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Bacteriófago Lambda
Luis Kameyama, Norma Oviedo y Gabriel Guarneros.
Departamento de Genética y Biología Molecular, CINVESTAV-Instituto
Politécnico Nacional

Introducción

El estudio de las bacterias estaría incompleto sin el estudio de sus elementos
extra-cromosomales como son los plásmidos y sus virus (bacteriófagos ó fagos). Estos
elementos son autónomos ya que pueden replicarse por si solos, portan información
genética y pueden conferirle a la bacteria nuevas propiedades. Los bacteriófagos al igual
que las bacterias, pueden encontrarse en casi todos los lugares, pero se presentarán
generalmente donde estén sus huéspedes obligatorios.
Los fagos pueden clasificarse de acuerdo a su desarrollo en dos grupos: los
fagos virulentos y los fagos temperados. El desarrollo de los fagos virulentos se inicia
infectando a la bacteria, posteriormente sus genes son transcritos y traducidos para
producir sus propias proteínas, las cuales son necesarias para la replicación de su
genoma, para la formación de su cápside y tallo, para el empaquetamiento del nuevo
material genético sintetizado y para la lisis bacteriana, y teniendo como objetivo final la
producción de las partículas o viriones maduros. Los fagos temperados pueden seguir al
igual que los fagos virulentos la vía lítica, pero a diferencia de éstos, pueden convivir
como profagos dentro de la bacteria. A la bacteria que posee un fago integrado se le
denomina bacteria lisógena, y al fago integrado se le denomina profago. En la vía
lisogénica, como en el caso del bacteriófago l (lambda) que infecta a su huésped
Escherichia coli, su ADN inyectado en forma lineal es primeramente circularizado para
ser posteriormente integrado al cromosoma bacteriano. El ADN de l integrado estará
formando parte del cromosoma bacteriano. La replicación del ADN se lleva en forma
pasiva, o sea, solo se replicará si se replica la del cromosoma del huésped. Las funciones
para que se desarrolle la vía lítica estarán reprimidas y por consiguiente permanecerá en
un estado de latencia. Este estado puede continuar a través de un número indefinido de
generaciones, hasta que algún disturbio ambiental induzca la señal para que el ADN se
escinda. Las funciones líticas se verán reactivadas y se producirán nuevos viriones (Fig.
1).
El bacteriófago l se caracteriza por estar constituida aproximadamente de la
mitad de proteína y la otra mitad de ADN. Su cromosoma la forma una molécula de
ADN de doble cadena y consta de 48,502 pb, conteniendo aproximadamente 50 genes,
que codifican para 5 proteínas relacionadas con la regulación, 7 con la recombinación,
21 con la morfogénesis de la cápside y tallo, 2 con la replicación y 2 con la lisis
bacteriana. El genoma del fago l está organizado de tal forma que presenta grupo de
genes en unidades funcionales. A la derecha del sitio attP (sitio de integración del fago),
se localizan los genes relacionados con la recombinación, posteriormente los genes
relacionados a la regulación, le siguen los de replicación, los de lisis y finalmente los
genes relacionados para la formación de la cápside y del tallo (Fig. 2). La cápside tiene
una estructura icosaédrica, con un diámetro aproximado de 0.05 m, y unido a ésta, una
proyección tubular de 0.15 m de longitud.

la adsorción y la inyección del ADN. continuaremos con el establecimiento y mantenimiento de la represión. El proceso de la infección requiere de energía metabólica del huésped. terminaremos con el ensamblaje de la cápside. equivalente a un ARNm 12S. iniciando con la infección fágica. l puede desarrollarse en forma lítica o lisogénica. Infección La infección es realizada básicamente en dos etapas. 2). El transcrito del promotor pR termina en tR1 y produce un ARNm equivalente de 9S. seleccionando funciones para cualquiera de estas dos vías. El producto del gen J del fago l. Lambda infecta eficientemente a la temperatura de 37°C. el cual está formando parte del extremo distal del tallo de l reconoce al receptor de maltosa LamB ubicado en la membrana externa del huésped. y a partir de su descubrimiento el estudio con el fago l sigue siendo un factor importante en la contribución al conocimiento de la Genética Molecular. . y su producto es un represor transcripcional que regula negativamente la síntesis del represor CI. La adsorción es reversible a bajas temperaturas. Desarrollo lítico del fago lambda Después de la infección. La inyección eficiente del ADN requiere además el producto del gen pstM. así como de los transcritos de pL y pR (Fig. El transcrito temprano de pR contiene al gen cro. proteína relacionada en el transporte de fosfato y ubicada en la membrana interna. El transcrito temprano de pL contiene al gen N y cuyo producto N suprime los terminadores de la transcripción. Se ha observado que la infección por l ocurre sin cambios contráctiles en la estructura del tallo. así el fago l seguirá un estricto plan de desarrollo. Una vez que el ADN ha penetrado a la célula. Posteriormente los extremos del ADN son unidos en forma covalente por la ligasa del huésped. y el control de la regulación de la expresión de genes necesarios para su desarrollo lítico o lisogénico. El transcrito temprano de pL termina en el terminador de la transcripción tL1 y produce un transcrito de ~1. es circularizado por unión de sus extremos cohesivos en los sitios cos (regiones de cadena sencilla de ADN de 12 nucleótidos y cuyas secuencias se complementan). nos enfocaremos en la descripción del desarrollo del fago l. pero resulta irreversible una vez que el ADN ha sido inyectado. El programa lítico empieza con la iniciación simultánea de la transcripción de dos promotores: el izquierdo pL y el derecho pR. producto de genes virales y del huésped.000 nts. Si l opta por el desarrollo lítico requerirá de la expresión concertada de varias funciones. y las funciones propias de la lisogenia serán reprimidas. 2 Lambda fue descubierto por Esther Lederberg en 1951. Posteriormente describiremos la recombinación integrativa y las diferentes formas de replicación. En este capítulo. empaquetamiento del ADN y la lisis celular. a diferencia de lo que sucede con el fago T4.

