas recolectadas para cada A. spp. fueron 40e50 para
el conjunto de calibración y 20e24 para el conjunto de predicción. Las diferencias en el
número de lecturas se debieron a que algunas muestras tienen más lecturas para incluir
el efecto de bloqueo. Las lecturas espectrales se preprocesaron antes de cargarse en la
regresión de PLS para reducir la variabilidad asociada con fuentes no relacionadas que
afectan la intensidad de todos los picos. Los datos se centraron en la media para eliminar
la dependencia de la magnitud y se filtraron para suavizar los picos que se parecen al
ruido aleatorio. La primera derivada de los datos se filtró mediante el filtro de suavizado
de Savitzky-Golay (puntos de datos = 7 y orden polinómico = 3).  
El rendimiento de los modelos de regresión PLS desarrollados para
cada Aspergillus spp. se ensayaron mediante la aplicación de “dejar uno fuera” validación
cruzada método en el que cada patrón de calibración se cuantificó como patrón de
validación. El desempeño de los modelos de PLS desarrollados se evaluaron a través de
coeficiente de correlación de determinación (R2), raíz de meansquared error de
calibración (RMSEC), raíz de error meansquared de validación cruzada (RMSEV) y
raíz meansquared error de predicción (RMSEP).
 
2.4.2 Análisis discriminante
 
Para determinar el valor umbral de concentración celular que da como resultado una
discriminación total de todas las especies de Aspergillus spp. utilizado en este estudio, las
muestras se separaron en cuatro lotes de acuerdo con el nivel de crecimiento de hongos
como muestras que tienen una concentración celular de 2.5 UFC / g de maní y menor, 3.0
a 4.0 UFC / g de maní, 4.5 a 5 UFC / g de maní, y 5.5 Log UFC / g de maní y
superior. Los datos espectrales preprocesados (centrados en la media, filtrados alisando
la primera derivada) de cada lote se evaluaron con respecto a la calidad de la clasificación
utilizando la técnica de análisis discriminante ( calibración TurboQuant IR y software de
predicción, Thermo Fisher) calculando la distancia desde cada centro de clase
en unidades de distancia Mahalanobis . Durante la calibración, el software calcula un
espectro medio y luego genera un modelo de distribución estimando la varianza en cada
frecuencia en el rango de análisis. Los resultados se presentaron como gráficos de
puntaje del componente principal (PC).
 
 3. Resultados y discusión
 
Las semillas de maní se inocularon asépticamente con soluciones de esporas
de Aspergillus spp. y se mantuvo en un ambiente húmedo hasta que las masas de hongos
de interés cubrieron las semillas. La figura 1 muestra el promedio de 5 lecturas repetitivas
de micelio fúngico de Aspergillus spp. raspe las superficies de maní después de secar los
maníes infectados en el gabinete del desecador con drierita . Existen diferencias
espectrales menores dentro de las especies del género Aspergillus , pero todas ellas dan
predominantemente bandas de absorción intensiva entre 3600e3100 cm-1 y 1700e1500
cm-1 que se asignan al contenido de proteína ( bandas de amida A , amida I y amida II)
de los hongos. . Si interpretamos brevemente el perfil espectral, las bandas de absorción
observadas entre 3050e2750 cm-1 y 1500e1300 cm-1 generalmente están dirigidas por el
contenido de lípidos, pero también hay algunos modos de deformación de las vibraciones
de las estructuras de proteínas. La región entre 1200 y 900 cm-1 se conoce como
vibraciones de anillo de oligo y polisacáridos ( Naumann , 2000) y la región entre 900 y
600 cm-1 generalmente surge de vibraciones de anillo aromático (Fig.1). Desde principios
de la década de 1950, ha habido abundantes trabajos de clasificación taxonómica
publicados en la literatura que investigan diferentes ventanas espectrales para obtener
una dispersión óptima de las cepas de diferentes células bacterianas o fúngicas (para
revisión de los primeros estudios ver ( Mariey et al., 2001). El análisis se limita a los
microorganismos que pueden crecer en medios de cultivo y condiciones de cultivo
estables y estrictamente controladas ( Naumann , 2000). La estandarización del
aislamiento de cultivos puros de la matriz alimentaria es uno de los pasos más largos para
estudios de discriminación. Cuando el micelio fúngico de Aspergillus spp. se cargó en
la herramienta de análisis discriminante , en cierta medida, se observó la separación de
diferentes especies (Fig. 2). En este análisis, el rango espectral de espectro completo,
4000e650 cm- 1, fue utilizado. Mejorando el modelo y estandarizando la metodología de
aislamiento, se puede lograr una mejor discriminación de cada especie. Pero, en este
estudio, tuvo como objetivo describir la metodología que reduce las necesidades de
preparación de muestras y hacer la clasificación utilizando la matriz de maní tal como
está; también, para representar las alteraciones bioquímicas tanto en la estructura celular
como en el medio nutritivo (maní) a medida que ocurre el crecimiento de hongos. Por lo
tanto, los perfiles espectrales de las especies de Aspergillus (Fig. 1) y la variación y el
espectro de correlación obtenidos del análisis de regresión PLS (Fig. 3) se utilizaron para
la ventana espectral de selección e interpretación de picos. Los espectros de variación y
correlación de cada especie del género Aspergillus muestran regiones que están activas y
la asociación de estas regiones con respecto a la concentración celular, respectivamente
(Fig. 3).
 Gráfica 1. Espectros medios de cada Aspergillus spp. estudió. El micelio de hongos de
interés se eliminó de la superficie de maní, se secó y se cargó en una celda de diamante
de la unidad ATR para la recolección del espectro.

