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METABOLISMO BACTERIANO

NECESIDADES METABÓLICAS
El crecimiento bacteriano requiere una fuente de energía y la materia prima
necesaria para la fabricación de proteínas; las bacterias deben obtener o sintetizar los aá,
carbohidratos y lípidos para fabricar los constituyentes celulares.
Las necesidades mínimas para el crecimiento son una fuente de carbono y
nitrógeno, una fuente de energía, agua y diversos iones. Los elementos esenciales son los
componentes de las proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (C, O, H, N, S, P), iones
importantes (K, Na, Mg, Ca, Cl) y componentes de las enzimas (Fe, Zn, Mn, Mo, Se, Co,
Cu, Ni).
El Fe es tan importante que muchas bacterias secretan proteínas especiales
(sideróforos) para concentrarlo en soluciones diluidas. (El organismo “secuestra” el hierro
para reducir su disponibilidad).
 El gas oxígeno (O2) puede resultar tóxico para algunas bacterias, las que no pueden
crecer en presencia de éste (bacterias anaerobias estrictas). (Ej: Clostridium
perfringens)
 Otras bacterias requieren la presencia de oxígeno molecular para su crecimiento
(bacterias aerobias estrictas). (Ej: Mycobacterium tuberculosis)
 La mayoría de las bacterias pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de
oxígeno (bacterias anaerobias facultativas).
Las bacterias aerobias producen las enzimas superóxido dismutasa y catalasa, que
pueden detoxificar el peróxido de hidrógeno y los radicales superóxido, los que son los
productos tóxicos del metabolismo aerobio.
 Las bacterias que dependen exclusivamente de sustancias químicas inorgánicas y
de una fuente de carbono (CO2) para producir energía se denominan autótrofas
(litótrofas), mientras que las bacterias y células animales que requieren fuentes de
carbono orgánico se conocen como heterótrofas (organótrofas).
 El proceso de degradación de sustratos y su conversión en energía utilizable se
conoce como catabolismo.
 El anabolismo es la utilización de la energía (obtenida en el catabolismo), en la
síntesis de componentes celulares.
 Las bacterias utilizan tres rutas metabólicas diferentes para el catabolismo de la
glucosa.
1. Ruta glucolítica o de Embden – Meyerhof – Parnas (EMP): Ocurre de
forma aerobia y/o anaerobia. Requiere un mol de ATP por cada mol de
glucosa. Durante la glicólisis, la energía se produce de dos formas
diferentes: química (fosforilación a nivel de sustrato) y electroquímica.
Produce dos moléculas de ATP, dos moléculas de NADH reducido y dos
moléculas de piruvato.
En ausencia de oxígeno, el principal medio de producción de energía radica
en la fosforilación a nivel de sustrato, donde el ácido pirúvico es convertido
en diversos productos metabólicos finales (fermentación). En levaduras, el
metabolismo fermentativo ocasiona la conversión del piruvato en etanol y
CO2 (fermentación alcohólica no es frecuente en bacterias; es más frecuente
la conversión de ácido pirúvico en ácido láctico en un solo paso).
2. Ciclo del ácido tricarboxílico (ATC): Ocurre en presencia de oxígeno,
donde el ácido pirúvico puede ser oxidado por completo (combustión
controlada) hasta agua y dióxido de carbono. El piruvato sufre de
descarboxilación oxidativa (+CO2), convirtiéndose en acetil-CoA (+NADH).
Permite al organismo generar una mayor cantidad de energía por mol de
glucosa que la glucólisis (el GTP, producido por fosforilación a nivel de
sustrato, genera ATP a partir de la cadena de transporte de electrones.)
Los MO’s anaerobios son menos eficientes que los aerobios para la
producción de energía (la fermentación, en la que no interviene la cadena de
transporte de electrones ni un ciclo completo de ATC, produce solo dos
moléculas de ATP por molécula de glucosa; el metabolismo aerobio puede
generar 19 veces más energía (38 moléculas de ATP por molécula de
glucosa, y mucho menos olorosa)).
El ciclo del ATC constituye un medio por el cual los carbonos procedentes
de los lípidos (en forma de acetil-CoA) pueden desviarse hacia la producción
de energía o la generación de precursores biosintéticos. Asimismo, incluye
diversas etapas en las que se pueden incorporar aminoácidos desaminados.
Funciones del ciclo del ATC:
• Principal mecanismo de generación de ATP.
• Actúa como ruta metabólica final común para la oxidación completa
de aminoácidos, ácidos grasos y carbohidratos.
• Proporciona productos metabólicos intermedios clave (como α-
cetoglutarato, piruvato, oxalacetato) para la síntesis final de aá,
lípidos, purinas y pirimidinas.
Las dos últimas funciones convierten al ciclo del ATC en un ciclo
anfibólico, es decir, un ciclo que puede actuar en las funciones
anabólicas y catabólicas de la célula.
3. Ruta de las pentosas fostato (O Ruta de las hexosas monofosfato): Su
función es proporcionar precursores así como poder reductor en forma de
nucleótido de nicotinamida y adenina fosfato (forma reducida) (NADPH) que
se utilizará en la biosíntesis.
GENÉTICA BACTERIANA
 El genoma bacteriano es TODO el conjunto de genes que tiene la bacteria (tanto en
cromosoma como en elementos genéticos extracromosómicos, si existen).
 ¿Qué son los genes? Secuencias de nucleótidos con una función biológica,
como genes estructurales relacionados con proteínas (cistrones, que son genes
codificadores), los genes del ácido ribonucleico (ARN) y los sitios de reconocimiento
y unión de otras moléculas (promotores y operadores)
 Cada genoma contiene muchos operones, que a su vez están constituidos por
genes. Estos genes pueden, también, ser agrupados en islotes (como los islotes de
patogenicidad).
 Las bacterias suelen tener solo una copia de sus cromosomas (es decir, son
haploides), mientras que los eucariotas suelen tener dos copias distintas de cada
cromosoma (es decir, diploides).
 Al ser haploides, la alteración de un gen bacteriano (mutación) tendrá un efecto más
evidente.
 A diferencia de eucariotas, donde la estructura del cromosoma se mantiene gracias
a las histonas, en bacterias se mantiene por poliaminas como espermina y
espermidina.
 Las bacterias también pueden contener elementos genéticos extracromosómicos
como plásmidos y bacteriófagos (que son virus bacterianos). Estos elementos son
independientes del cromosoma bacteriano y en la mayor parte de los casos se
pueden transmitir de una célula a otra.