ya que una excesiva actividad de pL. Este terminador es mucho más eficiente que tR1 y solamente es suprimido por la presencia de N.200 daltones. 3 Transcripción temprana-tardía La proteína N modifica a la ARN polimerasa que transcribe a partir del promotor pL. del lado izquierdo cII. empieza a disminuir por la inhibición de la transcripción de pL y pR. El producto del gen N es una proteína de ~12.000 nts que incluyen la región b. y la denominaron nut (esta región esta compuesta a su vez por dos sitios: boxA y boxB). 3). produciendo transcritos >7. pueden parcialmente. gam. la síntesis de los genes tempranos (N y cro). Se ha observado que solamente los transcritos originados de los promotores pL y pR son susceptibles de ser antiterminados por la acción de la proteína N. La transcripción de pR´ es constitutiva. Sin embargo. y termina en algún lugar de la región b (Fig. el cual actúa como un antiterminador para la transcripción de pR´. P y Q (Fig. Se ha observado que varios minutos después de la infección. así como de los genes tempranos tardíos (del lado derecho cII. en la expresión de los genes tardíos de l se requiere del producto del gen Q.). Se ha observado que la sobreproducción de varios productos de l produce efectos adversos en el metabolismo de huésped. Esto es debido a que la proteína Cro se une a los operadores oL y oR. Este transcrito es detectado aún en una lisógena reprimida. así como de pR puede ser letal para el desarrollo de l. así como del fago. la ausencia de N. antagonizando con la función de los terminadores de la transcripción. fagos con deleciones en tR2 (l nin). Mutaciones en este sitio. no permite que Q sea expresada. 3). O. provocan que la transcripción termine en tL1. y a otros más localizados en el operón izquierdo. Esta desconoce a los terminadores de la transcripción tL1. El mensajero a partir del promotor pR termina ~50% en tR1. El análisis por secuencia reveló que las mutaciones que no eran capaces de antiterminar caían en una región de simetría . beta. Regulación del programa Lítico Mecanismo de acción de N. que se traslapan con sus respectivos promotores pL y pR. Transcripción tardía La siguiente etapa. Este promotor esta localizado entre el gen Q y el gen R. tL2. localizado entre el promotor pL y el terminador tL1. El ARNm 6S producido corresponde a la región del inicio de la transcripción sR´ al terminador tR´. el transcrito de pR´ por la acción de Q se extiende a través de los genes tardíos que en su mayoría codifican para las proteínas estructurales. propagarse en forma lítica aún en ausencia de la proteína N. aún en presencia de N. 3). La proteína N. Posteriores estudios ubicaron a esta región en los primeros 70 pb con relación al inicio de la transcripción de sL. Así. Salstrom y Szbalski en 1978 reportaron una región en el operón pL necesario para que se llevara la antiterminación. La inhibición debida a Cro resulta esencial para el programa lítico. que activa la expresión de los genes de l. más allá del sitio attP (Fig. modifica a la ARN polimerasa y transcribe eficientemente los genes cII. etc. P. Así. Entre los genes P y Q se encuentra un segundo terminador tR2. O.

constituyeron la región necesaria para la realización de la antiterminación. Se seleccionaron mutantes de E. 88. 84 y 72. así como N del fago y el sitio nut del ARNm. una doble mutación en –15 y –13 de la secuencia del promotor . Sin embargo. y haga una pausa alrededor de los nucleótidos +16 y +17. 4 de repetidos invertidos y que forman una estructura de horquilla (boxB). que junto con boxA de nutR. pero ambas son capaces de reconocer a la caja A. 4). El factor NusA al igual que la proteína N. respectivamente. y el producto de 12 genes posterior a los genes que codifican para la estructura de la cápside se relacionan con el ensamblaje del tallo. Para que Q actúe se necesita que la ARN polimerasa haya iniciado la transcripción. nusB. Adicionalmente ambos factores interaccionan directamente con la ARN polimerasa. Así este complejo transcribe y desconoce los terminadores de la transcripción (Fig. coli en los minutos: 69. NusE y NusG). El mecanismo por la cual antitermina es diferente al de N. El producto del gen Q es una proteína de ~22. para el operón de pR se identificó una secuencia muy parecida a boxB de nutL. Adicionalmente. La proteína NusG. cuyo producto está involucrado en la antiterminación. el complejo permanece unido al sitio nut del ARNm formando un ARN en forma de asa que crece a medida que avanza la ARN polimerasa. Se forma un complejo comprendiendo a la ARN polimerasa. 11. coli incapaces de crecer l pero que invariablemente permitieron el crecimiento de fagos l nin (independientes de N). los factores del huésped (NusA. ya que es necesario un cambio conformacional del templado de cerrado a abierto en el complejo de iniciación.500 daltones. NusB. En forma similar. reconocen las dos cajas A y B de nut e interacciona a su vez con la ARN polimerasa. Menos estudiadas son las interacciones de los factores NusB y NusE (equivalente a la proteína ribosomal S10). nusD (rho) y nusE. La proteína Q y su función La expresión de los genes tardíos requiere de la función antiterminadora de la transcripción de la proteína Q. Las mutantes llamadas nus ó nus. interacciona con la ARN polimerasa y con NusD (equivalente al factor r de la terminación). e ubicados en el genoma de E. A estos factores se les denominó Nus. La proteína Q actúa sobre el ADN en un sitio denominado qut el cual está localizado entre la posición –10 y –35 del promotor pR´. La unión de Q a qut ocurre mientras esté presente el factor de iniciación s70 en la ARN polimerasa. nusC.fueron localizados en cinco genes: nusA. La parte amino terminal de la proteína N hasta el residuo 19 reconoce a la caja B de nut. se ha demostrado que se requieren factores del huésped para que la actividad de la proteína N sea efectiva. y la parte carboxilo terminal de los residuos 73 a la 107 reconoce a la ARN polimerasa. la región comprendida entre los aminoácidos 34 a 47 interacciona con el factor NusA. por el apareamiento de sus bases. de unos 16–17 pb entre el carboxilo terminal del gen cro y el terminador tR1. El producto de 10 genes que se transcriben posterior a R y S se relacionan con el ensamblaje de la cápside. El producto de los genes R y S son los primeros en transcribirse a partir del promotor pR’ y están relacionados con la lisis bacteriana. Por otro lado. Este sitio fue denominado boxB. Posteriormente se encontró a otro gen nusG. El modelo que explica la intervención de N para que realice su función antiterminadora es ciertamente complejo.