Grafica 2 .. Gráfico de puntaje del componente principal (PC) para clases de

diferentes Aspergillus spp. estudió. () A. niger NRRL 326; () A. flavus NRRL 3357; ()
A. flavus NRRL 1957; () A. parasiticus NRRL 5862; () A. parasiticus NRRL 21369; (◊)
A. alliaceus NRRL 4181; (þ) A. caelatus NRLL 25528; () A. tamari NRRL 20818.
 
3.1. Selección e interpretación de la región espectral.
 
Dada la compleja estructura de ambas Aspergillus spp. y matrices de maní, los espectros
pueden contener una superposición de cientos de modos infrarrojos. El estiramiento
con OeH del agua (3600e3200 cm- 1) y la región que representa las absorciones del
cristal de diamante (2340e1800 cm-1) se excluyeron de todas las calibraciones del
modelo. Los números de onda entre 3050 y 2750 cm-1 también se excluyeron del análisis
de datos y la porción activa del espectro que se encuentra entre 1800 y 650 cm-1 (región
de huellas digitales) se utilizó en el análisis. Esta región cubre las variaciones que no son
ambiguas para el crecimiento de hongos (Kos, Lohninger y Krska , 2002). Las
asignaciones detalladas de bandas de los picos seleccionados en la región especificada
se resumieron en la Tabla 1. Las regiones espectrales representativas del crecimiento
fúngico en el maní se ilustraron adicionalmente en la Fig. 4a, byc, y se indicaron
alteraciones del área con respecto al aumento de los valores de CFU / g de maní. con
flechas Los cacahuetes son estructuras complejas, cuyos componentes principales son
agua (muy poco), proteínas, grasas y carbohidratos. Las proteínas aparecen como grupos
amida I (1700e1600 cm- 1) y amida II (1565e1520 cm-1) (Stuart, 2004). Los picos
relacionados con las proteínas se asignaron a 1643 cm-1 y 1544 cm-1 en el estudio
actual. El primero representa el carbonilo y CeN estiramiento del grupo amida I y la
segunda se refiere a la combinación de la CeC y CeN estiramiento, y NeH y de
CeO vibraciones del grupo amida II (flexión Irudayaraj , Sivakesava , Kamath , y Yang,
2001 ) Generalmente se observa otra banda relacionada con proteínas alrededor de 3290
cm-1 como un pico amplio ( estiramiento de NeH del grupo amida), pero esta región no se
incluyó en el análisis de regresión. Como se indicó anteriormente, la infección por hongos
se puede determinar a partir del aumento de los picos de absorción de proteínas y la
disminución de las absorciones en las regiones de lípidos y carbohidratos debido a la
actividad metabólica del hongo ( Naumann , 2000). En todos los Aspergillus spp. perfiles,
se observó una fuerte disminución y un aumento constante después de que la
concentración celular alcanzara 5 Log UFC / g de maní cuando se investigaron los
componentes de la banda amida I y amida II. Se observó la misma tendencia para
la banda de amida A (3290 cm - 1 ) pero la profundidad de la concavidad fue menor. Se
ha informado que las enzimas proteolíticas de los hongos pueden hidrolizar las proteínas
del huésped y pueden convertir los componentes básicos en proteínas fúngicas durante
las etapas avanzadas de deterioro ( Bothast , 1978). También existe una interrelación
huésped-hongo, en la cual el nivel de proteína, actividad de proteasa o cantidad de
aminoácidos libres difiere significativamente entre las especies de Aspergillus cultivadas
en maní ( Achar , Sreenivasa y Galdo , 2011); y solo cuando está muy infectado, el
contenido de aminoácidos libres muestra una tendencia con respecto al nivel de
crecimiento de hongos ( Chiou , 1997). Del mismo modo, nuestros resultados sugieren
metabolismo fúngico
 

