1

PROCESAMIENTO DE CLARA DE HUEVO

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA

Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional de EE.UU. No.
61/983,003, presentada el 23 de abril de 2014, el contenido de la cual se incorpora
aquí como referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES
Las aves transgénicas (por ejemplo, pollos, codornices o pavos
transgénicos) son un sistema de expresión deseable para la obtención de
proteínas recombinantes exógenas para su uso en farmacéutica u otras
aplicaciones comerciales que requieren grandes cantidades de suministro de
proteína. Una gallina puede poner hasta 330 huevos por año, cada uno
conteniendo 6.5 gramos de proteína. Aproximadamente 3.5 gramos de la proteína
total es de clara de huevo, de los cuales el 90% se explica por siete proteínas
diferentes; la ovoalbúmina por sí sola representa 2 gramos de la proteína de clara
de huevo (aproximadamente 50% de la proteína de clara de huevo). En la
actualidad, el producto del gen exógeno promedio derivado de la expresión
específica del oviducto de un transgén y recuperado de la clara de huevo se sabe
que es aproximadamente 5-10 mg por huevo. Las ventajas de la producción de
proteína exógena en huevos de gallina incluyen tiempos de generación cortos y
tasas prolíficas de reproducción a través de inseminación artificial. Varias
proteínas se han expresado en huevos de pollos transgénicos. Véase, por
ejemplo, la patente de EE.UU. No. 6,730,822 y la Publicación de EE.UU. No.
2006/0015960.
Muchas proteínas terapéuticas exógenas (por ejemplo, proteínas humanas
recombinantes tales como citoquinas (por ejemplo, eritropoyetina, factor
estimulante de colonias de granulocitos (GC-SF, por sus sigla en inglés),
interferones, y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-
CSF, por su sigla en inglés)), anticuerpos, y varias enzimas lisosomales humanas)
son de interés para la industria farmacéutica. Las proteínas terapéuticas se
pueden obtener fácilmente en cantidades significativas de, por ejemplo, la clara de
huevo de pollos transgénicos. Los métodos tradicionales para el aislamiento de
proteínas exógenas de la clara de huevo, sin embargo, a menudo se basan en el
uso de procedimientos de inmunoafinidad u otros procedimientos sólo adecuados
para la producción a pequeña escala (por ejemplo, involucrando volumen de clara
de huevo total de 5L como máximo). Para una producción de proteínas a gran
escala, tal procedimiento no es práctico basado en costos, mano de obra y tiempo.
 2

RESUMEN
Esta descripción se basa en el descubrimiento inesperado de que la adición
de una pequeña cantidad de un tampón ácido (por ejemplo, en una sola inyección
en bolo) a una piscina de clara de huevo (por ejemplo, obtenida a partir de huevos
puestos por ave transgénica tales como pollos, codornices y pavos) de escala
industrial (por ejemplo, que tiene un volumen de al menos 10 litros) se puede
preparar la clara de huevo para el aislamiento cromatográfico a granel de
proteínas recombinantes tales como proteínas terapéuticas humanas de la clara
de huevo sin la necesidad de diluir la clara de huevo. Tal método puede reducir
significativamente la cantidad de materiales de clara de huevo sujetos a los
procesos corriente abajo de aislamiento/purificación (por ejemplo, la cantidad de
las columnas utilizadas en el aislamiento cromatográfico), lo que reduce
significativamente los costos, mano de obra y tiempo de aislamiento de proteínas
recombinantes a partir de la clara de huevo. En consecuencia, los métodos
descritos en la presente divulgación pueden mejorar en gran medida la eficiencia
de la preparación de clara de huevo para una gran escala, industrial de la
producción de proteína terapéutica.
En un aspecto, la presente divulgación incluye un método de preparación
de clara de huevo para procesamiento cromatográfico a granel que incluye las
etapas de: (1) adicionar un tampón ácido que comprende un agente ácido a una
piscina de clara de huevo, siendo el tampón ácido de aproximadamente 0.5% en
peso a aproximadamente 5% en peso por kilogramo de clara de huevo; y (2)
mezclar el tampón ácido y la clara de huevo para formar una clara de huevo
mezclada que tiene un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5.
En otro aspecto, esta divulgación presenta un método de aislamiento de
una proteína recombinante a partir de clara de huevo que incluye las etapas de:
(1) proporcionar una piscina de clara de huevo que contiene una proteína
recombinante, la piscina teniendo un volumen de al menos aproximadamente 10
litros; (2) ajustar el pH de la clara de huevo a de aproximadamente 5 a
aproximadamente 6.5, en donde la conductividad de la clara de huevo de pH
ajustado es de aproximadamente 8 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm; (3)
filtrar la clara de huevo para formar una solución (es decir, una solución clara); y
(4) aislar la proteína recombinante en la clara de huevo por cromatografía en
columna.
En todavía otro aspecto, esta divulgación presenta un método de filtración
de clara de huevo acidificada que incluye las etapas de: (1) hacer pasar un
tampón de pre-tratamiento que tiene una conductividad de entre aproximadamente
 3