Para el proceso lisogénico se requiere que los niveles de Cro estén en su mínima expresión. impiden la acción por Q. así como la de CII. pudiera explicarse en la fuerza de estos activadores. y eliminan o reducen sustancialmente la pausa inicial. la proteína CIII. se requiere de la transcripción del promotor pRE. Así. el fago l opta por la vía lisogénica. ya que estimula la actividad de la ARN polimerasa en una forma considerable sobre los terminadores de la transcripción. resulta más difícil entender la disminución de la expresión de CII. 5 reduce la antiterminación por Q alrededor de unas 10 veces sin cambiar la pausa en +16/+17. Al parecer. en adición a N. Esta estructura deberá inhibir la expresión de Cro. y cuyo producto es necesario para que el cromosoma de l se integre al cromosoma bacteriano. La transcripción de pRE es en contrasentido al del promotor pR y requiere del activador CII. que contrarresta la acción de esta proteasa. Debido a que CII es metabólicamente inestable y es degradada fácilmente por la acción de la proteasa HflA del huésped. Para que el estado lisogénico inicie después de la infección. En el estado lisogénico el sistema de represión está funcionalmente activo manteniendo constantes los niveles del represor CI mientras no exista algún disturbio que active el desarrollo lítico. y se solapa con la región 5’terminal del gen cII. En contraste con la de pL. y no requiera de una síntesis adicional de CII para establecer la lisogenia. Este promotor está localizado ~400 pb a la derecha del gen cI. El represor CI es sintetizado a partir de los mensajeros de dos promotores diferentes: pRE y pRM. estos transcritos en contrasentido a los de pR pueden complementarse y unirse con los de pR formando una doble hélice de ARN. ya que ésta es requerida para la producción de CI. los niveles de CII en la célula están lo suficientemente altos. Es probable que en el momento en que CII activa al promotor pRE. pero actúan a diferentes tiempos en la vía lisogénica. bajo la influencia de N. Los niveles de la proteína CII en la célula deben estar lo suficientemente altos para activar a pRE y a pI. Una vez iniciada la transcripción del promotor pRE. La inhibición de Cro es fácilmente entendible. Sin embargo. Ambos promotores tienen como función principal la de transcribir al gen cI. La región posterior al inicio de la transcripción es también necesaria ya que mutaciones en +2 y +6. para llevar a cabo su desarrollo lítico. disminuye rápidamente con la distancia. CIII junto con CII son requeridos para que se lleve una eficientemente . Estudios de la medición de la vida media del ARNm indican que la región tardía es uniformemente transcrita. El regulador positivo CII también actúa sobre el promotor pI que transcribe al gen int. Adicionalmente. Establecimiento y Mantenimiento de la Represión Si después de la infección. deberá integrarse al cromosoma bacteriano y habrá de mantener reprimidos los promotores pL y pR. cabe mencionar que el transcrito proveniente de pRE que transcribe al gen cI tiene un Shine Dalgarno lo bastante fuerte para que CI sea traducido en forma eficiente. ya que esta proteína actúa en forma antagónica al represor CI. se requiere un factor adicional del fago. el único factor del huésped necesario para la antiterminación por Q es NusA. El hecho de que l utilice otro regulador positivo Q. Este transcrito tardío es sintetizado en forma continua y se extiende alrededor de unos 26 kb.

Concentraciones “normales” del represor en la célula. Estas uniones permiten que de manera cooperativa el siguiente homodímero de CI se una a OR2 y OL2. Después de un cierto tiempo. el represor CI es específico para fagos que tienen la misma región de inmunidad. Este mecanismo en la que una bacteria lisógena es capaz de inhibir la infección por un fago homólogo (fago con la misma especificidad del represor) es denominado inmunidad. CIII no será necesario si el huésped contiene un gen hflA inactivo (Fig. Mutaciones en el sitio OR1. 6). respectivamente. La integración se efectúa por un evento de recombinación sitio-específica mediado por la integrasa (Int) codificada por l y por proteínas del huésped llamadas . por medio de una unión en forma homodímera de CI. Si las concentraciones de CI siguen en aumento. De esta manera se autorregula la expresión de CI. Sin embargo. están reprimidas por lo que. Este promotor requiere de la acción del mismo represor CI para activarse. El dímero de CI se une preferentemente a la región OR1 del lado derecho. y a OL1 del lado izquierdo. inclusive la replicación. produciéndose más represor. 5). se active y transcriba al gen cI. El represor CI es mantenido en ~200 copias por célula y no sólo impide la transcripción de genes del profago. su concentración baja y el sitio OR3 es el primero en quedar libre por tener menor afinidad. Los otros sitios OR2 y OR1 quedarían libres. Este sitio y parte del sitio OR2 se solapan con el promotor pRM. En la respuesta lisogénica las funciones líticas. cuando la bacteria se divide. El promotor pRM se solapa con uno de los sitios de la región del operador OR. sino también la transcripción de otros genes de fagos infectantes homólogos. 6 lisogenización. y esta interacción no se extienda al sitio OR3. permiten que los sitios OR1 y OR2 estén ocupados generalmente. manteniendo constantes los niveles de CI en el citoplasma (Fig. hacen que el dímero se una a los sitios OR2 y OR3. el sitio OR3. en forma que al replicarse el profago se transmite igualmente a las células hijas. Para el mantenimiento de la represión se requiere primeramente que el represor CI actúe impidiendo la transcripción de los promotores pL y pR. Mantenimiento de la Represión El mantenimiento del estado lisogénico es debido a la acción del represor CI. sobre el lado derecho en los sitios OR1 y OR2 (los cuales se solapan con el promotor pR). La unión del represor al sitio OR2 permite que la ARN polimerasa unida al promotor pRM. el ADN circular del fago l podría ser segregado desigualmente entre la progenie. y del lado izquierdo a los sitios OL1 y OL2 (que se solapan con el promotor pL). el promotor pRM se apagará debido a que el represor se une al sitio OR3. por la unión del represor CI a las regiones operadoras OL y OR del fago(s) infectante. el represor decae. Así. producido de la transcripción del promotor pRM. sino fuera porque el represor CI unido a OR2 es capaz de activar nuevamente a la ARN polimerasa de pRM. Este evento se evita por la integración del ADN de l al genoma de la bacteria. Integración y Escisión del profago l El ADN del fago entra a la célula en forma lineal pero enseguida se circulariza por complementación de los extremos cohesivos y ligación de los "nicks” correspondientes. indicando que la unión es cooperativa entre los dímeros de los represores.