Gráfica 3. Regresión PLS espectros estadísticos resultantes: a: espectro de

varianza global; b: espectro de correlación múltiple; c: espectro medio de muestras
de maní infectadas con A. flavus NRRL 1957 yd: espectro medio de muestras de
maní limpias.

 
Fig. 4. Cambios espectrales a medida que A. flavus NRRL 1957 crece en el
maní. Las flechas muestran la dirección de aumento de la concentración
de A. flavus NRRL 1957 (Log CFU / g maní).
de las proteínas de maní se metabolizaron primero (cóncavo hacia abajo), y luego, las
proteínas fúngicas comenzaron a ser espectralmente observables después de una cierta
cantidad de crecimiento fúngico (cóncavo hacia arriba). Junto con los picos de proteínas,
los espectros de FTIR de muestras de pasta de maní limpias e infectadas también
mostraron un fuerte aumento y / o disminución lineal en los picos asociados a la grasa
que indican la hidrólisis de los lípidos. El maní está compuesto de glicéridos mixtos y
contiene varios ácidos grasos, lo que explica su alta proporción de estructura insaturada
(casi 80% de contenido de ácido oleico y linoleico (Caballero, Trugo y Finglas , 2003); se
sabe que esta estructura mejora la tasa de crecimiento de Aspergillus spp.
( Fanelli y Fabbri , 1980). Además de la tasa de crecimiento, el porcentaje de ácidos
grasos poliinsaturados en el maní afecta la cantidad de micotoxina producida (por
ejemplo, produce la producción de aflatoxinas inducida por lipoperoxidos en
A. parasiticus y A. flavus ( Fabbri , Fanelli , Panfili , Passi y Fasella , 1983). La
degradación enzimática de los lípidos en ácidos grasos libres y glicerol ha demostrado ser
anterior al metabolismo de los gránulos de almidón o el contenido de proteínas
(Smart, Wicklow y Caldwell, 1990), durante la invasión de Aspergillus ; alternativamente,
en algunos estudios se informó que la disminución de la concentración de azúcar fue
anterior o simultánea a la hidrólisis de triglicéridos a través del metabolismo
de Aspergillus (Mellon, Cotty y Dowd, 2000; M Ellon, Dowd y Cotty , 2002). Aún así, la
hidrólisis de triglicéridos por la acción de las lipasas ha sido una alerta importante para el
crecimiento de moho y, en consecuencia, se ha sugerido un aumento en el contenido de
ácidos grasos libres del grano como un indicador del deterioro del grano ( Bothast ,
1978). La altura máxima del enlace de éster de ácido graso (-C = O) centrado a 1743
cm - 1 disminuyó debido al consumo de lípidos y, simultáneamente, el estiramiento
del éster carbonilo ( eC ] O del ácido) del producto de descomposición de los ácidos
grasos libres (FFA) apareció un nd aumentó constantemente a 1710 cm- 1
(Ismail, Vandevoort , Emo y Sedman , 1993). Otra banda grasa asociada de CeO estira en
1160 cme-1 generalmente disminuyó a medida que aumentó el recuento de mohos. Estas
bandas se pueden usar para determinar el nivel de Aspergillus spp. contaminación en
muestras de maní (Fig. 5), porque las tres dieron una buena correlación con un alto
coeficiente de determinación, valores de R2 de 98.21, 98.71, 99.37% para A. flavus NRRL
1957 (como ejemplo), respectivamente, cuando regresaron linealmente a cantidad de
moho (también se observaron tendencias similares para otras especies). Además de
estos picos, otros picos relacionados con la grasa en 1464 y 1378 cme1, que representan
las vibraciones de flexión del metileno y la vibración de flexión simétrica de los grupos
metilo de los ácidos grasos, respectivamente, mostraron una ligera caída en la
absorbancia hasta que el moho cuenta entre 20,000 y 100,000 células ; luego aumentó al
valor de absorbancia inicial a medida que avanzaba la invasión. La altura del pico a 1238
cm - 1, que se relacionaba con el estiramiento de C- O de los ésteres, tuvo una tendencia
similar, mientras que la banda en 1118 y 1095 cm-1 disminuyó con un mayor crecimiento
de moho. Esas bandas pueden asignarse al grupo CeO en ésteres ( Guillen y Cabo ,
1997) de triglicéridos y pueden usarse para estimar el nivel de degradación de lípidos o
crecimiento de hongos. De manera diferente, el pico a 1416 cm - 1 aumentó con la mitad
de la tasa en comparación con las bandas anteriores con respecto al recuento
de Aspergillus . En nuestros estudios anteriores, intentamos aumentar la pasta de maní
con la solución de esporas de Aspergillus . Sin embargo, no se observó ningún cambio
visible detectable en el espectro (datos no mostrados), y el maní fue dominante en todos
los aspectos. Los resultados actuales demuestran que la actividad metabólica del hongo
es inevitablemente el factor principal que afecta las lecturas espectrales después de
alcanzar cierto nivel de infección. Además, las diferentes especies tienen un metabolismo
diferente, diferentes metabolitos primarios o secundarios, por lo tanto, diferentes perfiles
químicos a diferentes niveles de crecimiento. Estas alteraciones químicas fueron la base
del análisis discriminante y la clasificación con respecto al nivel de moho.