TRANSCRIPCIÓN
Para su traducción en proteínas, la información existente en el ADN bacteriano se
transcribe en una molécula de ARNm (ARN mensajero) mediante la ARN-polimerasa
dependiente de ADN.
El proceso comienza cuando el factor sigma reconoce una secuencia específica de
nucleótidos en el ADN (promotor) y se une firmemente a ella. Las secuencias promotoras
se disponen inmediatamente por delante del comienzo de la secuencia de ADN que
realmente codifica una proteína. Los factores sigma se fijan a estos promotores con el
objeto de proporcionar un punto de acoplamiento a la ARN-polimerasa. Así mismo, algunas
bacterias codifican varios factores sigma para permitir la transcripción de un grupo de genes
en condiciones especiales, como shock térmico, inanición, metabolismo especial del
nitrógeno o esporulación.
Tras la unión de la polimerasa a una secuencia adecuada del ADN, se inicia la
síntesis del ARN mediante la adición secuencial de los ribonucleótidos complementarios a
aquella molécula. La ARN-polimerasa se disocia del ADN (un proceso mediado por
“señales” existentes en el interior del ADN) cuando se ha transcrito la totalidad de un gen o
un grupo de ellos (operón). La ARN-polimerasa es inhibida por la rifampicina, un ATB
utilizado a menudo en el tratamiento de la TBC. Igualmente, a partir del ADN se transcribe
el ARNt (ARN de transferencia), el cual se utiliza en la síntesis proteica, y el ARNr (ARN
ribosómico), el cual forma parte de los ribosomas.
Los promotores y operadores controlan la expresión de un gen determinando qué
secuencias se transcriben en el ARNm. Los operones son grupos de uno o más genes
estructurales expresados a partir de un promotor concreto y que terminan en un terminador
de la transcripción. Por tanto, todos los genes que codifican las enzimas implicadas en una
vía concreta se pueden regular de forma coordinada. Los operones con muchos genes
estructurales se llaman policistrónicos. El operón E. coli lac contiene todos los genes
necesarios para el metabolismo de la lactosa y también los mecanismos de control para
detener (en presencia de glucosa) o poner en marcha (en presencia de inductores o
galactosa) estos genes exclusivamente cuando se necesitan. El operón lac incluye una
secuencia represora, otra promotora y genes estructurales para la enzima β-galactosidasa,
para una permeasa y para una acetilasa.

TRADUCCIÓN
Es el proceso por el cual el código genético en forma de ARNm se convierte
(traduce) en una secuencia de aá, el producto proteico. El lenguaje y los signos de
puntuación del código genético para cada aá vienen condicionados por un conjunto de tres
nucleótidos, que se denomina codón. Existen 64 combinaciones de codones distintas, que
codifican los 20 aá, además de los codones de inicio y terminación. Algunos de los aá se
codifican mediante más de un codón. Este fenómeno se denomina degeneración del código
genético y puede actuar para proteger a la célula de los efectos de mutaciones leves del
ADN o el ARNm. Cada molécula de ARNt contiene una secuencia de tres nucleótidos que
es complementaria de una de las secuencias del codón. Esta secuencia de ARNt se conoce
como anticodón, y permite el apareamiento de bases y la unión al codón presente en el
ARNm. En el extremo opuesto del ARNt se encuentra unido el aá que corresponde a cada
pareja específica codón – anticodón.
El proceso de síntesis proteica comienza con la fijación de la subunidad ribosómica
30S y un ARNt iniciador especial de la formil-metionina (fMet) al codón de iniciación
metionina (AUG) para formar el llamado complejo de iniciación. A continuación, la
subunidad ribosómica 50S se fija al complejo para iniciar así la síntesis del ARNm. El
ribosoma contiene dos zonas para la fijación del ARNt, el lugar A (aminoacilo) y el lugar P
(peptidilo), cada uno de los cuales permite el emparejamiento de bases del ARNt fijado y la
secuencia del codón del ARNm. El ARNt correspondiente al segundo codón ocupa el lugar
A. El grupo amino del aá unido al lugar A forma un puente peptídico con el grupo carboxilo
del aá que se encuentra en el lugar P, en una reacción conocida como transpeptidación, y
el ARNt vacío en el lugar P (ARNt no cargado) se separa del ribosoma. A continuación, el
ribosoma avanza exactamente tres nucleótidos en la molécula de ARNm, con lo que se
transfiere el ARNt al nuevo péptido unido al lugar P y coloca el siguiente codón en el lugar
A. Un ARNt cargado se acerca al lugar A, y el proceso comienza de nuevo. La traducción
continúa hasta que el codón nuevo del lugar A corresponde a uno de los codones de
terminación (para el cual no existe ningún ARNt correspondiente). En este momento, la
nueva proteína se libera al citoplasma y el complejo de traducción se desmonta o el
ribosoma se desplaza hasta el siguiente codón de iniciación para comenzar la formación de
una nueva proteína. La capacidad de desplazamiento a lo largo de la molécula de ARNm
para formar una nueva proteína caracteriza al ribosoma 70S de las bacterianas, pero no al
ribosoma 80S de los eucariotas. La restricción eucariótica tiene implicaciones en la síntesis
de proteínas de algunos virus.
El proceso de síntesis de proteínas por el ribosoma 70S constituye un objetivo
importante de la acción de los agentes antimicrobianos. Así, tanto los aminoglucósidos (Ej,
estreptomicina y gentamicina) como las tetraciclinas se unen a la subunidad menor del
ribosoma y provocan una inhibición de la función normal de éste. De manera semejante,
los antibióticos del grupo de los macrólidos (Ej, eritromicina) y lincosamidas (Ej,
clindamicina) actúan uniéndose a la subunidad mayor del ribosoma. Igualmente, los
péptidos formil metionina (Ej, fmet-leu-fen) atraen neutrófilos al sitio de infección.
CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
Las bacterias han desarrollado mecanismos para adaptarse con rapidez y eficiencia
a los cambios y estímulos ambientales, lo que les permite coordinar y regular la expresión
de los genes para las estructuras con múltiples componentes o las enzimas de una o más
vías metabólicas. Por ejemplo, el cambio de temperatura podría indicar la entrada al
hospedador humano e indicar la necesidad de un cambio global del metabolismo y la
regulación al alza de algunos genes importantes para el parasitismo o la virulencia. Muchos
genes bacterianos se controlan a múltiples niveles y por distintos métodos.