Este evento explica que no se sintetice suficiente proteína Int a partir del ARNm originado en pL para poder integrar el ADN del fago (Fig. que precede a int. La escisión requiere también de Int y de los IHF. el ARNm generado se traduce en Int pero no Xis. 7). requieren de homología en las secuencias de cientos de pares de bases de ADN. la proteína que media la integración. Estas enzimas son exonucleasas que degradan el ARN progresivamente en dirección 3´ a 5´. Ya que las recombinaciones generales de la bacteria o la del fago. El ARNm que contiene la región retroreguladora sib forma una estructura de tallo y asa que es procesada por la RNasa III. el producto del gen xis adyacente a la derecha de int. 7 factores de integración (IHF). pero además contiene la región sib (por sitio inhibidor de la región b) responsable del control postranscripcional de int llamado retroregulación. La proteína CII estimula la transcripción en los promotores pRE y pI que está asociada con el establecimiento de la lisogenia. El de pI es un mensajero que sólo contiene int que es estable debido a la estructura del terminador tI y que se traduce eficientemente en la Integrasa. entre otros. Estos sitios mantienen homología limitada a unos 30 pb. es claro que la integración requiere de otro sistema. los mensajes de xis e int. Expresión de int durante el establecimiento de la lisogenia Cuando después de la infección por l la concentración de CII alcanza niveles relativamente altos en la célula. lo cual implica que el mensajero de int sea eliminado. La proteína Int no es necesaria si la bacteria infectada está comprometida a una respuesta lítica. donde se efectúa la recombinación integrativa. Cuando se levanta la represión de una lisógena se requiere que el profago se escinda del cromosoma bacteriano. . El ARN contiene. Este sistema se le ha llamado "recombinación sitio específica” y se caracteriza por su alto grado de especificidad y direccionalidad. El extremo 3´ generado es susceptible a la degradación por PNPasa y RNasa II. pero además necesita Xis. La transcripción a partir de pI se detiene en el terminador tI una estructura de tallo y asa que está contenida pero no es idéntica a la estructura sib mencionada antes. La transcripción a partir de pRE permite la síntesis del represor de la lisogenia CI y a partir de pI se expresa Int. y reduce la síntesis de proteína Int. No suceden así con el gen xis en el extremo 5´ del mismo transcrito porque dentro del mensaje de int se forma una estructura secundaria que resiste la acción de las exonucleasas. se favorece la ruta lisogénica. La región sib se localiza a la izquierda del gen int distal al sitio attP. Expresión de Int durante la lisis La transcripción del mensaje policistrónico a partir de pL es afectada por la acción de la proteína antiterminadora N (ver arriba). Recombinación sitio especifica de l Los sitios donde se lleva a cabo la recombinación integrativa son attP en el ADN del fago y attB entre los operones gal y bio del cromosoma bacteriano. Ya que el inicio de la transcripción de pI ocurre dentro del gen xis.

Formación del intasoma La integrasa es un polipéptido de ~40.000 daltones. IHF termoestable Las secuencias attL y attR son productos de la recombinación integrativa y sustratos para la escisión. mientras que la escisión ocurre cuando hay una mayor concentración de Xis que de Int. El acercamiento de las cuatro cadenas auxiliadas por el intasoma permite que ocurra el corte en uno de los extremos del núcleo de las regiones att. ocurre la rotación de estas cadenas alrededor de las que no han sido cortadas . coli tiene tres sitios de unión en los brazos de attP. 8). involucra otras secuencias adyacentes (150 pb a la izquierda y 78 pb a la derecha). con funciones de recombinasa. Xis. es sencillo y no contiene secuencias de unión para IHF como los brazos de attP. La recombinación entre ambos sitios att se lleva a cabo gracias a la participación de la integrasa del fago y las proteínas IHF del huésped. y es esencial para la integración ya que requiere de una mayor concentración de int. Int también se une a una sequencia que se repite 5 veces en los brazos de attP. La proteína integrasa participa en ambos procesos. Esta enzima es capaz de cortar y ligar las cadenas de ADN para relajar su estructura y promover el intercambio de cadenas con el ADN de la bacteria. La proteína IHF de E. Las reacciones de inserción y escisión se acostumbran abreviar por la siguiente ecuación: Int IHF termosensible POP´ (attP) + BOB´ (attB) BOP´ (attL) + POB´(attR) Int. además de un núcleo de 15 pb. 8 El sitio de recombinación attP del fago. El símbolo de la región común es O y está flanqueado por los brazos o regiones adyacentes simbolizadas P y P´ que representan los brazos izquierdo y derecho de attP. El modelo de recombinación integrativa postula la formación de una estructura sináptica entre las cuatro cadenas de ADN en sus regiones homólogas. En contraste el sitio attB. La proteína Int se une al ADN formando multímeros consistentes de 4 a 8 monómeros al núcleo de attP (donde el entrecruzamiento de cadenas ocurre) reconociendo un par de secuencias de invertidas repetidas que se encuentran uniendo al núcleo y a los brazos flanqueadores del attP. las dos cadenas con la misma polaridad son cortadas. Int y IHF. La recombinación se efectúa por un mecanismo de corte y reunión en el núcleo común. asimismo attB consta de un núcleo de 15 pb de secuencia idéntica a la de attP y secuencias adyacentes que son parcialmente homólogas a la secuencia de l. attP. unión especifica al ADN de attP y de topoisomerasa. B y B´ simbolizan las regiones correspondientes de attB. tampoco es necesario el superenrollamiento en esta región del ADN para la recombinación. se forma una estructura superenrollada denominada intasoma que es la especie activa de la recombinación integrativa. A estos sitios de unión en attB se unirán las proteínas Int que forman parte del intasoma y no así la proteína Int presente en el citoplasma. Bajo la influencia del superenrollamiento del ADN. La región attB tiene la misma secuencia de 15 pb que se halla en el núcleo del attP y algunos pares de bases que le flanquean completan el par de sitios de unión para Int (Fig.