8 mS/cm y aproximadamente 20 mS/cm a través de un filtro; y (2) hacer pasar

clara de huevo que tiene un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5 a
través del filtro para obtener una clara de huevo filtrada.
Las realizaciones pueden incluir una o más de las siguientes
características.
El agente ácido puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en
ácido acético, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido
fluorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido cítrico, ácido bórico, ácido
tartárico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido oxálico, ácido úrico y ácido barbitúrico.
El tampón ácido puede incluir además acetato de sodio de
aproximadamente 5M a aproximadamente 6M (por ejemplo, aproximadamente 5.7
M).
El tampón ácido puede ser de aproximadamente 0.5% en peso a
aproximadamente 2% en peso (por ejemplo, de aproximadamente 0.7% en peso a
aproximadamente 1.5% en peso, de aproximadamente 0.9% en peso a
aproximadamente 1.4% en peso, o de aproximadamente 1.2% en peso a
aproximadamente 1.3 en peso %) por kilogramo de clara de huevo.
El tampón ácido puede tener un pH de aproximadamente 4 a
aproximadamente 6.5 (por ejemplo, aproximadamente 4, aproximadamente 4.5,
aproximadamente, 5, aproximadamente 5.5, aproximadamente 6.0 o
aproximadamente 6.5).
Después de mezclar el tampón ácido con la clara de huevo, el pH de la
clara de huevo mezclada puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente
6.5. En algunas realizaciones, el pH de la clara de huevo mezclada es de 5 a
aproximadamente 6.3 (por ejemplo, de aproximadamente 5.7 a aproximadamente
6.3, de aproximadamente 5.8 a aproximadamente 6.2, de aproximadamente 5.9 a
aproximadamente 6.1, o aproximadamente 6). En algunas realizaciones, el pH de
la clara de huevo mezclada es un valor tal que la clara de huevo mezclada se
hace menos viscosa.
La clara de huevo se puede mezclar durante al menos aproximadamente 1
hora y/o a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 25°C.
La piscina de clara de huevo puede tener un volumen de al menos
aproximadamente 10 litros (por ejemplo, al menos aproximadamente 50 litros).
El tampón ácido se puede añadir a la piscina de clara de huevo en una sola
inyección en bolo y/o a una velocidad de al menos aproximadamente 1 L/minuto.
La adición del tampón ácido a la clara de huevo y la mezcla de la clara de
huevo puede llevarse a cabo simultáneamente.
 4

El método puede incluir además una etapa de permitir que la clara de huevo
mezclada se asiente de manera que la clara de huevo se separa en capas
superior, media e inferior. En tales realizaciones, el método puede incluir además
una etapa de aislar la capa media. En algunas realizaciones, el método puede
incluir además filtrar la capa media después de la etapa de aislamiento. El filtrado
puede incluir hacer pasar al menos una porción (por ejemplo, todo) de la capa
media a través de un filtro que tiene un tamaño medio de poro que varía de
aproximadamente 0.1 µm a aproximadamente 100 µm. En algunas realizaciones,
la filtración puede incluir hacer pasar al menos una porción de la capa media a
través de una pluralidad de filtros.
El método puede incluir además filtrar la clara de huevo mezclada sin
permitir que la clara de huevo mezclada se asiente. En tales realizaciones, la
etapa de filtración puede incluir filtrar la clara de huevo mezclada a través de un
filtro que tiene un tamaño medio de poro que varía de aproximadamente 0.1 µm a
aproximadamente 100 µm. En algunas realizaciones, la etapa de filtración puede
incluir una o más etapas de filtración posteriores después de un filtrado inicial de la
clara de huevo mezclada, la una o más etapas posteriores de filtración utilizando
uno o más filtros que tienen un tamaño medio de poro que varía de
aproximadamente 0.1 µm a aproximadamente 40 µm.
El método puede incluir además una etapa de centrifugación después de la
etapa de mezcla, en la que la clara de huevo mezclada se centrifuga para separar
precipitados que contienen complejos de ovomucina-lisozima del sobrenadante.
La clara de huevo puede incluir una proteína terapéutica recombinante
exógena a la clara de huevo.
El tampón ácido puede tener una conductividad de aproximadamente 8
mS/cm a aproximadamente 40 mS/cm.
El tampón ácido puede ser de aproximadamente 0.5% en peso a 5% en
peso por kilogramo de clara de huevo.
Un tampón de pre-tratamiento puede ser utilizado para preparar filtros para
el paso de la clara de huevo acidificada. El tampón de pretratamiento puede tener
un pH sustancialmente similar a o el mismo que el pH de la clara de huevo,
variando de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.5. Por ejemplo, el tampón
de pre-tratamiento puede tener un pH de aproximadamente 5.9 a
aproximadamente 6.1 (por ejemplo, aproximadamente 6).
El tampón de pre-tratamiento puede incluir fosfato de sodio y cloruro de
sodio.
El tampón de pre-tratamiento puede tener una conductividad de
aproximadamente 10 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm.
 5