Se puede conseguir un cambio coordinado en la expresión de muchos genes, como
se necesita para la esporulación, usando un factor sigma distinto para la ARN polimerasa.
Esto modificaría la especificidad de la ARN polimerasa y permitiría la síntesis del ARNm
para los genes necesarios, al tiempo que evitaría genes innecesarios. Las bacterias pueden
producir más de seis factores sigma distintos para conseguir una regulación global de la
respuesta al estrés, el shock, el ayuno o para coordinar la producción de estructuras
complicadas, como los flagelos.
La coordinación de un gran número de procesos de forma global también se puede
conseguir a través de pequeños activadores moleculares, como el monofosfato cíclico de
adenosina (AMPc). El aumento de las concentraciones de AMPc indica una baja
concentración de glucosa y la necesidad de utilizar vías metabólicas alternativas. De modo
similar, en un proceso denominado quorum sensing (percepción de quórum), cuando hay
un número suficiente de bacterias que producen una molécula pequeña específica, se
desconectan los genes de virulencia y otros. El estímulo para la producción de la biopelícula
en las especies de Pseudomonas es una concentración crítica de N-acil homoserina lactona
(AHL) que se produce cuando existe un número suficiente de bacterias (hay quórum). La
activación de la producción de toxinas y la conducta más virulenta de Staphylococcus
aureus se asocian al aumento de la concentración de péptido cíclico.
Para coordinar la expresión de un grupo más limitado de genes, como los implicados
en un proceso metabólico específico, los genes para las enzimas necesarias se organizan
en un operón. El operón se encuentra bajo el control de una secuencia de ADN promotora
o represora, que puede activar o desactivar la expresión de un gen o un grupo de genes
para coordinar la producción de las enzimas necesarias y permitir a las bacterias reaccionar
frente a los cambios en las concentraciones de nutrientes. Los genes responsables de
algunos mecanismos de la virulencia se organizan en un islote de patogenicidad que está
bajo el control de un solo promotor, lo que permite su expresión exclusivamente en
condiciones apropiadas (para las bacterias). Los muchos componentes de los sistemas de
secreción de tipo III de Escherichia coli, Salmonella o Yersinia se agrupan dentro de un
islote de patogenicidad.
La transcripción también se puede regular mediante el proceso de traducción. A
diferencia de lo que sucede en los eucariotas, en los procariotas la ausencia de una
membrana nuclear permite la unión del ribosoma al ARNm conforme se transcribe a partir
del ADN. La posición y la velocidad de desplazamiento del ribosoma a lo largo del ARNm
pueden modificar la presencia de bucles en el ARNm y la capacidad de la polimerasa de
transcribir el ARNm nuevo. Esto permite controlar la expresión génica tanto a nivel de la
transcripción como de la traducción.
El inicio de la transcripción puede estar sometido a unos mecanismos de control
positivo o negativo. Los genes sometidos a un control negativo se expresan a menos que
una proteína represora los desconecte. Esta proteína impide la expresión del gen al unirse
a una secuencia específica del ADN, el denominado operador, lo que impide que la
polimerasa de ARN inicie la transcripción en el promotor. Por el contrario, los genes cuya
expresión se encuentra sometida a un control positivo tan sólo se transcriben en presencia
de una proteína reguladora activa denominada apoinductor. El apoinductor se une a una
secuencia específica del ADN y colabora con la ARN polimerasa en los pasos iniciales
mediante un mecanismo desconocido.
Los operones pueden ser inducibles o represibles. La introducción de un sustrato
(inductor) en el medio de crecimiento puede inducir un aumento de la expresión por parte
del operón de las enzimas necesarias para el metabolismo de dicho compuesto. La
acumulación de los productos finales (correpresores) de una ruta puede «señalar» la
necesidad de desconectarla o reprimirla mediante una disminución de la síntesis de sus
enzimas.
El operón de la lactosa (lac), encargado de la degradación de este hidrato de
carbono, es un operón inducible que se encuentra sometido a una regulación tanto positiva
como negativa. Normalmente, la bacteria utiliza glucosa y no lactosa. En ausencia de
lactosa, la proteína represora se fija a la secuencia del operador y el operón queda
reprimido, con lo que se impide la función normal de la ARN polimerasa. Sin embargo, la
adición de lactosa invierte esta represión en ausencia de glucosa. La expresión completa
del operón lac también exige la presencia de un mecanismo de control positivo mediado
por proteínas. En Escherichia coli, cuando disminuye la concentración de glucosa en la
célula, aumenta el AMPc para favorecer el consumo de otros azúcares para el metabolismo.
La unión de AMPc a una proteína denominada Proteína Activadora de genes por Catabolito
(PAC) permite la unión a una secuencia específica de ADN presente en el promotor. El
complejo PAC – AMPc favorece la unión de la ARN polimerasa al promotor, con lo que se
traduce en un incremento de la frecuencia de inicio de la transcripción.
El operón del triptófano (operón trp) contiene los genes estructurales necesarios
para la biosíntesis de este aminoácido y se halla sometido a unos mecanismos de control
dobles de la transcripción. Aunque el triptófano es esencial para la síntesis de proteínas, su
presencia en concentraciones excesivas puede resultar tóxica para la célula, por lo que su
síntesis debe estar regulada. A nivel de ADN, el aumento de la concentración intracelular
de triptófano activa la proteína represora para inhibir el proceso de transcripción. Respecto
a la síntesis de proteínas, la traducción rápida de un «péptido de prueba» al comienzo del
ARNm en presencia de triptófano permite la formación de un asa bicatenaria en el ARN, lo
cual pone fin al proceso de transcripción. Este asa se forma también cuando no tiene lugar
la síntesis de proteínas, una situación que tampoco requeriría la síntesis de triptófano.
Ambos mecanismos regulan la síntesis de triptófano a nivel del ARNm en un proceso
denominado atenuación en el que se registra una interrupción prematura de la síntesis de
ARNm.
La replicación de los componentes de los mecanismos de virulencia también se
regula de forma coordinada a partir de un operón. Algunos estímulos sencillos, como la
temperatura, la osmolaridad, el pH, la disponibilidad de nutrientes o la concentración de
algunas moléculas pequeñas específicas, como el hierro o el oxígeno, pueden activar o
desactivar la transcripción de un solo gen o grupo de genes. Los genes que codifican la
capacidad invasiva de Salmonella dentro de un islote de patogenicidad se activan ante una
osmolaridad elevada y una concentración de oxígeno baja, condiciones ambas que se
producen en el tubo digestivo o en una vesícula endosómica en el interior de un macrófago.