Es realizada en forma bi-direccional generando moléculas de ADN circulares. En la fase tardía de la infección. La replicación activa es independiente de la replicación del cromosoma del huésped. Xis e IHF. Para esta reacción la presencia de IHF no es necesaria y la proteína Int la puede llevar a cabo. y cuyos productos son necesarios para la escisión (Fig. participan directamente en la iniciación de la replicación. Solamente dos proteínas fágicas. 9 que permite alinearlas con las nuevas cadenas compañeras para ser finalmente ligadas a estas. Se piensa que Xis estabiliza la unión de Int para promover un nuevo evento de recombinación entre attR y attL. La replicación sigue la forma q por la semejanza de las estructuras intermedias con la letra griega Tetha. Las secuencias de estos genes tienen una superposición de 20 pb. y de las cuales la mayoría provienen del huésped. 10). La reacción de escisión es resistente a la temperatura a diferencia de la integración que es inhibida por la temperatura y altas concentraciones de Xis. La replicación en forma pasiva es realizada por la replicación del cromosoma bacteriano. La inactivación del represor CI producida por la proteasa RecA permite la transcripción a partir de pL para producir un ARNm que contiene al gen xis e int. la replicación sigue la forma del circulo rodante (s). ya que el ADN de l esta integrado. En cambio para el primer entrecruzamiento de cadenas si es necesaria la presencia de IHF. La mayoría de las proteínas implicadas en la replicación. Los genes int y xis se localizan juntos inmediatamente a la derecha del sitio attP. Replicación del fago l La replicación del ADN del fago l puede llevarse a cabo en forma pasiva o en forma activa. En la fase temprana. codificadas por el producto de los genes O y P. la cual consta de un gran número de proteínas. La escisión del profago La escisión del ADN del fago requiere de las proteínas Int y Xis. se replica también el de l. Así. y al replicarse el cromosoma bacteriano. pero no la región sib que fue separada físicamente durante la recombinación del sitio attP con attB. Este transcrito no será degradado y permite la traducción de ambos genes eficientemente. la replicación posterior a su inicio sigue el mecanismo establecido del huésped E. entre el extremo 5´de int y el 3´de xis. Para esto las cadenas con los sitios attL y attR son intercambiadas para restaurar los sitios attP y attB. generando múltiples moléculas lineales de ADN de l (Fig. La escisión requiere de Xis la cual tiene 2 sitios de unión en el attR. fueron identificada retando al fago l a replicarse . Para que se lleve a cabo la replicación. 8) La escisión es de tipo sitio especifica y requiere de Int. coli. la replicación es iniciada a partir de un único origen. Para resolver el entrecruzamiento de las cadenas remanentes. rotan y son religadas a las nuevas cadenas correspondientes. estas son cortadas en el otro extremo del núcleo. Esta es llevada a cabo en dos fases: la temprana y la tardía. Este primer intercambio de cadenas tiene la topología de una estructura de Holliday. Cuando se induce la fase lítica se requiere la escisión del ADN del fago. se requiere de la maquinaria replicativa.

se presentan pequeñas regiones de ADN de cadena sencilla. o sea. De acuerdo a este modelo. como la adición de cafeína 2mM al medio. está regulada y normalmente no ocurre. hasta que el ciclo replicativo se haya completado. Se propone que la droga actúa bajando la estabilidad helicoidal del ADN. Replicación Temprana Posterior a la inyección de la molécula lineal del ADN de l. Adicionalmente. no todas las moléculas están en estado replicativo en cualquier momento. puede observarse que alrededor de 50 moléculas por célula están en . Sin embargo. en los inicios de la síntesis del ADN. donde se lleva a cabo la síntesis del ADN. y unido a sus extremos. se ha observado que bajo ciertas condiciones. las dos nuevas cadenas circulares que forman dos cromosomas del fago se presenten en forma concatenada. aún cuando el ciclo replicativo anterior no haya finalizado. indicando que la replicación también sigue el modelo del círculo rodante. La replicación empieza en un origen único y procede bidireccionalmente. se observa que existe un pequeño porcentaje de círculos con una pequeña hebra unida a ésta. Sin embargo. Esta molécula circular por la acción de la ADN girasa se superenrolla negativamente formando el sustrato replicativo. La reiniciación en el origen. 10). sólo ~20% de las moléculas se replican. Ambas cadenas del ADN parental son copiadas. la replicación continúa hasta terminar en el polo opuesto al origen de replicación. Estas estructuras presentan dos cadenas de la misma longitud. Adicionalmente. observándose que ~20% de las moléculas han reiniciado. en la posición de las asas replicativas. de acuerdo al modelo replicativo q. correspondiente a la región replicada. puede explicarse que una de las cadenas es replicada en forma continua y la otra en forma discontinua. Las asas replicativas. Es muy probable que después de este ciclo replicativo. y el número de moléculas se duplica cada 2 – 3 min. se mueven en forma divergente a su origen y progresan a través del círculo con velocidades muy similares. Se ha observado bajo el microscopio electrónico que la mayoría de las moléculas tienen la forma de q en el estadio replicativo temprano. esta es convertida a una molécula circular covalentemente cerrada por apareamiento de sus extremos cohesivos de 12 nts (sitios cos) y su posterior ligación (Fig. La separación de estas no sería posible sin la intervención de una ADN-topoisomerasa. 10 bajo las condiciones no permisivas de temperatura en cepas mutantes termo-sensibles para la replicación de E. o sea cambiando la estructura del templado y facilitando por consiguiente la reiniciación de la replicación. coli. La replicación temprana procede en forma exponencial. La longitud de estas cadenas cortas de ADN de simple cadena coincide con el tamaño de los fragmentos de Okasaki. Estas regiones pueden ser observadas en ambas asas y estando siempre en el inicio y en brazos opuestos. Esta asimetría inherente en la progresión de las asas replicativas y sabiendo que la ADN-polimerasa lleva a cabo siempre su síntesis en dirección 5´ a 3´. una observación más cuidadosa de las microfotografías electrónicas de alta resolución revelan que en varias de las estructuras q. y que la constitución de la doble hélice es antiparalela. Sin embargo. un tercer segmento el cual no ha sido replicado. es posible la reiniciación.