La clara de huevo acidificada puede tener una conductividad de

aproximadamente 8 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm.
El filtro puede tener un área de medio de filtración de al menos
aproximadamente 8 m2.
El filtro puede tener un tamaño medio de poro de aproximadamente 0.1 µm
a aproximadamente 100 µm.
La clara de huevo se puede hacer pasar a través del filtro a una presión
diferencial inferior a aproximadamente 30 psi (por ejemplo, inferior a
aproximadamente 15 psi).
Las realizaciones pueden tener las siguientes ventajas.
En general, las columnas cromatográficas utilizadas en el
aislamiento/purificación de la proteína exógena a partir de la clara de huevo son
muy costosas, lo cual puede ser uno de los factores limitantes clave en la
producción a escala industrial y comercial de proteínas recombinantes a partir de
clara de huevo. Debido a que sólo una pequeña cantidad de un tampón ácido se
utiliza para obtenerla la clara de huevo acidificada, la cantidad de la clara de
huevo acidificada utilizada para obtener proteínas terapéuticas purificadas se
reduce significativamente (es decir, al menos 3 a 4 veces menos que los métodos
de dilución convencional). Como resultado, el tiempo consumido para la carga de
la clara de huevo acidificada a las columnas posteriores también se reduce
significativamente, lo que permite la producción de proteínas rápida en un proceso
industrial. Además, debido a que algunas proteínas terapéuticas son sensibles al
entorno expuesto durante la preparación de la clara de huevo y los procesos de
aislamiento/purificación, reducir al mínimo el tiempo empleado en la preparación y
los procesos de aislamiento/purificación mediante la reducción de volumen de
muestra es muy ventajoso para la producción comercial que normalmente implica
un volumen de clara de huevo de 500L o más. En suma, el tiempo de
procesamiento, materiales y mano de obra se pueden minimizar en gran medida
mediante el uso de los métodos descritos en el presente documento.
Otras características, objetos y ventajas serán evidentes a partir de la
descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA
Esta divulgación se refiere a métodos eficaces para la preparación de la
clara de huevo (por ejemplo, obtenida a partir de los huevos puestos por pollos
transgénicos) para el aislamiento cromatográfico a granel de las proteínas (por
ejemplo, proteínas recombinantes) de la clara de huevo, así como métodos de
aislamiento de proteínas a partir de la clara de huevo. La clara de huevo
 6

preparada por los métodos descritos en el presente documento esta generalmente

en la forma de una solución homogénea de viscosidad baja que es adecuada para
el procesamiento cromatográfico granel.
En algunas realizaciones, la clara de huevo utilizada como un material de
partida de los métodos descritos en el presente documento puede incluir una
proteína recombinante (por ejemplo, una proteína terapéutica recombinante)
exógena a la clara de huevo. Proteínas recombinantes ejemplares incluyen
citoquinas tales como GC-SF, GM-CSF, eritropoyetina, e interferones tales como
el interferón-α o interferón-β; enzimas lisosomales humanas; inmunoglobulinas
(por ejemplo, anticuerpos); y proteínas estructurales. Otras proteínas
recombinantes ejemplares que se pueden aislar a partir de procesamiento
cromatográfico a granel se han descrito, por ejemplo, en la Publicación de la
Solicitud de EE.UU. No. 2009/0299037.
En general, los métodos de preparación de la clara de huevo que se
describen en el presente documento incluyen (1) adicionar una cantidad adecuada
de un tampón ácido (por ejemplo, de aproximadamente 0.5% en peso a 5% en
peso por kilogramo de clara de huevo) que contiene un agente ácido a una piscina
de clara de huevo (por ejemplo, que tiene un volumen de al menos
aproximadamente 10 litros); y (2) mezclar el tampón ácido y la clara de huevo para
formar una clara de huevo mezclada que tiene un pH adecuado (por ejemplo, un
pH que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5).
En general, la piscina de clara de huevo utilizada en los métodos descritos
en la presente memoria está a una escala industrial y tiene un volumen
relativamente grande. Por ejemplo, la piscina de clara de huevo puede tener un
volumen de al menos aproximadamente 10 litros (por ejemplo, al menos
aproximadamente 50 litros, al menos aproximadamente 100 litros, al menos
aproximadamente 200 litros, al menos aproximadamente 300 litros, al menos
aproximadamente 400 litros, al menos aproximadamente 500 litros, por lo menos
aproximadamente 600 litros, al menos aproximadamente 700 litros, al menos
aproximadamente 800 litros, al menos aproximadamente 900 litros, al menos
aproximadamente 1000 litros, al menos aproximadamente 1500 litros, al menos
aproximadamente 2000 litros, al menos aproximadamente 3000 litros, al menos
aproximadamente 4000 litros, al menos aproximadamente 5.000 litros, al menos
aproximadamente 10.000 litros, o al menos aproximadamente 20.000 litros). Los
métodos de preparación de clara de huevo como material de partida para ser
usados en los métodos descritos en el presente documento se han descrito, por
ejemplo, en la Publicación de la Solicitud de EE.UU. No. 2009/0299037.
 7