Fig. 5 Promedio de 3 lecturas de absorbancia con respecto al recuento celular

(UFC / g de maní) para A. flavus NRRL 1957 con números de onda especificados: (◊)
a 1743 cm- 1
; (▫) a 1710 cm -1 ; (B) a 1160 cm-1. Los valores R2 correspondientes y las
ecuaciones de las curvas de ajuste son:
(dd) y ¼ 2 * 10 7 x þ 0.2408 y R2 ¼ 0.9848; (d▪d) y ¼ 2 * 10 7 x þ 0.02 & R2 = 0,9879; (-
- -) y ¼ 1 * 10 7 x þ 0.1798 y R2 ¼ 0.9935.

3.2. Calibración y validación del modelo PLS

 
El análisis de regresión PLS es predecir variables dependientes de un conjunto de
variables independientes logradas mediante la extracción de un conjunto de variables
latentes que tienen el mejor poder predictivo y para obtener una relación entre los valores
predichos y reales de FTIR. Se desarrollaron modelos de regresión PLS separados para
cada especie, incluida la información de concentración celular en términos de Log CFU / g
de maní al decidir el número mínimo de factores que representan la mayor parte de la
variación manifiesta posible mientras modelan bien las respuestas. Los datos
preprocesados (centrados en la media, filtrados alisando la primera derivada) se cargaron
en PLS (algoritmo SIMPLE) y los parámetros de regresión resultantes se resumieron en la
Tabla 2. Todos los modelos se ajustan bien a los valores reales de concentración celular
con valores de R2 que oscilan entre 96.20% (A. alliaceus NRRL 4181) y 99,98%
(A. flavus NRRL 1957); y los valores RMSEC estaban entre 0.153 y 0.014 Log CFU / g de
maní para la misma especie, respectivamente. El RMSEP más alto, que es un indicador
de la precisión del modelo, se observó para A. tamari NRRL 20818 con un valor de 0.235
Log CFU / g de maní. Cuando se investigó el% de diferencia, fue mayor para los
estándares de predicción que las matrices de datos utilizadas para la calibración, lo que
probablemente sea el resultado del gran número de factores utilizados. Esto indica un
ajuste excesivo del modelo de calibración desarrollado para A. tamari NRRL 20818. De
manera similar, se encontró el RMSEV más alto para A. tamari NRRL 20818 (0.280 Log
CFU / g de maní), mientras que A. niger NRRL 326 dio los errores más bajos con valores
de 0.153 y 0.120 Log UFC / g de maní para RMSEV y RMSEP, respectivamente. Los
números de factores se decidieron de acuerdo con el gráfico de suma de cuadrados de
error residual previsto (PRENSA). El valor de la PRESIÓN disminuye a medida que se
agregan los factores. En algún momento, el valor de error llega a un mínimo, lo que da el
número de factores utilizados en PLS. Agregar más factores dará como resultado
modelos de calibración sobreajustados. El número de factores utilizados para cada
especie de Aspergillus se proporcionó en la Tabla 2 y los valores de recuento de células
reales versus pronosticados se ilustraron en la Fig. 6. En general, los bajos niveles de
errores de calibración, validación y conjuntos de datos de predicción para todas las
especies estudiadas demuestran que alto rendimiento de FTIR cuando se usa como
herramienta analítica para la estimación del recuento de mohos. En otras palabras, el
nivel de infección por Aspergillus spp. en maní se puede determinar con muy poca
preparación de muestra y sin el uso de productos químicos en muy poco tiempo (menos
de 1 minuto).
 
3.3. Clasificación
 