Escherichia coli percibe que ha abandonado el intestino del hospedador por el descenso de
la temperatura e inactiva sus genes de adherencia. Unas concentraciones bajas de hierro
pueden activar la expresión de hemolisina en Escherichia coli o la toxina diftérica en
Corynebacterium diphtheriae, posiblemente para destruir las células y conseguir hierro. Ya
se han comentado los mecanismos de quorum sensing para los factores de virulencia de
Staphylococcus aureus y la producción de la biopelícula en las especies de Pseudomonas.
REPLICACIÓN DEL ADN
La replicación del cromosoma bacteriano se desencadena por una cascada de
sucesos relacionados con la velocidad de crecimiento de la célula. La replicación del ADN
bacteriano se inicia en una secuencia específica del cromosoma denominada oriC. Aparte
de otras enzimas, el proceso de replicación exige la participación de una enzima (helicasa)
capaz de desenrollar el ADN y exponerlo, otra enzima (primasa) capaz de sintetizar los
cebadores que inician el proceso y una enzima o enzimas (ADN polimerasas dependientes
de ADN) que únicamente sintetizan una copia del ADN en presencia de una secuencia
cebadora a la que añadir nucleótidos y tan solo trabajan en dirección 5' a 3'.
El ADN nuevo se sintetiza de forma semiconservadora y utilizando como plantillas
ambas cadenas del ADN de la célula progenitora. La síntesis del nuevo ADN tiene lugar en
una horquilla de crecimiento y sigue un curso bidireccional. Mientras una de las cadenas
(cadena adelantada o leading strand) se copia de manera continua en la dirección 5' – 3',
la otra cadena (cadena rezagada o lagging strand) ha de sintetizarse en forma de
numerosas piezas de ADN a partir de cebadores de ARN (fragmentos de Okazaki). A
medida que se expone su estructura, el ADN de la cadena rezagada ha de extenderse en
la dirección 5' – 3'. A continuación, la enzima ADN ligasa se encarga de unir las piezas.
Para mantener el alto grado de precisión que exige el proceso de replicación, las ADN
polimerasas poseen unas «funciones de corrección» (proofreading functions) que permiten
a la enzima confirmar que se ha insertado el nucleótido correcto y corregir así los posibles
errores que pudieran cometerse. Durante la fase logarítmica de crecimiento en un medio
rico, pueden tener lugar numerosos «inicios» del proceso de replicación cromosómica antes
de que tenga lugar la división celular. Este proceso genera una serie de nidos de burbujas
en los cromosomas hijos, cada uno de los cuales contiene su propio par de horquillas de
crecimiento para efectuar la síntesis de una nueva molécula de ADN. La polimerasa se
desplaza a lo largo de la cadena de ADN e incorpora en cada posición el nucleótido
(complementario) adecuado. La replicación finaliza cuando las dos horquillas de replicación
se encuentran a 180 ° desde el origen. El proceso de replicación del ADN impone una
enorme fuerza de torsión sobre la molécula circular de ADN cromosómico, la cual se
contrarresta por la acción de las topoisomerasas (Ej, girasa) que superenrollan el ADN. Las
topoisomerasas son enzimas clave para las bacterias y constituyen el objetivo de los
antibióticos del grupo de las quinolonas.
CRECIMIENTO BACTERIANO
La replicación bacteriana es un proceso coordinado durante el cual se producen dos
células hijas idénticas. Su crecimiento exige la presencia de suficientes metabolitos para
permitir la síntesis de los componentes bacterianos y, especialmente, de los nucleótidos
destinados a la síntesis del ADN. Al igual que pasa con una cuenta atrás en el Kennedy
Space Center, para que se inicie un proceso de replicación debe producirse una cascada
de distintos episodios reguladores (la síntesis de ARN y proteínas clave). Sin embargo, y
una vez iniciada, la síntesis del ADN debe llegar hasta el final, aun en el caso de
desaparición de los nutrientes del medio.
La replicación cromosómica se inicia en la membrana y cada cromosoma hijo se
ancla a una porción diferente de la misma. Los procesos de formación de la membrana
bacteriana, síntesis de peptidoglucano y división celular se llevan a cabo de forma
coordinada. A medida que crece la membrana bacteriana, los cromosomas hijos se
separan. El comienzo de la replicación cromosómica también inicia el proceso de división
celular, la cual se puede visualizar por el comienzo de la formación del tabique que separara
a las dos células hijas. Pueden ponerse en marcha nuevos episodios de iniciación incluso
antes de que haya terminado la replicación cromosómica y la división celular.
El agotamiento de metabolitos (inanición) o la aparición de productos metabólicos
tóxicos (Ej, alcohol) desencadena la producción de alarmonas químicas, las cuales
provocan la interrupción de la síntesis, aunque los procesos degradativos continúan su
curso. La síntesis de ADN prosigue hasta completar la formación de todos los cromosomas
y a pesar del efecto perjudicial que ello pudiera tener sobre la célula. Los ribosomas se
desintegran para formar precursores de desoxirribonucleótidos, el peptidoglucano y las
proteínas se degradan, y la célula se contrae. Puede comenzar la formación del tabique,
aunque es posible que la célula no se divida por lo que morirá un gran número de células.
En ciertas especies, algunas señales de este tipo pueden iniciar un proceso de
esporulación.
DINÁMICA POBLACIONAL
Cuando se añaden bacterias a un medio de cultivo nuevo, antes de empezar a
dividirse ha de transcurrir un cierto tiempo de adaptación al nuevo ambiente. Este intervalo
se conoce como fase de latencia del crecimiento. Durante la llamada fase logarítmica (log)
o exponencial, las bacterias se dividen con un tiempo de duplicación característico de la
cepa y determinado por las condiciones imperantes. El número de bacterias aumenta a
razón de 2n, donde n representa el número de generaciones (duplicación del número de
bacterias). Finalmente, los metabolitos del cultivo se agotan o bien aparece en su seno
alguna sustancia toxica; en ese momento, las bacterias interrumpen su crecimiento y pasan
a la llamada fase estacionaria.
MUTACIÓN, REPARACIÓN Y RECOMBINACIÓN
Es importante que el ADN se replique de forma precisa para que las bacterias
sobrevivan, pero se producen errores y alteraciones accidentales del ADN. Las bacterias
tienen sistemas de reparación del ADN eficientes, pero aún se siguen produciendo
mutaciones y alteraciones en el ADN. La mayor parte de estas mutaciones tienen escaso
efecto sobre las bacterias o resultan negativas, pero algunas mutaciones pueden
proporcionar una ventaja selectiva para la supervivencia de las bacterias cuando se ven
amenazadas por el entorno, el hospedador o el tratamiento.