El agente ácido en el tampón ácido puede ser generalmente cualquier ácido

adecuado (por ejemplo, un ácido orgánico o un ácido inorgánico). Agentes ácidos
ejemplares incluyen ácido acético, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico,
ácido fosfórico, ácido fluorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido
cítrico, ácido bórico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido oxálico,
ácido úrico, y ácido barbitúrico. En algunas realizaciones, una combinación de dos
o más (por ejemplo, tres o cuatro) ácidos se puede utilizar como el agente ácido
en el tampón ácido.
En algunas realizaciones, el tampón ácido puede incluir una o más sales
(por ejemplo, sales alcalinas). Un ejemplo de tal sal puede ser acetato de sodio.
En algunas realizaciones, la sal utilizada en el tampón ácido puede ser una sal del
agente ácido utilizado en el tampón ácido. En otras realizaciones, la sal utilizada
en el tampón ácido puede ser una sal de un ácido diferente del agente ácido
utilizado en el tampón ácido. En algunas realizaciones, el tampón ácido puede
incluir de aproximadamente 5M a aproximadamente 6M (por ejemplo,
aproximadamente 5.7 M) de una sal (por ejemplo, acetato de sodio). Sin desear
estar limitado por la teoría, se cree que el uso de una sal que tiene una
concentración tal puede resultar en un tampón ácido que tiene una cantidad
adecuada de contenido de tampón. Si el contenido de tampón es demasiado alto,
el tampón ácido pueden volverse inflamable y/o corrosivo, haciendo el tampón
inseguro para mantener, manejar y/o almacenar. Si el contenido de tampón es
demasiado bajo, podría ser necesario un mayor volumen de tampón ácido para
ajustar el pH de la clara de huevo al valor objetivo, reduciendo de esta manera la
eficiencia del proceso de preparación de la clara de huevo, así como de los
procesos de aislamiento/purificación de proteínas corriente abajo.
En general, las cantidades del agente ácido y la sal usados en el tampón
ácido pueden variar en función del pH deseado del tampón ácido. En algunas
realizaciones, el tampón ácido puede tener un pH de aproximadamente 4 a
aproximadamente 6.5 (por ejemplo, de aproximadamente 4 a aproximadamente 5
o de aproximadamente 4 a aproximadamente 4.5). Por ejemplo, el tampón ácido
puede tener un pH de aproximadamente 4 o un pH de aproximadamente 4.5.
El tampón ácido se puede formar por cualquier método adecuado conocido
en la técnica. Por ejemplo, el tampón ácido se puede formar mediante la adición
de un agente ácido a una solución que contiene una base para ajustar el pH de la
solución a un valor deseado. Por ejemplo, se puede añadir solución de ácido
acético glacial a una cantidad apropiada de NaOH para obtener un tampón ácido
que contiene 5.7M de acetato de sodio.
 8

En general, la cantidad del tampón ácido respecto a la de la clara de huevo

es pequeña. Por ejemplo, el tampón ácido puede ser de aproximadamente 0.5%
en peso a 5% en peso (por ejemplo, de aproximadamente 0.5% en peso a
aproximadamente 2% en peso, de aproximadamente 0.7% en peso a 1.5% en
peso, de aproximadamente 0.9% en peso a aproximadamente 1.4 % en peso, de
aproximadamente 1% en peso a aproximadamente 1.4%, o de aproximadamente
1.1% en peso a aproximadamente 1.3% en peso) por kilogramo de clara de huevo.
Convencionalmente, los esfuerzos para crear una clara de huevo de viscosidad
baja, homogénea adecuada para el procesamiento cromatográfico a granel
requiere adicionar un tampón ácido que tiene un volumen de 2 a 5 veces (es decir,
200% a 500%) del volumen de la clara de huevo, ya que no se esperaba que la
adición de una pequeña cantidad de un tampón ácido sería eficaz en ajustar el pH
de la clara de huevo al valor objetivo. Dicho proceso no es económicamente
práctico ni factible a gran escala de fabricación debido a las limitaciones de
tamaño de las columnas cromatográficas y otros equipos de fabricación utilizados
en el proceso de preparación de clara de huevo. Inesperadamente, los presentes
inventores descubrieron que una clara de huevo de baja viscosidad, homogénea
adecuada para el procesamiento cromatográfico a granel se puede obtener
mediante la adición de una pequeña cantidad de un tampón ácido (por ejemplo,
como máximo aproximadamente 5% en peso por kilogramo de clara de huevo)
respecto a la cantidad de clara de huevo, lo que reduce significativamente la
cantidad de las columnas utilizadas en los procedimientos de aislamiento
cromatográficos, los tamaños de otros equipos utilizados en estos procesos, y el
costo y el tiempo de aislar proteínas recombinantes a partir de clara de huevo.
Sin desear estar limitado por la teoría, se cree que las ventajas adicionales
de adicionar una cantidad relativamente pequeña de un tampón ácido en relación
con la cantidad de clara de huevo incluyen (1) dilución despreciable de la clara de
huevo, (2) esencialmente ningún cambio en la conductividad, lo cual permite la
precipitación de complejos de ovomucina-lisozima a partir de la clara de huevo, lo
que a su vez reduce la viscosidad de la clara de huevo a un menor rango de pH
(por ejemplo, pH 5 – 6.5) y facilita la separación de materiales no deseados de la
clara de huevo durante la filtración y los procesos cromatográficos, y (3) minimizar
la formación de bolsas de pH bajo dentro de la clara de huevo viscosa que
potencialmente puedan dañar las proteínas recombinantes o resultar en pH
desigual de los materiales de clara de huevo.
En general, el tampón ácido puede tener una conductividad que varía desde
aproximadamente 8 mS/cm a aproximadamente 40 mS/cm. Por ejemplo, el
tampón ácido puede tener una conductividad de al menos aproximadamente 8
 9

