COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO Y PREPARACION

1Luz Elena de la Ossa1, Jesús Hernández Gómez1

1Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Universidad de Sucre, Facultad de Educación y Ciencias,
Programa de Biología. Cultivo de tejidos vegetales

Resumen

Con base en las soluciones madres preparadas en la práctica anterior y otros

compuestos, se prepararon los medios de cultivo teniendo en cuenta los
reguladores de crecimiento y su concentración. Se usaron dos reguladores de
crecimiento y dos concentraciones para cada uno (2.,4 D y Picloram a 150 y 200
mg/ml); con 3 repeticiones para cada uno, para un total de 12 unidades
experimentales. En esta práctica se adquirieron conocimientos y destrezas para la
preparación de los medios de cultivos.

Palabras claves: 2,4 D, Picloram, regulador de crecimiento, agente gelificante.

INTRODUCCIÓN micronutrientes son requeridos en

Los medios de cultivo in vitro ofrecen
una excelente condición para simular
el crecimiento de las plantas en su
entorno natural. Los medios de cultivo
contienen lo siguiente:
Fuente de carbono. Se usa por lo
general sacarosa, y esta es capaz de
reemplazar la glucosa y la fructuosa.
Se necesita carbono porque muy
pocos cultivos in vitro son autótrofos.
La incorporación al medio de
Mioisonitol generalmente da como
resultado un mejor crecimiento de los
callos y suspensiones celulares.
Nutrimentos minerales. Esto incluye
macro y micronutrientes. Los
macronutrientes son elementos
requeridos en concentraciones
mayores a 0.5 mmol/l y estos son N,
K, P, Ca, S, Mg, Cl. Los
concentraciones menores a 0.5
mmol/l y estos incluyen Fe, Mn, Mo, I,
Cu, B, etc.
Vitaminas. Por lo general solo se le
adiciona tiamina a los medios de
cultivo, aunque pocas veces se le
adicionan otras como otras vitaminas
del complejo B, vitamina C, D, etc.
Agente gelificante. Por lo general se
usa agar. Para la preparación de los
medios de cultivo se tiene en cuenta
mucho la pureza del agar, ya que es
frecuente la presencia de impurezas
de naturaleza variada.
Regulador de crecimiento. En
algunos casos se obtienen en los
cultivos in vitro las respuestas
deseadas mediante el empleo del MB
sin reguladores de crecimiento. Sin
embargo, es necesario usarlas como
auxinas como por ejemplo, el 2,4 D, Tabla 1. Diseño de los medios de
ANA, AIA, y AIB, y citoquininas como cultivo
KIN, BAP y ZEA.

Materiales y métodos

Para la preparación de los medios se

tuvo en cuenta los reguladores de
crecimiento y su concentración en
cada medio con el fin de ponerlos a
Para el procedimiento (fig.1), se
prueba en otra práctica de
tomaron las cantidades necesarias
laboratorio. Por ello, será un
para un volumen de 160 ml, teniendo
experimento factorial 2x2 (2
en cuenta datos estándares para un
reguladores de crecimiento y 2
volumen de 1 l (ver anexo 1), los
concentraciones) con 3 repeticiones
cuales fueron divididos en 4
cada uno, con un total de 12
volúmenes de 40 ml para ser
unidades experimentales (Tabla 1).se
transferidos a pequeños
utilizó el procedimiento descrito por
erlenmeyeres. Luego se aplicó el
Murashige y Skoog (1962),
regulador de crecimiento
correspondiente para cada
tratamiento y se continuó la práctica
como se indica en la figura 1.
 Sacarosa (4,8 g) Mioisonitol (0,016 g) Tiamina (0,16 ml) Sales MS (1,6 ml)

Erlenmeyer
160 ml

Dividir en 4
volumenes
Picloram 1,5 mg/ml (0,6 ml) * 2,4 D 1,5 mg/ml (0,6 ml)*

Picloram 2,0 mg/ml (0,8 ml)* Erlenmeyer 40 ml 2,4 D 2,0 mg/ml (0,8 l)*

Regular el pH de (NaOH
Calentar en
1N y ácido acético)
plancha

Agregar Agar (0,276 gr)

