MÉTODO DE ESTUDIO DIRECTO

Un estudio directo es aquel estudio microscópico el cual necesitara una tinción un

colorante o preparación única debido a que su coloración natural muchas veces impedirá
su estudio correctamente por lo cual para obtener unas imágenes buenas la muestra deberá
prepararse los métodos de estudio directo son los más sencillos para preparar muestras
para el estudio microscópico para poder preparar muestras biológicas se debe considerar
lo siguiente:

 Proporcionar condiciones para la estabilidad de las muestras y protección para el

decaimiento, degradación, corrosión o contaminación dentro de la escala de tiempo
que la muestra será estudiada
 Ajustar la muestra a los requisitos necesarios para el estudio y los requisitos que el
microscopio requiera ajustando las condiciones de contraste y resolución para la
obtención de buenas imágenes de estudio

El estudio directo de las muestras puede estudiar:

- Muestras vivas o muertas

- Preservadas
- Enteras o secciones
- Teñidas o sin teñir
- Hidratadas o deshidratadas

Los estudios de muestras se realizarán en preparaciones en fresco para muestras vivas y

preparaciones teñidas para muestras muertas

Preparaciones en fresco
Las preparaciones en fresco es la forma más rápida de preparar una muestra y nos permite
observar la movilidad, tamaño, forma de agrupación de los microorganismos en su estado
natural, además de la formación de gránulos refráctales, esporas y cloroplastos en células
vivas. Aunque es un estudio rápido tiene sus desventajas muchas veces la observación
resulta difícil por la escasa diferencia entre los índices de refracción del medio y de los
microorganismo, no existe un contraste optimo y debido a que las muestras están vivas el
movimiento constante del fluido y de las mismas muestras dificulta la observación.

Para la preparación de una muestra en fresco para ser observada al instante en microscopía
existen la siguiente técnica se la realiza:

- Gota pendiente o suspendida para ser aplicada en la muestra orgánica

- Se pueden adicionar colorantes diluidos, cristal violeta o rojo neutro
- Se colocara el cubreobjetos
- Para la observación se cambiara por fases de contraste, campo oscuro y la
iluminación las cuales influirá en las imágenes apreciadas de la muestra.
La importancia de las preparaciones en fresco es que en la actualidad han servido de gran
ayuda para las pruebas y análisis sanguíneos ya que nos permiten un recuento de sus
diversos componentes celulares sanguíneos y así poder descartar cualquier anormalidad
en la sangre. A la vez el estudio en fresco nos permite hacer un reconocimiento del ADN
de cada individuo con un simple “raspado de células bucales”,

Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Por

ejemplo, para la búsqueda de Trichomonas vaginalis en secreciones vaginales. Este
protozoo de gran movilidad causa inflamación de la vagina y la uretra. Si en la
preparación se observan células en forma de huso que se mueven mediante contracciones
o sacudidas cruzando el campo, probablemente se tratará de T. vaginalis, pudiéndose
efectuar el diagnóstico. Sin embargo, el inconveniente de la observación en fresco es que
no permite aumentar el contraste de la preparación. Por tanto, su uso, con un microscopio
óptico de campo claro, está bastante limitado. Normalmente, para observar
microorganismos vivos se utiliza alguno de los otros microscopios ópticos que hemos
mencionado anteriormente.

Inmersión en aceite
Normalmente solo son utilizados cuando se requiere un alto grado de resolución. Los
objetivos con gran poder de aumento tienen longitudes focales cortas, facilitando el uso
de aceite. El aceite se aplica sobre la muestra (microscopios convencionales), depositado
en un recinto sobreelevado, que sirve para sumergir el objetivo en aceite (en los
microscopios invertidos el aceite se aplica al objetivo).

Este objetivo es indispensable para el examen de frotis teñidos de bacterias. La lente

visible del extremo es mucho más corta que la de los objetivos secos. Este objetivo está
marcado “oil inmer” o “homoginmer” que significa inmersión homogénea. También
está marcado “1/12” (1/12 de pulgada, 1.9 mm, 1.8 mm) y con 97X ó 100X. Las marcas
10X, 45X y 97X con que suelen estar marcados los objetivos del microscopio
corresponden a la potencia amplificadora, y las letras “N.A.”, a la apertura numérica

Tinciones negativas (Tinta china)

No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes ni se lleva
a cabo ninguna reacción entre estructuras celulares y los colorantes. En este caso el frotis
se hace con una gota de una solución de nigrosina o tinta china, ambos son productos
particulados, insolubles, que formarán una película opaca a la luz. En este tipo de tinción
se prescinde de la fijación por calor, se deja secar la preparación y se observan los
microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro. Se emplea para ver la cápsula de S.
pneumoniae y Cryptococcus neoformans en LCR (líquido cefalorraquídeo).