mS/cm (por ejemplo, al menos aproximadamente 9 mS/cm, al menos

aproximadamente 10 mS/cm, al menos aproximadamente 11 mS/ cm, al menos
aproximadamente 12 mS/cm, al menos aproximadamente 13 mS/cm, al menos
aproximadamente 14 mS/cm, al menos aproximadamente 15 mS/cm, al menos
aproximadamente 16 mS/cm, al menos aproximadamente 17 mS/cm, al menos
aproximadamente 18 mS/cm , al menos aproximadamente 19 mS/cm, al menos
aproximadamente 20 mS/cm, al menos aproximadamente 21 mS/cm, al menos
aproximadamente 22 mS/cm, al menos aproximadamente 23 mS/cm, al menos
aproximadamente 24 mS/cm, en menos aproximadamente 25 mS/cm) y/o como
máximo aproximadamente 40 mS/cm (por ejemplo, como máximo
aproximadamente 39 mS/cm, como máximo aproximadamente 38 mS/cm, como
máximo aproximadamente 37 mS/cm, como máximo aproximadamente 36 mS/cm,
como máximo aproximadamente 35 mS/cm, como máximo aproximadamente 34
mS/cm, como máximo aproximadamente 33 mS/cm, como máximo
aproximadamente 32 mS/cm, como máximo aproximadamente 31 mS/cm, como
máximo aproximadamente 30 mS/cm, como máximo aproximadamente 29 mS/cm,
como máximo aproximadamente 28 mS/cm, como máximo aproximadamente 27
mS/cm, como máximo aproximadamente 26 mS/cm, o como máximo
aproximadamente 25 mS/cm). Por ejemplo, el tampón ácido puede tener una
conductividad de cualquier valor entre aproximadamente 8 mS/cm y
aproximadamente 40 mS/cm. Sin desear estar limitado por la teoría, se cree que el
uso de un tampón ácido que tiene una conductividad de aproximadamente 8
mS/cm a aproximadamente 40 mS/cm minimizaría los cambios en la conductividad
de la clara de huevo mezclada de manera que el proceso se puede implementar y
coordinar con la etapa de aislamiento de proteínas corriente abajo sin necesidad
de cambiar las condiciones de aislamiento de la cromatografía en columna
utilizada en la etapa de aislamiento y sin causar más precipitación o agregación.
En algunas realizaciones, el tampón ácido se puede añadir a la piscina
declara de huevo en una sola inyección en bolo. En alguna realización, la
inyección en bolo único se realiza a una velocidad de inyección adecuada (por
ejemplo, al menos aproximadamente 1 L/minuto) para asegurar que se añade la
adición del tampón ácido dentro de una cantidad de tiempo adecuada (por
ejemplo, como máximo aproximadamente 5 minutos). Sin desear estar limitado por
la teoría, se cree que las ventajas de utilizar una sola inyección en bolo incluyen
(1) formar floculante relativamente grande que se asienta fácilmente por gravedad,
reduciendo de ese modo la necesidad de grandes filtros y (2) evitar la necesidad
de valoración continua de una piscina de clara de huevo viscosa, la cual puede
causar falsas lecturas de pH que desencadenan adición repetida de un ácido o
 10

una base, que a su vez puede dañar potencialmente las proteínas recombinantes
en la clara de huevo y aumentar la turbidez de la solución de clara de huevo
producida.
En algunas realizaciones, después de que se añade el tampón ácido a la
piscina de clara de huevo, la clara de huevo se mezcla a una temperatura
adecuada (por ejemplo, de aproximadamente 2°C a apr oximadamente 25°C)
durante un periodo de tiempo adecuado (por ejemplo, al menos aproximadamente
1 hora) para formar una clara de huevo mezclada que tiene un pH adecuado. En
algunas realizaciones, la adición del tampón ácido y la mezcla de la clara de
huevo se realizan simultáneamente.
En general, la adición del tampón ácido y la mezcla del tampón ácido con la
clara de huevo resultan en la formación de una gran cantidad de precipitados (por
ejemplo, complejos de ovomucina-lisozima). Los precipitados generalmente
reducen la viscosidad de la clara de huevo restante en la solución.
En algunas realizaciones, el pH de la clara del huevo mezclada es un valor
tal que la clara de huevo mezclada se hace menos viscosa. Por ejemplo, la clara
de huevo mezclada puede tener un pH de al menos aproximadamente 5 (por
ejemplo, al menos aproximadamente 5.2, al menos aproximadamente 5.4, al
menos aproximadamente 5.6, al menos aproximadamente 5.7, al menos
aproximadamente 5.8 o al menos aproximadamente 5.9) y/o como máximo
aproximadamente 6.5 (por ejemplo, como máximo aproximadamente 6.3, como
máximo aproximadamente 6.2 o como máximo aproximadamente 6.1). En algunas
realizaciones, la clara de huevo mezclada puede tener un pH de aproximadamente
6. Sin desear estar limitado por la teoría, se cree que un pH tal (por ejemplo,
aproximadamente 6) puede permitir la formación de la mayor cantidad de
precipitados a partir de la clara de huevo que se asientan por gravedad, lo que
reduce la necesidad de filtración y facilita la formación de una solución de clara de
huevo de baja viscosidad, homogénea.
En general, la clara de huevo mezclada (es decir, la clara de huevo de pH
ajustado o acidificada) tiene una relativa conductividad baja (por ejemplo, similar a
la conductividad de una clara de huevo no tratada con un tampón ácido). Por
ejemplo, la clara de huevo mezclada puede tener una conductividad de al menos
aproximadamente 8 mS/cm (por ejemplo, al menos aproximadamente 8,2 mS/cm,
al menos aproximadamente 8,4 mS/cm, por lo menos aproximadamente 8,6
mS/cm, al menos aproximadamente 8,8 mS/cm, al menos aproximadamente 9
mS/cm, por lo menos aproximadamente 9,2 mS/cm, por lo menos
aproximadamente 9,4 mS/cm, por lo menos aproximadamente 9,6 mS/cm, por lo
menos aproximadamente 9,8 mS/cm, al menos aproximadamente 10 mS/cm, al
 11