Mutaciones y sus consecuencias
Una mutación se define como cualquier modificación de la secuencia de bases del
ADN. Un cambio de una sola base puede ocasionar una transición, en la que una purina es
sustituida por otra purina o una pirimidina es reemplazada por otra pirimidina. También
puede aparecer una transversión, en la que una purina es sustituida por una pirimidina o
viceversa. Una mutación silenciosa es una modificación del ADN que no provoca cambios
en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. Este tipo de mutación se debe a
que un aminoácido puede estar codificado en más de un codón. Aunque una mutación de
sentido erróneo (missense) es aquella que comporta la inserción de un aminoácido
diferente en la proteína; sin embargo, cuando el nuevo aminoácido posee unas propiedades
semejantes (Ej, una valina que sustituye a una alanina) puede tratarse de una mutación
conservadora. Una mutación sin sentido (nonsense) es aquella en la que se sustituye un
codón que codifica a un aminoácido por un codón de interrupción (Ej, TAG [timidina-
adenina-guanina]), lo que provoca que el ribosoma pierda el ARNm y finalice
prematuramente la producción de la proteína. Las mutaciones condicionales, como las
mutaciones sensibles a la temperatura, pueden deberse a mutaciones conservadoras que
modifican la estructura o la función de una proteína importante cuando la temperatura es
elevada.
Se pueden observar modificaciones más notables cuando la mutación afecta a un
gran número de bases. Una pequeña deleción o inserción que no ocurra en múltiplos de
tres produce una mutación de desfase de lectura (frameshift mutation) que altera el sistema
de lectura y habitualmente ocasiona la aparición de un «peptido absurdo» y la interrupción
prematura de la proteína. Las mutaciones nulas, que destruyen completamente la función
del gen, aparecen cuando se registra una extensa inserción o deleción o una acusada
reorganización de la estructura cromosómica. La inserción de largas secuencias de ADN
(muchos miles de pares de bases) por recombinación, transposición o técnicas de
ingeniería genética puede producir mutaciones nulas por separación de las partes de un
gen e inactivación del mismo.
En la naturaleza se produce un gran número de mutaciones de forma espontánea
(Ej, debido a errores de la polimerasa); sin embargo, las mutaciones también pueden ser
consecuencia de agentes físicos o químicos. Entre los agentes físicos utilizados para inducir
la aparición de mutaciones en las bacterias figuran los siguientes: el calor, que provoca una
desaminación de los nucleótidos; la luz ultravioleta, que origina la formación de dímeros de
pirimidina, y la radiación ionizante (Ej, rayos X), que produce radicales hidroxilos
hiperreactivos capaces de abrir la estructura anular de una base o bien de generar roturas
monocatenarias o bicatenarias en el ADN. Las sustancias químicas de tipo mutagénico
pueden agruparse en tres clases. Los análogos de nucleótidos producen apareamientos
erróneos y frecuentes errores en la replicación del ADN. Por ejemplo, la incorporación de 5
– bromouracilo en la molécula de ADN en lugar de timidina permite su apareamiento con
guanina en lugar de adenina, de forma que sustituye un par T – A por un par G – C. Los
mutágenos de desfase de lectura, como algunas moléculas policíclicas planas (bromuro de
etidio, derivados de la acridina), se insertan (o intercalan) entre las bases a medida que se
enfrentan una a otra en la doble hélice del ADN. El aumento en el espacio existente entre
los sucesivos pares de bases comporta la adición o supresión de una única base y ocasiona
la aparición de frecuentes errores durante la replicación del ADN. Las sustancias químicas
reactivas frente al ADN actúan directamente sobre este y modifican la estructura química
de la base. Entre estas sustancias químicas destacan el ácido nitroso (HNO2) y los agentes
alquilantes (Ej, nitroso – guanidina y etil – metano – sulfonato), de los que se sabe que
añaden grupos metilo o etilo a los anillos de las bases del ADN. Las bases modificadas
pueden aparearse de forma anormal o bien no aparearse. Esta alteración puede provocar
la eliminación de la base del esqueleto del ADN.
Mecanismos de reparación del ADN
Con el propósito de minimizar los danos al ADN, las células bacterianas han
desarrollado diversos mecanismos de reparación. Estos mecanismos de reparación se
pueden dividir en cinco grupos:
1) La reparación directa del ADN consiste en la eliminación enzimática del daño
(Ej, dímeros de pirimidina y bases alquiladas).
2) La reparación por escisión se basa en la eliminación del segmento de ADN
que contiene las lesiones, seguida de la síntesis de una nueva hebra de
ADN. Existen dos tipos de mecanismos de reparación por escisión:
generalizada y especializada.
3) La reparación posreplicación o por recombinación consiste en la
recuperación de la información que falta mediante procesos de
recombinación genética cuando están dañadas ambas hebras de ADN.
4) La llamada respuesta SOS se caracteriza por la inducción de numerosos
genes (aproximadamente 15) tras la aparición de daño al ADN, o bien por la
interrupción de su replicación.
5) La reparación propensa a error (error-prone repair) es el último recurso con
que cuenta la célula bacteriana antes de morir. Se utiliza para rellenar los
espacios con una secuencia aleatoria cuando no se dispone de una plantilla
de ADN que pueda orientar con precisión el proceso de reparación.
Intercambio génico en los procariotas
Muchas bacterias, especialmente numerosas especies patógenas, utilizan su ADN
de forma promiscua. El intercambio de ADN entre células permite el intercambio de genes
y características entre ellas, lo que ocasiona la aparición de cepas bacterianas nuevas. Este
intercambio puede resultar ventajoso para el receptor, especialmente cuando el ADN
codifica mecanismos de resistencia a los antibióticos. El ADN transferido puede integrarse
en el cromosoma del receptor o bien mantenerse de manera estable en forma de elemento
extracromosómico (plásmido) o como un virus bacteriano (bacteriófago) y se transmite a
las bacterias hijas como una unidad dotada de capacidad autónoma de replicación.