W ITH respecto a la concentración celular En primer lugar, todo el grupo de datos se
separó en 4 lotes (cada uno con 8 clases representan diferentes Aspergillus spp.) Y
separadas discriminantes análisis fueron aplicados para investigar los valores de recuento
de células umbral para obtener la discriminación completo en especies nivel . 
 
Tabla 2 Estadísticas de regresión de PLS de cada Aspergillus spp. Estudió

 
Fig. 6. FTIR pronosticado frente a los valores reales de recuento celular (Log CFU \
g) para todas las especies de Aspergillus estudiadas: () A. niger NRRL 326; ( ▵ )
A. flavus NRRL 3357; () A. flavus NRRL 1957; () A. parasiticus NRRL 5862; ()
A. parasiticus NRRL 21369; () A. alliaceus NRRL 4181; ( ) A . caelatus NRLL 25528; ()
A. tamari NRRL 20818.
 
Se utilizaron diez componentes principales para calibrar el método para todos los
conjuntos de datos; y se describió una variabilidad de 74.1, 76.5, 77.6 y 79.6 por ciento
para grupos de Log CFU / g 2.5, Log CFU / g = 3.0e4.0, Log CFU / g = 4.5e5 y Log CFU /
g 5.5, respectivamente. Los diagnósticos de las puntuaciones de PC para cada grupo se
ilustraron en la figura 7aed. Las puntuaciones de PC de cada clase ( Aspergillus spp.)
Tenían una tendencia a apartarse de otras clases a medida que aumenta la concentración
celular, como se esperaba. Cuando los recuentos de células eran inferiores a 500, todas
las especies se agruparon cerca unas de otras, todavía se pudo observar una separación
(Fig. 7a). Dentro del grupo de 2.5 Log UFC / g de maní y menos, 6 estándares fueron mal
clasificados; y el número de muestras mal clasificadas disminuyó a 3 para el grupo de
3.0e4.0 Log CFU / g de maní. Para un bajo nivel de invasión de Aspergillus , es obvio que
los cambios espectrales fueron predominantemente de la matriz de maní. Pero, después
de alcanzar el recuento de mohos de 1000 UFC / g, primero se separó el NRRL 326
de A. niger, seguido por A. tamari NRRL 20818 y el mutante de color UV
A. parasiticus NRRL 21369 (Fig. 7b). En grupos de Log CFU / g = 4.5e5, y LogCFU / g 5.5
todos los datos de la muestra pertenecen a 8 especies del género Aspergillus se
clasificaron correctamente (Fig. 7c y Fig. 7d). La observación más notoria fue que para
todos los valores de concentración celular los centros de clase de A. flavus 3357 y
A. parasiticus NRRL 5862 permanecieron cerca. Se sabe que estas cepas
son productoras de aflatoxinas , y los metabolitos secundarios aparentemente similares
producidos aumentan la similitud dentro de las lecturas espectrales. Anteriormente, se
informó que los diferentes metabolitos producidos por las cepas en el mismo taxón se
discriminaban bien (Fischer et al., 2006). Asimismo, el nivel y el tipo
de micotoxina producida se relaciona con el nivel de infección, y esto se usó como un
indicador para la discriminación y cuantificación de diferentes Aspergillus spp. con
respecto a sus metabolitos secundarios ( Kaya-Celiker , Mallikarjunan , Schmale y
Christie, 2014). Esta puede ser una buena explicación para que A. niger perteneciente a
la sección Nigri se separe primero, incluso el recuento de células fue de alrededor de
1000 UFC / g. Además, se sabe que A. niger produce ocratoxina A. Todas las otras 7
especies pertenecían a la sección Flavi , y la separación del nivel de cepa requirió más
recuento celular (alrededor de 10,000) para distinguirse por completo.
 