menos aproximadamente 11 mS/cm, al menos aproximadamente 12 mS/cm, al

menos aproximadamente 13 mS/cm, o al menos aproximadamente 14 mS/cm) y/o
como máximo aproximadamente 20 mS/cm (por ejemplo, como máximo
aproximadamente 19 mS/cm, como máximo aproximadamente 18 mS/cm, como
máximo aproximadamente 17 mS/cm, como máximo aproximadamente 16 mS/cm,
como máximo aproximadamente 15 mS/cm, como máximo aproximadamente 14
mS/cm, como máximo aproximadamente 13 mS/cm, como máximo
aproximadamente 12 mS/cm, como máximo aproximadamente 11.8 mS/cm, como
máximo aproximadamente 11.6 mS/cm, como máximo aproximadamente 11.4
mS/cm, como máximo aproximadamente 11.2 mS/cm, como máximo
aproximadamente 11 mS/cm, como máximo aproximadamente 10.8 mS/cm, como
máximo aproximadamente 10.6 mS/cm, como máximo aproximadamente 10.4
mS/cm, como máximo aproximadamente 10.2 mS/cm, o como máximo
aproximadamente 10 mS/cm). Por ejemplo, la clara de huevo mezclada puede
tener una conductividad de cualquier valor entre aproximadamente 8 mS/cm y
aproximadamente 20 mS/cm. Sin desear estar limitado por la teoría, se cree que el
mantenimiento de la clara de huevo mezclada a conductividad de
aproximadamente 8 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm permitiría que la clara
de huevo mezclada cumpla con las condiciones utilizadas en la etapa de
aislamiento de proteínas corriente abajo de modo que la clara de huevo mezclada
se puede utilizar constantemente en la etapa de aislamiento sin cambiar las
condiciones de aislamiento de la cromatografía en columna utilizada en este paso.
Una vez completada la mezcla, los métodos descritos en el presente
documento pueden incluir un paso opcional de permitir que la clara de huevo
mezclada se asiente durante un período de tiempo adecuado (por ejemplo, al
menos aproximadamente 6 horas) de tal manera que la clara de huevo se separa
en capas superior, media e inferior. Típicamente, la capa superior incluye ciertos
materiales no deseados (por ejemplo, proteína desnaturalizada y lípidos
espumosos incluyendo fosfolípidos, triglicéridos y colesterol) que tienen una baja
densidad, la capa inferior incluye los precipitados formados a partir de las
proteínas de clara de huevo (por ejemplo, complejos de ovomucina-lisozima), y la
capa media incluye una solución de clara de huevo relativamente clara.
En algunas realizaciones, durante la etapa de asentamiento, si el pH de la
clara de huevo mezclada llega a caer fuera del valor deseado (por ejemplo, 5.7 ±
0.1, 6.0 ± 0.1, o 6.3 ± 0.1), se puede ajustar para alcanzar el valor deseado
utilizando un ácido (por ejemplo, el tampón ácido descrito anteriormente) o una
base (por ejemplo, un acetato de sodio 5.7 M o solución de hidróxido de sodio 1
N). En tales realizaciones, el ajuste de pH puede ser seguido por un mezclado (por
 12