Los plásmidos son pequeños elementos genéticos cuya replicación es
independiente del cromosoma bacteriano. La mayor parte de los plásmidos son moléculas
circulares bicatenarias de ADN con un número variable de pares de bases (de 1.500 a
400.000). Sin embargo, Borrelia burgdorferi, el agente etiológico de la enfermedad de Lyme,
y la bacteria afín Borrelia hermsii presentan una característica peculiar en el grupo de las
eubacterias: la presencia de plásmidos lineales. Al igual que el ADN cromosómico
bacteriano, estos plásmidos se pueden replicar de forma autónoma, por lo que reciben el
nombre de replicones. Algunos plásmidos, como el plásmido F de Escherichia coli, son
episomas, lo que indica que se pueden integrar en el cromosoma del hospedador.
Los plásmidos portan información genética, la cual puede proporcionar una ventaja
selectiva a las bacterias, aunque no constituya una ventaja esencial para la bacteria. Por
ejemplo, los plásmidos pueden conferir un nivel alto de resistencia a antibióticos, codificar
la producción de bacteriocinas, toxinas, determinantes de virulencia y contener otros genes
que otorguen una ventaja respecto a la metabolización de ciertos sustratos en comparación
con otros microorganismos o en el interior del organismo hospedador. El número de copias
de plásmido producidas por una célula es especifico de cada uno de ellos. Este número es
la relación existente entre las copias del plásmido y el número de copias del cromosoma.
Su valor puede ser bajo (hasta de 1 en el caso de los plásmidos grandes) o alto (hasta de
50 en los plásmidos más pequeños).
Los plásmidos de gran tamaño (20 – 120 kb), como el factor F de fertilidad de
Escherichia coli o el factor de transferencia de resistencia (80 kb), a menudo pueden mediar
su propia transferencia de una célula a otra mediante un proceso denominado conjugación
(v. apartado ≪Conjugación≫, más adelante en este capítulo). Estos plásmidos conjugativos
codifican todos los factores necesarios para su propia transferencia. En cambio, otros
plásmidos pueden ser transferidos a las células bacterianas por medio de mecanismos
distintos de la conjugación (Ej, por transformación o por transducción).
Los bacteriófagos son virus bacterianos con un genoma de ADN o de ARN protegido
generalmente por una capa de proteínas. Estos elementos genéticos extracromosómicos
pueden sobrevivir fuera de la célula del hospedador y ser transmitidos de una a otra célula.
Los bacteriófagos infectan a las células bacterianas y se pueden replicar hasta alcanzar un
gran número y condicionar la lisis celular (infección lítica) o, en algunos casos, integrarse
en el genoma del hospedador sin destruirlo (estado lisogénico), como sucede en el caso
del bacteriófago lambda de Escherichia coli. Algunos bacteriófagos lisogénicos contienen
genes para toxinas (Ej, el corinefago beta contiene el gen de la toxina diftérica). El
bacteriófago lambda sigue siendo lisogénico mientras se siga sintetizando proteína
represora, y esto evita que el fago deje de estar integrado para poder replicarse y abandonar
la célula. El daño en el ADN de las células del hospedador por radiación u otro mecanismo
o la incapacidad para producir la proteína represora es una señal de que la célula
hospedadora ya no está sana y no es un buen lugar para «vivir de gorra».
Los transposones (genes «saltarines») son unos elementos genéticos móviles que
pueden transferir ADN de una posición a otra del genoma o entre distintas moléculas de
ADN dentro de una misma célula (Ej, de un plásmido a otro o de un plásmido a un
cromosoma). Los transposones se detectan tanto en los procariotas como en los eucariotas.
Los transposones más simples se denominan secuencias de inserción y su longitud
comprende de 150 a 1.500 pares de bases con repeticiones invertidas de 15 a 40 pares de
bases y la información genética mínima necesaria para su propia transferencia (es decir, el
gen que codifica la transposasa). Los transposones complejos contienen otros genes, como
genes que proporcionan resistencia frente a antibióticos. En ocasiones, los transposones
se introducen en el interior de los genes y los inactivan. Si la inserción e inactivación tienen
lugar en un gen encargado de codificar una proteína esencial, la célula muere.
Algunas bacterias patógenas utilizan un mecanismo semejante para coordinar la
expresión de un sistema de factores de virulencia. Los genes de actividad pueden
agruparse en un islote de virulencia o patogenicidad rodeado por unos elementos móviles
semejantes a los transposones que les permiten moverse tanto en el interior del cromosoma
como hacia otras bacterias. Cualquier unidad genética puede reaccionar ante la presencia
de un estímulo ambiental (Ej, pH, calor o contacto con la superficie de la célula del
hospedador) como mecanismo de coordinación de la expresión de un proceso complejo.
Por ejemplo, el islote SPI – 1 de Salmonella codifica 25 genes para un dispositivo de
secreción de tipo III que permiten la entrada de esta bacteria en células no fagocíticas.
Mecanismos de transferencia genética entre células
El intercambio de material genético entre las células bacterianas puede tener lugar
a través de uno de los tres mecanismos siguientes: 1) conjugación, que consiste en un
apareamiento o intercambio cuasisexual de información genética entre una bacteria
(donante) y otra bacteria (receptora); 2) transformación, que es una captación activa y la
incorporación de ADN exógeno, o 3) transducción, la cual se caracteriza por la transferencia
de información genética de una bacteria a otra por medio de un bacteriófago. En el interior
de la célula, el transposón puede «saltar» entre distintas moléculas de ADN (Ej, de plásmido
a plásmido o de plásmido a cromosoma).
Transformación
La transformación es el proceso mediante el cual las bacterias captan fragmentos
de ADN desnudo y los incorporan a sus genomas. La transformación fue el primer
mecanismo de transferencia genética que se descubrió en las bacterias. En 1928, Griffith
observo que la virulencia del neumococo se relacionaba con la presencia de una capsula
de polisacárido y que los extractos de bacterias encapsuladas productoras de colonias lisas
podían transmitir este rasgo a las bacterias no encapsuladas, las cuales presentan
generalmente una morfología rugosa. Alrededor de 15 años después, los estudios de
Griffith permitieron que Avery, McLeod y McCarty identificaran el ADN como el principio
clave del mecanismo de transformación.
Las bacterias grampositivas y gramnegativas son capaces de captar y conservar de
forma estable ADN exógeno. Ciertas especies presentan una capacidad natural de
captación de ADN exógeno (por lo que se definen como «competentes»), como
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y los géneros Bacillus y Neisseria. La
competencia aparece al final de la fase logarítmica de crecimiento. Escherichia coli y la
mayoría de las bacterias carecen de la capacidad natural para captar ADN, y ha de inducirse
la competencia o utilizarse métodos químicos o la electroporación (empleo de pulsos de
alto voltaje) para facilitar la captación de ADN plasmídico y de otro tipo.