MÉTODO DE TINCIÓN DIFERENCIAL

Las tinciones diferenciales son aquellas tinciones que se usan para diferenciar de manera
más explícita los microorganismos, aquí se visualiza más de un color porque se utiliza
más de un colorante, el colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células
bacterianas o entre partes de una misma célula.

Este tipo de tinción consiste en la aplicación de dos colorantes que contrastan en su

intensidad o color y un paso intermedio que provoca una respuesta diferente entre
microorganismos distintos o entre determinadas células dentro de una población. La
diferenciación puede ser provocada por un agente químico o físico, permitiendo observar
dos tipos de respuestas diferentes a la tinción en una misma muestra.

Existen algunas tinciones diferenciales entre las cuales tenemos: tinción de Gram, de
hematoxilina férrica, matenamina de plata, de azul de toluidina O, tricómica, de Wright
Giemsa.

Tinción Gram
Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la
desarrolló en 1844, mientras examinaba tejido pulmonar de enfermos fallecidos por
neumonía donde observó que la bacteria Streptococcus pneumoniae, presente en los
pulmones, retenía el colorante conocido como marrón Bismark (sustituido posteriormente
por el cristal violeta), mientras que el tejido pulmonar no era capaz de retener el colorante.

Esta es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera

prueba a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio.
Proporciona una información esencial, además de sobre la forma, tamaño y agrupación
celular, como es el tipo y composición de la pared que presentan las bacterias.

Debido a que en este tipo de tinción su reacción es diferente, las bacterias pueden dividirse
en dos grupos, gram positivas que se tiñen de color violeta y las bacterias gram negativas
de color rosa. Los términos positivo y negativo no hacen referencia a la carga eléctrica,
sino a los grupos morfológicos distintos de la bacteria.

Descripta en forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con

calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solución Yodada
durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol
etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 – 2 min.
Lavar y secar.

Limitaciones de tinción gram

1. Ciertas bacterias no tienen pared, como por ejemplo las Chlamidias, y no se podrán
identificar, al igual que los virus.

2. Algunos microorganismos no se colorean, entre ellos Legionella pneumophila,

Treponema pallidum, Leptospira y Bartonella.
3. Otra limitación es que la coloración de Gram se puede perder en tejidos
descalcificados o tiempo prolongado en formol, lo cual puede dar falsos negativos

4. Por último, si existe algún antecedente de uso de antibióticos la tinción Gram podría
no teñir, debido a que éstos alteran la pared de los microorganismos.

Algunos microorganismos conservan una tinción principal incluso después de haber sido
sometidos u otros métodos de tinción como mezclas de ácidos o alcoholes, uno de los
métodos más antiguos es Ziehl-Neelsen. Existen otras tinciones que se detallan a
continuación junto con la mencionada anteriormente.

Tinción Ziehl-Neelsen: Se utiliza para teñir micobacterias y otros microorganismos

acidorresistentes, se tiñen con carbofucsina básica y resisten a la decoloración con
soluciones de ácido-alcohol. se realiza contratinción con fondo de azul de metileno. Los
microorganismos aparecen de color rojo sobre un fondo azul claro.

Tinción de Kinyoun: Es un método en “frío” a diferencia de Ziehl-Neelsen, pero utiliza

su mismo principio.
Tinción Auramina-Rodamina: Se basa en el mismo principio de otras tinciones
acidorresistentes, pero con la diferencia que se utilizan colorantes fluorescentes
(auramina y rodamina) como tinción principal, y el permanganato potásico actúa como
contratinción e inactiva los colorantes de fluorocromo no unidos, como resultado los
microorganismos se tiñen de verde amarillento y fondo negro.

Tinción acidorresistente modificada: Mientras las micobacterias son muy

acidorresistentes, otros microorganismos se tiñen más débilmente (p.ej. Nocardia,
Rhodococcus, isospora, etc). a estos microorganismos se denominan parcialmente
acidorresistentes.