ejemplo, durante al menos aproximadamente 1 hora) y asentamiento (por ejemplo,

durante al menos aproximadamente 3 horas) adicional a temperatura ambiente.
En general, el tiempo de mezcla y asentamiento total no es superior a 24 horas
para minimizar el tiempo que las proteínas exógenas en la clara de huevo están
expuestas al entorno de procesamiento, manteniendo de este modo las
actividades biológicas de estas proteínas.
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento
pueden incluir una etapa de aislar la capa media de la clara de huevo mezclada
después de la etapa de asentamiento. En general, la capa media se puede aislar
usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la capa media puede ser
desviada fuera del recipiente que contiene la clara de huevo mezclada mediante la
inserción de un tubo (por ejemplo, un tubo de metal o policarbonato) en la capa
media (preferiblemente en el centro de la capa media) de modo que el contenido
de la capa media puede ser bombeada a un recipiente receptor sin perturbar las
capas superior e inferior.
En general, después de aislada la capa media, al menos una parte de la
capa media (por ejemplo, la totalidad de la capa media) se puede filtrar para
eliminar las partículas suspendidas en la capa media para obtener una solución de
clara de huevo clara, de baja viscosidad, homogénea. Este paso también se
conoce como clarificación de clara de huevo. En algunas realizaciones, la capa
media se puede filtrar a través de uno o más filtros que tienen un tamaño medio de
poro de como máximo aproximadamente 100 µm (por ejemplo, como máximo
aproximadamente 90 µm, como máximo aproximadamente 80 µm, como máximo
aproximadamente 70 µm, como máximo aproximadamente 60 µm, como máximo
aproximadamente 50 µm, como máximo aproximadamente 40 µm, como máximo
aproximadamente 30 µm, como máximo aproximadamente 20 µm, como máximo
aproximadamente 10 µm, como máximo aproximadamente 9 µm, como máximo
aproximadamente 8 µm, como máximo aproximadamente 7 µm, como máximo
aproximadamente 6 µm, como máximo aproximadamente 5 µm, como máximo
aproximadamente 4 µm, como máximo aproximadamente 3 µm, como máximo
aproximadamente 2 µm, o como máximo aproximadamente 1 µm) y / o al menos
aproximadamente 0.1 µm (por ejemplo, al menos aproximadamente 0.2 µm, al
menos aproximadamente 0.3 µm, al menos aproximadamente 0.4 µm, al menos
aproximadamente 0.5 µm, al menos aproximadamente 0.6 µm, al menos
aproximadamente 0.7 µm, al menos aproximadamente 0.8 µm, al menos
aproximadamente 0.9 µm, al menos aproximadamente 1 µm, al menos
aproximadamente 2 µm, o al menos aproximadamente 3 µm). Por ejemplo, el filtro
puede tener un tamaño medio de poro que varía de aproximadamente 0.1 µm a
 13

aproximadamente 100 µm (por ejemplo, de aproximadamente 0.1 µm a

aproximadamente 40 µm, de aproximadamente 40 µm a aproximadamente 100
µm, de aproximadamente 3 µm a aproximadamente 6 µm, o de aproximadamente
0.1 µm a aproximadamente 0.3 µm).
En algunas realizaciones, la capa media se puede filtrar a través de una
pluralidad de filtros conectados en serie entre sí, en la que el tamaño medio de
poro de los filtros disminuye secuencialmente. Por ejemplo, la capa media se
puede filtrar a través de un sistema de filtración que contiene tres filtros
conectados en serie, en la que el primer filtro puede tener un tamaño medio de
poro de aproximadamente 40 µm, el segundo filtro puede tener un tamaño medio
de poro de aproximadamente 3 µm a aproximadamente 6 µm, y el tercer filtro
puede tener un tamaño medio de poro de aproximadamente 0.1 µm a
aproximadamente 0.3 µm. Un ejemplo de tal sistema de filtración es un sistema
que contiene los filtros de profundidad secuenciales disponibles en el mercado de
Pall Corporation (por ejemplo, que contiene los filtros de profundidad T2600,
K200P y Bio10). Opcionalmente, el sistema de filtración puede incluir además un
cuarto filtro (por ejemplo, que tiene un tamaño medio de poro de aproximadamente
0,2 µm) corriente abajo del tercer filtro. Un ejemplo del cuarto filtro es un filtro
Sartobran P disponible de Sartorius Corporation.
En algunas realizaciones, los filtros utilizados para filtrar la capa media
pueden tener una gran área de medio de filtración. Por ejemplo, los filtros pueden
tener un área de medio de filtración de al menos aproximadamente 1 m2 (por
ejemplo, al menos aproximadamente 2 m2, al menos aproximadamente 4 m2, al
menos aproximadamente 6 m2, o al menos aproximadamente 8 m2).
En algunas realizaciones, después de que el tampón ácido y la clara de
huevo se mezclan para formar una clara de huevo mezclada, la clara de huevo
mezclado se puede filtrar sin la necesidad de permitir que los precipitados en la
clara de huevo mezclada se asienten. En tales realizaciones, la clara de huevo
mezclada (incluyendo los precipitados formados durante las etapas de
adición/mezcla y la solución de clara de huevo restante) se puede filtrar sin
ninguna separación previa de los precipitados de la clara de huevo mezclada. Por
ejemplo, después de que el tampón ácido y la clara de huevo se mezclan, la clara
de huevo mezclada se puede filtrar sin asentar mediante el uso de uno o más
filtros descritos en el presente documento (por ejemplo, un sistema de filtración
que contiene tres filtros conectados en serie que tienen tamaños de poro
decrecientes). Sin desear estar limitado por la teoría, se cree que, mediante la
eliminación de una etapa de asentamiento, un método de este tipo puede reducir
significativamente el tiempo y los costos para la preparación de clara de huevo
 14