4. Conclusión
 
Tanto la matriz de maní como los hongos invadidos tienen estructuras complejas, y
ambos absorben fácilmente a frecuencias similares o enmascaran las contribuciones
espectrales de los demás. Con un bajo nivel de crecimiento de hongos (Log CFU / g 2.5),
se descubrió que el maní es el componente principal en las lecturas espectrales. Sin
embargo, algunos cambios en la composición, como una disminución y el consiguiente
aumento en los picos relacionados con las proteínas, o una caída constante en los picos
asociados con los lípidos indicaron que el hongo de interés se volvió dominante en el
medio. Los resultados de la regresión de PLS demuestran el potencial de FTIR-ATR como
una herramienta para el análisis cuantitativo del crecimiento de hongos en la matriz
alimentaria porque se encontraron valores de R2 muy altos junto con porcentajes de error
bajos. Además, los productos de la actividad metabólica de los hongos se agregaron a las
lecturas espectrales y se observó que los hongos en la misma sección se agruparon o
dividieron de acuerdo con sus metabolitos secundarios. Esto indica que los granos de
maní se pueden separar automáticamente como saludables o invadidos. Además, según
las etapas de deterioro por hongos, se puede decidir el nivel de metabolitos
secundarios. Este proyecto está financiado por Peanut CRSP (USAID) con el objetivo de
mejorar el sustento de las comunidades rurales pobres en el este de África, haciendo
hincapié en los aspectos de salud y nutrición de la inflato de aflatoxinas y Aspergillus en el
maní. En muchos países africanos, especialmente en Uganda (donde el proyecto se centró
regionalmente), existe una grave falta de personal / científico capacitado y tecnología actualizada
para manejar y analizar estos contaminantes en el maní. La tecnología basada en FTIR-ATR es
capaz de medidas rápidas y no destructivas de Aspergillus spp. muy fácilmente (el
análisis de una muestra lleva menos de 1 minuto) y sin la necesidad de extracciones
químicas agresivas. El método tampoco requiere mucha mano de obra. La
implementación potencial del modelo propuesto puede mejorar la calidad de los
cacahuetes suministrados mediante la clasificación de los cacahuetes infectados; y
posteriormente, vencer la restricción de salud y comercio resultante de la contaminación
por hongos.
 
Fig. 7. Gráfico de puntuación de PC para grupos: (a) Log CFU / g 2.5; (b) Log CFU / g
= 3.0e4.0; (c) Log CFU / g = 4.5e5; (d) Log CFU / g 5.5. Las especies
de Aspergillus son: () A. niger NRRL 326; () A. flavus NRRL 3357; () A. flavus NRRL
1957; () A. parasiticus NRRL 5862; () A. parasiticus NRRL 21369; (◊)
A. alliaceus NRRL 4181; (þ) A. caelatus NRLL 25528; () A. tamari NRRL 2081