Conjugación
La conjugación produce una transferencia unidireccional de ADN desde un célula
donante (o macho) hasta una célula receptora (o hembra) a través del llamado pilus sexual.
La conjugación se da en la mayoría de las eubacterias, si no en todas, por lo general entre
miembros de la misma especie o de especies relacionadas, pero se ha demostrado también
entre procariotas y células de plantas, animales y hongos. Muchos de estos plásmidos
conjugativos de gran tamaño especifican colicinas o resistencia antibiótica.
El tipo de acoplamiento (sexo) de la célula depende de la presencia (célula macho)
o ausencia (célula hembra) de un plásmido conjugativo, como el plásmido F de Escherichia
coli. El plásmido F se define como conjugativo porque contiene todos los genes necesarios
para su propia transferencia, como la capacidad de fabricar pili sexuales e iniciar la síntesis
de ADN en el llamado «origen de transferencia» (oriT). El pelo sexual es un tipo de
secreción de tipo IV especializado. Al transferirse el plásmido F, las células receptoras se
convierten en células macho F+. Cuando un fragmento de ADN cromosómico se ha
incorporado a la secuencia del plásmido, se designa como «plásmido F prima» (F'). Cuando
este plásmido se transfiere al interior de la célula receptora, transporta el fragmento y lo
convierte en un F' macho. Cuando la secuencia del plásmido se integra en el interior del
cromosoma bacteriano, la célula se designa como «célula Hfr» (alta frecuencia de
recombinación).
El ADN transferido por conjugación no es una molécula bicatenaria helicoidal, sino
una molécula monocatenaria. La movilización comienza cuando una proteína codificada por
un plásmido introduce una rotura monocatenaria en un punto especifico del oriT. La muesca
así formada inicia un replicación por circulo rodante y la cadena lineal desplazada se dirige
hacia la célula receptora. A continuación, el ADN monocatenario adopta nuevamente una
conformación circular y sintetiza su cadena complementaria. La conjugación comporta la
transferencia parcial de la secuencia plasmídica y de un fragmento del ADN cromosómico
bacteriano. Como consecuencia de la fragilidad de la conexión formada entre las dos
células acopladas, la transferencia se suele interrumpir antes de finalizar el proceso, de
modo que únicamente se transfieren las secuencias cromosómicas cercanas al plásmido F
integrado. La interrupción artificial de un acoplamiento entre un Hfr y una pareja F− ha
resultado útil para cartografiar el ADN cromosómico de Escherichia coli. Este tipo de mapas
muestra la posición de cada gen en minutos (en relación con los 100 minutos que requiere
la transferencia completa a 37 °C) según su momento de entrada a una célula receptora
respecto a un origen fijo.
Transducción
La transferencia genética por transducción esta mediada por virus bacterianos
(bacteriófagos) que captan fragmentos de ADN y los almacenan en el interior de partículas
de bacteriófago. El ADN suministrado a las células infectadas se incorpora luego al genoma
bacteriano. La transducción puede clasificarse como especializada si los fagos en cuestión
transfieren genes específicos (habitualmente los adyacentes a sus lugares de integración
en el genoma) o generalizada si la incorporación de las secuencias es aleatoria debido al
almacenamiento accidental del ADN de la célula hospedadora en el interior de la cápside
del fago. Por ejemplo, una nucleada del fago P1 degrada el ADN cromosómico y algunos
fragmentos de ADN son empaquetados en partículas fágicas. El ADN encapsulado, en lugar
del ADN fágico, es inyectado en el interior de una nueva célula hospedadora, en la que
puede recombinarse con el ADN homólogo de aquella. Las partículas implicadas en la
transducción generalizada son muy valiosas para realizar el cartografiado genético de los
cromosomas bacterianos. Cuanto más próximos se dispongan dos genes en el cromosoma
bacteriano, mayor será la probabilidad de un proceso de cotransducción en el mismo
fragmento de ADN.
Recombinación
La incorporación del ADN extracromosómico (extraño) en el cromosoma tiene lugar
mediante un proceso de recombinación. Existen dos tipos de recombinación: homóloga y
no homóloga. La recombinación homóloga (legítima) es la que tiene lugar entre secuencias
de ADN estrechamente relacionadas y habitualmente sustituye una secuencia por otra. El
proceso requiere la presencia de un conjunto de enzimas producidas por los llamados
genes rec (en Escherichia coli). La recombinación no homóloga (ilegítima) es la que tiene
lugar entre secuencias distintas de ADN y, por regla general, produce inserciones,
deleciones o ambas. Habitualmente este proceso precisa de la intervención de enzimas de
recombinación especializadas (algunas veces, incluso específicas para un sitio
determinado), como las producidas por muchos transposones y bacteriófagos lisogénicos.
Generación de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a vancomicina mediante
diversas manipulaciones genéticas
Hasta hace poco tiempo, la vancomicina ha constituido el último recurso frente a las
cepas de Staphylococcus aureus resistentes a los β – lactámicos (antibióticos relacionados
con la penicilina), es decir, Staphylococcus aureus resistente a meticilina [SARM]).
Staphylococcus aureus adquirió el gen de resistencia a vancomicina en el transcurso de
una infección mixta por Enterococcus faecalis. El gen de resistencia a este antibiótico se
hallaba en un transposón (Tn1546) localizado en un plásmido conjugativo de
multirresistencia. Es probable que la transferencia del plásmido tuviera lugar mediante
conjugación entre Enterococcus faecalis y Staphylococcus aureus. Otra posibilidad sería
que este último adquiriera el ADN por transducción tras la lisis de Enterococcus faecalis y
sufriese una transformación como consecuencia de la introducción de este nuevo ADN. A
continuación, el transposón habría «saltado» desde el plásmido de Enterococcus faecalis
para recombinarse e integrarse en el plásmido de multirresistencia de Staphylococcus
aureus, y se habría degradado el ADN de Enterococcus faecalis. El plásmido de
Staphylococcus aureus así creado contiene genes de resistencia a β – lactámicos,
vancomicina, trimetoprima y gentamicina/kanamicina/tobramicina y a desinfectantes de
amonio cuaternario y es capaz de transferirse a otras cepas de esta especie mediante
procesos de conjugación.