puede llevarse a cabo en forma bidireccional. . puede replicarse tomando una u otra de las cadenas parentales como templado. o sea. Moléculas de dos y hasta ocho veces la longitud del ADN monomérico de l han sido claramente observada después de los 15 minutos en fagos mutantes deficientes en el ensamblaje de la cápside. es la disponibilidad de las proteínas O y P. y da lugar a la síntesis de concatémeros (cromosomas lineales de ADN de l ligados covalentemente de la cápside y la tallo). la mayoría de los cromosomas del fago está en la forma s. La síntesis se inicia en el extremo 3´-hidroxilo terminal y continuando a través del círculo varias veces. Un punto de vista alterno. es que tanto la forma q como s se inicien temprano en la infección. mientras que la complementaria tiene un corte.e int--. y coincide con el origen de replicación de q. las primeras formas replicativas observadas son generalmente de la forma s. Un importante factor que podría regular la transición de la fase temprana a la tardía. mientras que la de s persista hasta tiempos tardíos. Así. la replicación temprana cesa ~15 min de la infección. A tiempos tardíos en la infección. Algunas de las formas replicativas s pueden derivar en forma directa por la inactivación de alguna de las asas replicativas de q. Las investigaciones sobre un hipotético gen esencial que media el cambio entre la forma q y la forma s han sido del todo infructuosas. no existe un mecanismo de transición entre las fases temprana y la tardía en la replicación de l. Se ha observado que ~40% de la forma replicativa s tiene un mismo origen. es decir en cepas bacterianas recA--. Control de la Replicación tardía Al parecer. produciendo ADN de cadena sencilla. La posibilidad de que estos concatémeros pudieran venir del producto de la recombinación. Esta cadena lineal es utilizada como templado para la síntesis de su cadena complementaria. Replicación tardía Durante el crecimiento lítico a 37°C en medio rico. así como de los fagos red-. ya que evita la transcripción a partir del promotor pR. Se ha observado que cuando la síntesis del ADN es retardada por la limitación de la cantidad de las proteínas O y P activas después de la infección. Estos pueden ser empaquetados inmediatamente. Se ha observado que una tercera parte de las moléculas en los primeros ciclos de replicación son de la forma s. La replicación al igual que en la forma q. El modelo del círculo rodante provee un posible mecanismo para la síntesis de ADN concatemérico. Una de las cadenas del ADN parental sirve como templado. La expresión de O y P es limitada a tiempos tardíos por la presencia de la proteína Cro. La primera evidencia de la síntesis del ADN concatemérico viene de las observaciones por la sedimentación del ADN radioquimicamente marcado. la idea de un cambio puede ser errónea. pero la replicación de q se pare tempranamente. 11 forma monomérica helicoidal antes de que transcurran los primeros 15 min de la infección. fue eliminada haciendo los experimentos en ausencia de los sistemas de recombinación.

Algunas formas del tipo s pueden ser detectadas. pero se acumulan muy pocos concatémeros de ADN. Sin embargo. recC y recD que destruye los concatémeros.9% en relación al extremo izquierdo del genoma de l. Así. deleciones en este sitio han permitido una buena replicación.(deficiente en recombinación). sugiriendo que pudiese ser el estado activo del ADN para el inicio de la .6% del extremo izquierdo del genoma l. La doble mutante gam--red-. aproximadamente a 80. 12 El producto del gen gam de l . esta región presenta cuatro cajas muy parecidas de 19 pb conteniendo repetidos invertidos y separados unos de otro por pocas bases.7 ± 2. observándose si la replicación se llevaba a cabo o no en profagos. El origen de replicación fue determinado probando diferentes mutantes con deleciones cercanas a y dentro del gen O. y por complementación de O y P. Esto ubicó al ori entre 81. En efecto. la síntesis de ADN ocurre. y el producto del gen red pudiera también ser de importancia. Este sitio estuvo localizado dentro del gen O. tomando desde el origen de las asas replicativas y extrapolando a la región cero de replicación. Una vez delimitada esta región. Sin embargo. una región de 34 pb a la derecha del sitio EcoRI incrementó la replicación de 20 a 30 veces en el sistema plasmídico. Los multímeros resultantes llevarían al menos dos sitios cos. Sorprendentemente.o recD --.de l puede ser restituida por la doble mutante del huésped recA -. Bajo estas condiciones. Posteriormente. sintetizando concatémeros eficientemente. Debido a la capacidad de suplir la actividad de O por complementación. así como para el 40% de la forma s. El ADN de esta región puede modelarse como una estructura de un trébol complejo. Una región entre el promotor pR y un sitio EcoRI dentro del gen O permite que se replique eficientemente tanto en el sistema de profagos y de plásmidos. pruebas con deleciones indicaron que los límites de ori están comprendidos a no mas de 200 pb del sitio EcoRI. la función crítica de la proteína Gam es la de inhibir la actividad de la exonucleasa V codificada por los genes recB. y muy cerca de los genes O y P. La función de Red y las funciones de recombinación del huésped son menos claras. El origen de replicación en sus inicios fue determinado por mapeo con las microfotografias electrónicas. es incapaz de formar placas en un tapiz bacteriano recA-. Iniciación de la Replicación de l Resulta claro que tanto para la forma q. Sin embargo. la replicación.y r e dB-. el defecto de la replicación del circulo rodante de la mutante gam--red-. la recombinación llega a ser necesaria para la maduración de los cromosomas de l. posiblemente generan recombinantes entre monómeros circulares.o redC-. Se han propuestos otros sitios mas distantes como el sitio ice (inceptor sequence) dentro del gen cII y localizado a 600 pb a la izquierda de ori que facilitan la replicación. se clonó en regiones no esenciales de fagos o en plásmidos. pero sus cadenas laterales son muy cortas. sustratos para una eficiente encapsidación. se inicia en un origen único ori.5 . si la replicación normal es bloqueada.de l . se pudieron hacer ensayos más finos mutando el origen de replicación (dentro del gen O) y se definió un segmento mínimo de 63 pb como el origen de la replicación. se observaron si eran capaces de replicar o no.80. Así. claramente juega un papel importante en la síntesis de concatémeros de ADN. por lo que a ori se le considera el único sitio indispensable para que se lleve a cabo una replicación normal. estudios genéticos determinaron con más precisión el sitio de control para la iniciación de la replicación.