Agitar y seguir
calentando

Agregar en 3 frascos Tapar las bocas Tapar todos los

de compota a igual Dejar solidificar con papel frascos con papel
volumen. aluminio craft y almacenar

* Se agrega dicha cantidad dependiendo del tipo de tratamiento de cada uno de

los medios usados (1 regulador por medio)
RESULTADOS
Fig. 2 Erlenmeyeres con un volumen
de 4º ml, y con los reguladores de
crecimiento ya agregados
Fig. 3 Calentamiento de los
erlenmeyeres para agregarles el agar
(planch Heidolph Mod. MR 3001)
Fig. 4 frascos de compota ya
preparados y cubiertos con papel
crack para su almacenamiento
DISCUSIÓN.
Para esta práctica fueron usadas las
soluciones madres preparadas con
anterioridad. Las funciones de
algunos de los macro y
micronutrientes en el desarrollo de las
plantas fueron discutidas en el
anterior informe.
Además de las soluciones madres,
para esta experiencia se usaron otros
componentes como lo son los
reguladores de crecimiento, un
agente gelificante, una fuente de
carbono y una vitamina.
La sacarosa fue usada como una
fuente de carbono. Este disacárido
compuesto por glucosa y fructosa es
usada en concentración de 20000 a
30000 mg/l para los medios de
cultivo. Como el azúcar es sensible al
calor, si se somete a calentamiento
por autoclave, puede romperse el
enlace glucósido de la molécula y
originar glucosa más fructosa. Lo
anterior conduciría a resultados
diferentes si se utilizara una solución
de azúcar esterilizada por filtración.
Otros monosacáridos como la
galactosa y la maltosa son menos
efectivos que la sacarosa. Otra fuente
de carbono es el Mioisonitol, el cual
es un componente de la membrana
celular vegetal.
La tiamina es, generalmente, la única
vitamina que se agrega a los medios
de cultivo. La tiamina participa como
cofactor en enzimas del ciclo de
Krebs, la via de las pentosas fosfato,
et. Además, ha sido recientemente
demostrado que el difosfato de
tiamina que tienen funciones
diferentes como un cofactor en
respuesta al estrés abiótico y biótico
en las plantas.
El agar es una gelatina y a su vez, un
polisacárido sin ramificaciones
obtenido de la pared celular de varias
especies de algas de la familia
Rhodophycaeae. El agar es usado
como un agente gelificante para el
medio de cultivo. Tiene una fuerza de
gel muy alta, >1.000 gr/cm², lo que le
permite usarlo, en pequeñas
concentraciones, en aplicaciones
típicas del 0.45 al 0.6% o en
concentraciones más altas cuando se
emplea junto con otros hidrocoloides.
El agar presenta una transparencia
excelente además de identificar
visualmente la contaminación de
bacterias o mohos que puedan
interferir en el desarrollo de cultivos
de plantas.
El 2,4 D o ácido 2,4-
dichlorofenoxiacético y el Picloram
son usados para el cultivo de tejidos
como un análogo sintético de auxina,
y en bajas concentraciones actúan
como el ácido indolacético (IAA). El
2,4 D se utiliza para inducir la
formación de raíces en los callos no
diferenciados, así como para
estimular la división de células. El 2,4
D es un compuesto que se le
encuentra en el temido “agente
naranja” usado como defoliante
durante la Guerra de Vietnam.
Cuestionario.

1. ¿Qué otros tipos de medios de cultivo se conocen, y cómo están

constituidos?
2. Hay medios específicos para algunas especies vegetales? Cuáles son
las especies y los medios?