Ingeniería genética
La ingeniería genética, conocida también como tecnología del ADN recombinante,
emplea técnicas y métodos desarrollados por especialistas en genética bacteriana con el
objeto de purificar, amplificar, modificar y expresar secuencias genéticas específicas. La
utilización de la ingeniería genética y la «clonación» ha revolucionado tanto la biología como
la medicina. Los componentes básicos con que cuenta la ingeniería genética son los
siguientes: 1) los vectores de clonación y expresión, que pueden utilizarse para introducir
secuencias de ADN en el interior de bacterias receptivas y amplificar la secuencia deseada;
2) la secuencia de ADN que se desea amplificar y expresar; 3) diversas enzimas, como las
enzimas de restricción, que se usan para degradar de forma reproducible la molécula del
ADN en unas secuencias determinadas, y 4) la ADN ligasa, la enzima que une los
fragmentos al vector de clonación.
Los vectores de clonación y expresión deben permitir que el ADN exógeno se inserte
en su interior, pero conservando su capacidad de replicación normal en la célula
hospedadora bacteriana o eucariota. En la actualidad se utilizan muchos tipos de vectores.
Los vectores de tipo plasmídico, como pUC, pBR322 y pGEM se ocupan de fragmentos de
ADN de hasta 20 kb. Los bacteriófagos, como lambda, se emplean para fragmentos
mayores de ADN (de hasta 25 kb), y los vectores cósmidos han combinado algunas de las
ventajas de los plásmidos y los fagos para transportar fragmentos de ADN de hasta 45 kb.
La mayoría de los vectores de clonación han sido sometidos a técnicas de ingeniería
genética para: creación de un sitio de inserción del ADN exógeno; un medio de selección
de las bacterias que han incorporado plásmidos (Ej, resistencia a los antibióticos) y un
medio de selección de las que han incorporado esos plásmidos con ADN insertado. Los
vectores de expresión poseen secuencias de ADN que facilitan su replicación en las células
bacterianas y eucariotas, así como la transcripción del gen en ARNm.
El ADN que se desea clonar se obtiene mediante la purificación del ADN
cromosómico de células, virus u otros plásmidos o bien por amplificación selectiva de
secuencias de ADN a través de una técnica conocida como reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Tanto el vector como el ADN exógeno son atacados por enzimas de
restricción. Las enzimas de restricción reconocen una secuencia palindrómica específica y
realizan un corte significativo (que produce la aparición de extremos adherentes) o un corte
romo (que produce unas terminaciones romas). La mayoría de los vectores de clonación
presentan una secuencia que reconoce numerosas enzimas de restricción, el denominado
lugar de clonación múltiple. La unión del vector a los fragmentos de ADN genera una
molécula capaz de replicar la secuencia insertada y que recibe el nombre de ADN
recombinante. El número total de vectores recombinantes obtenidos durante la clonación
de todos los fragmentos obtenidos en la restricción del ADN cromosómico se conoce como
biblioteca genómica, puesto que debe contener al menos un representante de cada gen.
Un método alternativo de clonación del gen de una proteína es utilizar una enzima retroviral
denominada transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN) para convertir el
ARNm de la célula en ADN para producir un ADN complementario (ADNc). Una biblioteca
de ADNc engloba todos los genes expresados como ARNm en una célula determinada.
A continuación, el ADN recombinante se introduce en una célula hospedadora
bacteriana, habitualmente Escherichia coli, y se seleccionan las bacterias que contienen el
plásmido por su resistencia antibiótica (Ej, resistencia a ampicilina). Después se puede
realizar un cribado de la biblioteca con el fin de identificar un clon de E. coli que posea el
fragmento de ADN deseado. Para identificar las bacterias que contienen el ADN
recombinante apropiado pueden utilizarse diversas técnicas. El lugar de clonación múltiple
utilizado para insertar el ADN exógeno con frecuencia forma parte del gen lacZ del operón
lac. La inserción del ADN exógeno en el gen lacZ conlleva su inactivación (actúa casi del
mismo modo que un transposón) y evita que la célula receptora lleve a cabo la síntesis de
β-galactosidasa dirigida por un plásmido, lo que da lugar a la formación de colonias
bacterianas blancas en lugar de las azules que aparecen si se produce esta enzima que es
capaz de degradar un cromóforo adecuado.
La ingeniería genética se ha utilizado también para aislar y expresar distintos genes
con el propósito de obtener proteínas útiles en bacterias, levaduras o, incluso, en células
de insecto (Ej, insulina, interferón, hormonas del crecimiento e interleucina). De modo
similar, se pueden preparar grandes cantidades de un inmunógeno puro destinado a una
vacuna sin necesidad de emplear los microorganismos patógenos intactos.
La vacuna contra el virus de la hepatitis B constituye el primer empleo con éxito de
la tecnología de ADN para fabricar una vacuna aprobada para su empleo en humanos por
la Food and Drug Administration de EE. UU. El antígeno de superficie de la hepatitis B es
producido por la levadura Saccharomyces cerevisiae. En el futuro, puede que baste con
inyectar un ADN plasmídico capaz de expresar el inmunógeno deseado (vacuna de ADN)
a un individuo para conseguir que las células del hospedador expresen este inmunógeno y
desencadenen la respuesta inmunitaria. La tecnología del ADN recombinante resulta
también esencial en el diagnóstico de laboratorio, las técnicas forenses, la agricultura y
muchas otras disciplinas.

Plásmidos. El plásmido pBR322 es uno de los plásmidos


que se utilizan en la clonación del ADN. Este plásmido
codifica la resistencia a ampicilina (Amp) y a tetraciclina
(Tet), así como a un origen de replicación (ori). El locus de
clonación múltiple del plásmido pGEM-5Zf(+/−)
proporciona diferentes sitios de restricción enzimática
para la inserción del ADN en la secuencia del gen de la b-
galactosidasa (lacZ). Esta secuencia insertada se
encuentra flanqueada por promotores de bacteriófago
que permiten la expresión direccional del ARN mensajero
de la secuencia clonada.
Enzimas de restricción utilizadas frecuentemente en biología molecular

SITIO DE
MICROORGANISMO ENZIMA
RECONOCIMIENTO
Acinetobacter
Acc I
calcoaceticus

Bacillus amyloliquefaciens
Bam HI
H

Escherichia coli RY13 Eco RI

Haemophilus influenzae Rd Hind III

H. influenzae serotipo c,
Hinc II
1160

Providencia stuartii 164 Pst I

Serratia marcescens Sma I

Staphylococcus aureus 3A Sau 3AI

Xanthomonas
Xma I
malvacearum