La proteína P interactúa con diferentes proteínas del huésped. existen otros antibióticos que inhiben indirectamente la replicación como son el Ac. La interacción específica entre la proteína O y el segmento ori ha sido identificado por análisis genéticos y bioquímicos. para ésto DnaJ/DnaK se asocian a P dejando libre a DnaB. El origen ori tiene otra estructura no usual a la derecha de los repetidos. La proteína P es una proteína de 26. producto de la replicación de la forma s. la iniciación de la replicación requiere una activación transcripcional de la síntesis de un ARN cercano al origen de la replicación. indicando que la interacción a P es con la parte carboxilo terminal de O. Ensamblaje de las partículas virales de lambda l presenta la cápside en forma de icosaedro. Esto sugiere que el sustrato para la iniciación de la replicación debe ser un sistema de ADN superenrollado. actúa en forma dimérica. El mecanismo propiamente de la replicación como el reconocimiento para su iniciación. En una lisógena para l cuando se coinfecta con el mismo fago y un fago auxiliar heteroinmune que provee las proteínas O y P de l. Para que se inicie la replicación se requiere de la salida de P del complejo de iniciación. Su acción es indirecta. la cual es rica en pares de A· T y exponiendo una distribución asimétrica de purinas y pirimidinas. La asociación con la proteína DnaB y su modificación en su actividad podrían permitir que DnaB entre al complejo replicativo del ADN de l.000 daltones. El producto de los genes grpD y grpE están involucrados también en la salida y regeneración de P. de 34. que contiene el ADN de doble cadena. inhibidores de la ADN-girasa.000 daltones que de acuerdo a las evidencias genéticas sugieren que también puede interactuar con la proteína O. La proteína O.500 nm de largo. Existen algunos antibióticos como la rifampicina que inhiben la replicación. y los precursores de las cápsides interactúan mediante el reconocimiento de las regiones cos . Estas propiedades deben facilitar la desnaturalización local de la doble hélice. Estas son partículas víricas pequeñas de 55 nm de diámetro que guardan en su interior al genoma completo de l de 16. funciona eficientemente para la replicación con la proteína P del fago f80 pero no con la proteína P de l. Además de las proteínas replicativas y al sitio ori. coli. el genoma reprimido de lambda no es capaz de replicarse indicando la necesidad de la activación transcripcional. La región amino terminal de O es esencial para el reconocimiento del ADN y se une a una región de 95 pb en la cual están contenidas las cuatro cajas. El ADN concatemérico. 13 replicación. La proteína híbrida O que contiene la parte amino terminal de l y la parte carboxilo terminal O de f80. ya que al inhibir la transcripción de pR. Mutaciones del tipo temperatura sensible pueden ser suprimidas por mutaciones que mapean en P. evita la activación transcripcional para la replicación. el complejo ARN polimerasa para la elongación y para la terminación es muy similar a la que ocurre con su huésped E. entre estas la mejor caracterizada es con la helicasa del huésped DnaB. Nalidíxico y la Coumermicina. coli y se recomienda ver el capítulo de la Replicación en E. La construcción de la cápside y el posterior empaquetamiento del ADN comprende la participación de proteínas del fago y de la bacteria. Similarmente.

Las proteínas B. Estos nuevos espacios son ocupados por la proteína D en un número equivalente al de la proteína E. brindándole estabilidad a la cápside madura. también se necesita la participación de dos proteínas del hospedero. las proteínas IHF y THF. 11). la cápside sufre una expansión del 75% en su tamaño. la terminasa se disocia de la cápside madura pero continua . La proteína B forma el conector entre la cápside y el tallo del virión. sino también de la unión de este con el precursor de la cápside. La terminasa no solo se encarga del reconocimiento de los sitios cos. es posible introducir ADN heterólogo con gran eficiencia en vectores que cuenten con las regiones cos al ser empaquetados en reacciones in vitro. Las proteínas del huésped son necesarias para evitar malformaciones de la cápside al ensamblarse las proteínas E y Nu3. la dirección de empaquetamiento del ADN es del gen Nu1 a R. dejando espacios en la estructura de la red conformada por la proteína E. en la etapa final de maduración requiere del empaquetamiento del ADN dentro de la cápside. La afinidad de la terminasa en la región de cos es estimulada por la unión y doblamiento del ADN. La proteína E forma la estructura del poliedro principal y la proteína D se encuentra en la superficie formando un arreglo eicosaédrico en la cápside madura. es decir. la proteína B es escindida para formar la proteína B* en tanto que la proteína Nu3 es degradada y removida de la estructura. Durante la maduración de la cápside. La entrada del genoma de l a la cápside se realiza en forma polar. 11). El reconocimiento es llevado a cabo gracias al motivo a hélice -vuelta. para que se realice el corte en el sitio cos. La entrada de solamente una unidad cromosomal por cápside es controlada por el reconocimiento del sitio cos terminal por la terminasa. C y Nu3 del fago junto con las proteínas GroEL y GroES del huésped interactúan para formar la cápside primitiva. B y C en la estructura del precursor. el cual está dispuesto en forma de un anillo con un orificio central. La cápside del virión se forma independientemente del ensamble del tallo. Como se mencionó antes. El corte del ADN en su región cos termina con el empaquetamiento. y al unirse ambos conforman la partícula viral madura. efectuado por el factor IHF del huésped. Esta subunidad se une a 3 o a 4 secuencias repetidas en la región cos. Durante el empaquetamiento del ADN. La unión del complejo I al precursor de la cápside genera el complejo II. Sin embargo. Este será el orificio de la entrada del ADN. En el sitio cos se localizan dos de estos sitios en cadenas opuestas y a una distancia de 12 nucleótidos. La terminasa de l consiste de dos subunidades (Nu1 y A) que reconoce secuencias especificas en la región cos. El ADN concatemérico del fago es reconocido en el sitio cos por la terminasa (complejo I). cuya reacción es potenciada por la proteína FI del fago (Fig. Solo se sintetizan de 100 a 200 moléculas de terminasa en el curso de una infección. y establece el origen y dirección de empaquetamiento. Se requiere de la participación de cuatro proteínas del fago y por lo menos de dos proteínas de la bacteria para formar la cápside. El empaquetamiento requiere de la hidrólisis de ATP para la condensación del ADN de 30 a 200 veces dentro de la cápside.a hélice de la subunidad pequeña de la enzima Nu1. La subunidad mayor tiene actividad de endonucleasa que rompe el enlace fosfodiester en una de las cadenas (nick). Las proteínas C y E participan en una fusión para formar proteínas híbridas X1 y X2 (Fig. La proteína Nu3 facilita el ensamble de las proteínas E. 14 por parte de la enzima terminasa que se encarga del empaquetamiento y corte posterior en la región cos.

