UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE TECÁMAC

Químico -Biológicas

Práctica 4: Extracción de ADN plasmídico.

Castro Pérez Karen Jocelyne
Cruz Cruz David
Hernández González Adriana Aurora
Pérez Ramírez Damaris Sarahi
Ramírez Contla Dulce María

Materia:
Biología molecular

Profesor:
Cristian Álvarez

Grupo: 10IBT3

SEPTIEMBRE - DICIEMBRE 2018

29 de noviembre 2018
Objetivos:
Extraer y purificar DNA plasmático de la bacteria Staphylococcus aureus mediante
lisis alcalina.

Introducción:
Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular capaces de replicarse de
forma autónoma, independientemente del cromosoma. Son muy comunes en
bacterias y algunos de ellos, los más pequeños, existen en las células bacterianas
en un número elevado (hasta 100 copias por célula). Los plásmidos son una
herramienta fundamental en Biología Molecular e Ingeniería Genética ya que se
pueden usar como “vectores” para introducir en ellos cualquier fragmento de ADN
de interés y de así amplificarlo de forma natural dentro de la bacteria en la que el
plásmido se replica (es lo que se llama “clonar” un fragmento de DNA).
Esta técnica consiste en someter la mezcla de moléculas de ADN embebidas en un
gel de agarosa a un campo eléctrico. Las moléculas de ADN son atraídas al polo
positivo debido a la carga neta negativa de ambas cadenas consecuencia de sus
grupos fosfato. Las moléculas más pequeñas migran más rápido que las grandes al
verse menos “frenadas” por el gel de agarosa en su desplazamiento. Cuando los
fragmentos se han separado, el gel se sumerge en una solución que contiene
bromuro de etidio y luego se ilumina con luz UV. El bromuro de etidio (EtBr) es una
molécula plana con afinidad por el ADN que se intercala entre las pares de bases y
que tiene la particularidad de que fluoresce cuando está unido a él. Al iluminar el gel
con luz UV se ven bandas de fluorescencia que corresponden a moléculas de ADN.

Metodología:
Resultados/Análisis:
Se extrajo ADN plasmídico y ADN cromosómico-provenientes de la bacteria
Staphylococcus aureus siguiendo el protocolo correspondiente para su extracción,
el método que se utilizó para extraer el plásmido fue lisis alcalina, la cual se basa
en la desnaturalización y precipitación selectiva de ADN cromosómico en medios
de NaOH y SDS, la purificación del ADN plasmídico se complementa con etanol en
las ilustraciones 3 y 4 se muestra la recolección del ADN plasmídico de interés y
cromosómico.

Ilustración 2 ADN plasmático Ilustración 1 ADN cromosómico

De igual forma se corrió en la cámara de

electroforesis un gel de agarosa con la muestra del
ARN extraído del hígado de pollo y el ADN
plasmídico de la bacteria Staphylococcus aureus
sin embargo al utilizar la solución de buffer de
corrimiento esta se encontraba contaminada la
cual tuvo un afecto negativo en los resultados, las
muestras se quedaron estáticas al igual que la
muestra fluorescente extraída de una bacteria
proveniente de Manta birostris como se logra
observar en el tubo falcón, ilustración 5.

Ilustración 3 Gel de agarosa

Conclusiones:
Aparentemente el ADN fue extraído con éxito, sin embargo, no se pudo corroborar
su presencia debido que, al momento de correr la electroforesis, como se menciona
en los resultados, los buffers con los que fue realizado y corrido el gel se
encontraban contaminados, razón por la cual no fue posible visualizar ningún tipo
de DNA, escalera molecular u proteína.

Cuestionario:
1. Menciona tres aplicaciones en biología molecular para el reactivo Nonident-
P40: ruptura de membrana celular, rompe enlaces lípido-proteína, no
desnaturaliza proteínas (Johnson, 2013)
2. Menciona tres aplicaciones en biología molecular para el Tween20: Estabiliza
las taq polimerasa, evita la formación de estructuras secundarias, agente de
lavado (Johnson, 2013)
3. Explica la técnica de transformación bacteriana y menciona la aplicación o
importancia de la misma

Las transformación tienen muchas aplicaciones, como la producción de

proteínas, la producción de los mismos plásmidos, la producción de bacterias
que consumen petróleo, entre otros-
4. Describe porque los tratamientos con:
NaOH: permite el rompimiento de la célula procariota
SDS: Actúa sobre los enlaces lipídicos permitiendo la disponibilidad de DNA
Acetato potásico: Mantener constante el pH
Etanol: Precipitación del DNA
RNAsa: cataliza la hidrolisis del RNA

Referencias
Johnson, M. (18 de Enero de 2013). Detergentes: Triton X-100, Tween-20, y más. Obtenido de
Labome: http://www.labome.es/method/Detergents-Triton-X-100-Tween-20-and-
More.html