Si los hay, pero son muy parecidos entre las diferentes especies y solo varian
en las concentraciones y en la adicion o supresión de ciertos reactivos.
Ejemplos:

3. Cuales son algunas fuentes compuestos fenólicos que son

de contaminantes orgánicos
e inorgánicos que se pueden
presentar en los medios de
cultivo?
Los contaminantes orgánicos que
se pueden presentar son por
producidos por las plantas que
crecen en el medio.
También pueden presentarse
contaminación con compuestos
inorgánicos que están presentes
en los reactivos usados, producto
 de la contaminación con los
instrumentos para tomar los
diferentes reactivos al momento
de pesarlos.
4. Cuáles podrían ser las
evidencias de que los
cultivos de tejidos y/o el
medio puedan experimentar
cambios bioquímicos con el
tiempo?
Evidencias como el cambio de color
del medio, cambio del olor, cambios
extraños en la planta (cambio de
color de las hojas, marchitamiento,
etc),
5. Cuál cree usted que son las
posibles ventajas o
desventajas de usar medios
sólidos o líquidos en el
proceso de
micropropagación de tejidos
vegetales?
Medios líquidos
Ventajas
 Permite transferir una planta
de un medio a otro
instantáneamente
 No requiere agentes
gelificantes
 Los nutrientes son más
fácilmente tomados por la
planta
 Puede ser esterilizado por
filtración
Desventajas
 Resulta difícil controlar la
contaminación por
microorganismos
 Le resulta a la planta más
complicado ampliarse
Medios solidos
Ventajas
 La planta se ve menos
perturbada por el movimiento
 Si se presentara una infección
por microorganismos, seria
fácilmente controlada. Crecería
en un sitio del medio
Desventaja
 Al principio los nutrientes están
distribuidos uniformemente,
pero después de un tiempo, su
distribución es desigual porque
las raíces se expanden y
donde estas estén presentes
hay menos nutrientes que en
el resto del medio.
 Si se realiza la transferencia
de la planta a otro medio, este
medio se destruiría
 Es más costoso
 6. Proponga un medio ideal para cultivar in vitro una planta de su interés

Cultivo in vitro de yuca (Manihot esculenta)

CONCENTRACIÓN
SALES FINAL EN EL MEDIO
mg/L
SACAROSA 30000
MIOISONITOL 100
NH4NO3 1500
KNO3 1850
CaCl22H2O 430
KH2PO4 170
H3BO3 6.2
Na2MoO42H2O 0.25
CoCl26H2O 0.025
KI 0.86
MgSO47H2O 390.0
MnSO44H2O 22.3
ZnSO47H2O 8.6
CuSO45H2O 0.025
Na2EDTA 37.3
FeSO47H2O 27.8
TIAMINA 0.2
AC. NICOTINICO 0.4
PIRIDOXINA 0.4
GLICINA 3.0
2,4 D 1.5
ANA 1.0
BAP 1.0

Referencias Protocols. 2° edicion. Editorial

 Baran, T.; Ghosh, B. 2005.
Plant Tissue Culture Basic and
Applied. 1° edicion. Universities Press
(India). Pag. 28}
 Loyola-Vargas, V.; Vazquez-
Flota, F. 2006.Plant Cell Culture
Humana Press. Totowa- New Jersey.
 Abdelnour- Esquivel A.; Vicent,
J. 1994. Conceptos básicos del
cultivo de tejidos vegetales. Pag. 15-
17
 Roca, W., Mroginsky L. (1993).
Cultivo en tejidos en la agricultura;
fundamentos y aplicaciones. Cali,
Colombia.

Anexos

Anexo 1: cantidad usada de cada

uno de los reactivos de reactivos
empleados (para 1L de medio)

Reactivos Cantidad
Sacarosa 30 g
Mioinositol 0.1 g
Tiamina 1 ml
Sales MS 10 ml c/u

Agar para cultivo de

4.9 g
tejidos

La cantidad usada de cada uno de

estos compuestos era para un
volumen de 160 ml, y dichas
cantidades (indicadas en el
procedimiento) se calcularon usando
la siguiente relación

Ejemplo: para la sacarosa

30 g ------------ 1000 ml

X ---------------- 160 ml

X= (30 g * 160 ml)/1000 ml = 4.8 g de

sacarosa

Lo anterior se realizó con cada uno

de los reactivos