Este se “prende” aproximadamente a los 8 min del ciclo vegetativo y se expresa en forma constitutiva. Esto se explica por la expresión diferencial de las proteínas. así como la síntesis macromolecular. observándose un incremento de la masa celular. Los genes de la holina y endolisina. éstas deberán salir y dispersarse para encontrar nuevas bacterias y poder multiplicarse. y permita que la endolisina cruce la membrana celular. Los genes estructurales no se encuentran dispuesto al azar en el genoma de l sino que los genes de la cápside y del tallo se hallan agrupados en dos regiones que no se solapan. Los polipéptidos precursores son sintetizados secuencialmente en las cantidades apropiadas durante el ensamblaje. con una acumulación de viriones en el citosol. La estrategia que sigue el bacteriófago para sortear esta barrera es producir una endolisina para degradar los componentes de la pared celular. Una de las principales barreras para la salida de las partículas es la malla continua de peptidoglicanos de la pared celular. S y R respectivamente del genoma del fago l. 15 unida al ADN concatemérico para formar un nuevo complejo II con otro precursor de la cápside. el ensamblaje del tallo se lleva a cabo en forma independiente de la cápside. una fibra terminal de 23 nm. Esta es una proteína de membrana que daña a la membrana interna y da libre acceso de la endolisina a la pared celular (Fig. Deleciones en los genes de los holina permite que la respiración continúe. La endolisina es una transglicosilasa que por si sola no es capaz de llegar a su sustrato porque la pared celular se encuentra separado del citosol por la membrana celular. La endolisina activa se acumula en el citosol. están localizados en el inicio de la unidad transcripcional tardía. a pesar de ser transcriptos a partir de un solo promotor (pR’). no teniendo acceso inmediato a su sustrato. En tanto que las proteínas W y FII se unen al conector del tallo para evitar la salida del ADN y formar el sitio de unión del tallo con la cápside madura.12). bajo el control del promotor pR´. Pero si se altera la producción de algunas proteínas. El producto del gen J compone la fibra terminal que interacciona directamente con el receptor LamB de la superficie de la bacteria. En tanto. Esta estructura es estable y resistente y permite mantener la presión osmótica interna de la célula. es que la holina forme poros. La más simple explicación. Una característica común del sistema basado en la holina es su dependencia con la membrana energizada. ya que la . se produce un ensamblaje inadecuado que deriva en la formación de cápsides defectuosas. producto de la traducción diferencial de los cistrones. La holina forma lesiones en la membrana que terminan con la respiración y permiten que la endolisina ataque a la mureína. Se compone principalmente de 32 anillos apilados compuesto cada uno de 6 subunidades de la proteína V. El ensamblaje de la partícula viral se debe principalmente a un fino equilibrio de las diferentes proteínas de la cápside y tallo. Lisis Celular Una vez formadas las partículas virales. El tallo del fago l consiste de un tubo flexible (no contráctil como en el caso de T4) de 135 nm con un extremo cónico de 15 nm. y para llegar a éste requiere de un segundo factor lítico. Es interesante notar que los productos de genes que interactúan durante el ensamblaje se encuentran codificados en genes adyacentes. la holina.

Así. Debería parecer que la relación holina – inhibidor estuviera activamente regulado bajo condiciones fisiológicas. La parte citoplasmática del carboxilo terminal es necesaria para la formación del poro y tiene un papel regulatorio. El cronometraje de la lisis depende de la proporción de las dos proteínas. pero aún no se tienen evidencias que tal regulación haya sido reportado. esta es una prueba de que la holina tiene dos funciones esenciales: causar la lisis permeabilizando la membrana y retardar la lisis hasta que el programa del ensamblaje del virión haya generado un número suficiente de viriones. dependiendo de sus residuos cargados positivamente. La función inhibitoria de la proteína de 107 es su carga positiva de la posición 2 (lisina). le confiere un defecto total en la lisis. su dependencia energética. donde un ciclo vegetativo más extendido pudiera ser favorecido. sugiriendo que la habilidad para retardar la lisis del inhibidor 107 es un evento poblacional. Tanto la holina activa de 105 aminoácidos. Parte de la respuesta está en la proteína de 107 residuos. Mientras que la mutación alanina por glicina (A52G) causa una catastrófica lisis temprana. la cual es 2:1 a favor de la de 105 aminoácidos. Se ha observado que una misma mutación en la región transmembranal 2 (TM2) que cambia la alanina por valina (A52V). así como la inhibitoria de 107 aminoácidos. La holina S es insertada en la membrana formando una estructura de horquilla con las regiones TM2 y TM3. antes de que el primer virion sea ensamblado. Este fenómeno de la lisis prematura sugiere que el mecanismo de cronometraje de la lisis depende de la membrana energizada. ¿Cuál es el papel de las membranas energizadas?. Propiedades de la holina El gen S de la holina codifica para dos péptidos: uno de 105 aminoácidos y otro similar. y sabiendo que ciertos venenos que interfieren con el proceso energético disparan prematuramente la lisis. 16 adición de venenos contra su sistema energético. eliminan su capacidad inhibitoria y la convierte en una holina activa. presenta 3 regiones transmembranales con la topología amino terminal siempre hacia fuera y el carboxilo terminal hacia el citosol. La holina puede unirse al menos en multímeros de seis para formar el poro. Si no se tiene algo adicional. Estas consideraciones han permitido proponer un modelo para el evento del disparo de la holina. se puede retardar o acelerar la lisis. ~20 min. Alterando artificialmente la proporción del inhibidor o de la holina. Regulación de la función de la holina ¿Qué es lo que hace que la holina dispare la formación del poro en el minuto 50 sin hacerlo antes o después?. instantáneamente disparan la acción de la holina. bajo condiciones estándares de cultivo. el inhibidor 107 es defectuosa en llevar a cabo este reacomodo ya que presenta una carga positiva extra en la porción amino terminal. por la penetración amino terminal a través de la capa bilipídica. respectivamente. Graschopf y Bläsi fusionando una secuencia señal en la parte amino terminal de 107. . pero con 2 aminoácidos adicionales. y su mecanismo inhibitorio. La formación del poro deberá requerir que la estructura final tenga 3 regiones TM. son traducidas de diferentes Shine Dalgarno. acumulándose los viriones mas de la cuenta. o sea de 107 aminoácidos.

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