para procesamiento cromatográfico a granel y para el aislamiento de proteínas de

la clara de huevo.
En algunas realizaciones, después de que el tampón ácido y la clara de
huevo se mezclan para formar una clara de huevo mezclada, la clara de huevo
mezclada se puede centrifugar para separar los precipitados (por ejemplo,
complejos de ovomucina-lisozima) del sobrenadante. El sobrenadante obtenido
así se puede filtrar mediante el uso de uno o más filtros descritos en el presente
documento.
En general, la solución de clara de huevo filtrada se puede utilizar para
aislar las proteínas recombinantes mediante el uso de cromatografía en columna,
tales como cromatografía de intercambio iónico o cromatografía basada en
interacción hidrófoba. Ejemplos de tales métodos cromatográficos se han descrito,
por ejemplo, en la Publicación de la Solicitud de EE.UU. No. 2009/0299037.
En algunas realizaciones, esta divulgación presenta métodos de aislamiento
de una proteína recombinante a partir de clara de huevo. Por ejemplo, tales
métodos pueden incluir las etapas de: (1) proporcionar una piscina de clara de
huevo que contiene una proteína recombinante, la piscina teniendo un volumen de
al menos aproximadamente 10 litros; (2) ajustar el pH de la clara de huevo a partir
de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5, en donde la conductividad de la
clara de huevo de pH ajustado es de aproximadamente 8 mS/cm a
aproximadamente 20 mS/cm; (3) filtrar la clara de huevo para formar una solución;
y (4) aislar la proteína recombinante en la clara de huevo por cromatografía en
columna. La etapa de ajuste se puede realizar mediante la adición de una
pequeña cantidad de un tampón ácido (por ejemplo, de aproximadamente 0.5% en
peso a 5% en peso por kilogramo de clara de huevo) a la clara de huevo de la
misma manera como se describió anteriormente. Las etapas de filtrado y
aislamiento pueden ser realizadas por los métodos descritos en el presente
documento o métodos conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, esta divulgación presenta métodos de filtrado de
la clara de huevo acidificada (por ejemplo, la clara de huevo acidificada por un
tampón ácido descrito anteriormente). Por ejemplo, tales métodos pueden incluir
las etapas de: (1) hacer pasar un tampón de pre-tratamiento que tiene una
conductividad de entre aproximadamente 8 mS/cm y aproximadamente 20 mS/cm
a través de un filtro; y (2) hacer pasar la clara de huevo (por ejemplo, que tiene un
volumen de al menos aproximadamente 50 L) que tiene un pH de
aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5 a través del filtro para obtener una
clara de huevo filtrada. La clara de huevo filtrada puede utilizarse luego para aislar
las proteínas recombinantes mediante el uso de cromatografía en columna. En
 15

algunas realizaciones, el filtro usado en tales métodos puede ser similar a o el

mismo que los descritos anteriormente. Por ejemplo, el filtro puede tener el mismo
tamaño medio de poro (por ejemplo, de aproximadamente 0.1 µm a
aproximadamente 100 µm) o área de medio filtración como las descritas
anteriormente (por ejemplo, al menos aproximadamente 8 m2).
En algunas realizaciones, el tampón de pre-tratamiento puede ser usado
para mojar el filtro antes de pasar la clara de huevo (por ejemplo, la clara de huevo
acidificada). El tampón de pre-tratamiento puede incluir una o más sales (por
ejemplo, sales alcalinas). Sales ejemplares incluyen fosfato de sodio y cloruro de
sodio. En algunas realizaciones, el tampón de pre-tratamiento puede incluir una
combinación de fosfato de sodio y cloruro de sodio.
En general, el tampón de pre-tratamiento puede incluir un ácido. Ácidos
ejemplares incluyen ácido acético, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico,
ácido fosfórico, ácido fluorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido
cítrico, ácido bórico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido oxálico,
ácido úrico, y ácido barbitúrico. En algunas realizaciones, una combinación de dos
o más (por ejemplo, tres o cuatro) ácidos se puede usar en el tampón de pre-
tratamiento.
En algunas realizaciones, el tampón de pre-tratamiento puede tener un pH
sustancialmente el mismo que el pH de la clara de huevo. Por ejemplo, el tampón
de pre-tratamiento puede tener un pH de al menos aproximadamente 5 (por
ejemplo, al menos aproximadamente 5.2, al menos aproximadamente 5.4, al
menos aproximadamente 5.6, al menos aproximadamente 5.7, al menos
aproximadamente 5.8 o al menos aproximadamente 5.9) y/o como máximo
aproximadamente 6.5 (por ejemplo, como máximo aproximadamente 6.4, como
máximo aproximadamente 6.3, como máximo aproximadamente 6.2 o como
máximo aproximadamente 6.1). En algunas realizaciones, el tampón de pre-
tratamiento puede tener un pH de aproximadamente 6. Sin desear estar limitado
por la teoría, se cree que el uso de un tampón de pre-tratamiento que tiene un pH
sustancialmente el mismo que el pH de la clara de huevo para tratar un filtro
puede ajustar el pH de la superficie del filtro para que sea similar al pH de la clara
de huevo, minimizando de este modo la precipitación de la clara de huevo durante
la filtración, lo cual puede causar obstrucción en el filtro u obstruir el flujo de las
muestras que causa tensión de cizallamiento en el filtro, acortando seriamente por
lo tanto la vida de uso del filtro.
Generalmente, el tampón de pre-tratamiento puede tener una conductividad
compatible con la conductividad de la clara de huevo tal que la clara de huevo
acidificada filtrada es compatible con las características de la cromatografía en
 16

columna (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico) utilizada en los

procesos de aislamiento/purificación corriente abajo. Por ejemplo, el tampón de
pre-tratamiento puede tener una conductividad de al menos aproximadamente 8
mS/cm (por ejemplo, al menos aproximadamente 9 mS/cm, al menos
aproximadamente 10 mS/cm, al menos aproximadamente 11 mS/cm, al menos
aproximadamente 12 mS/cm, al menos aproximadamente 13 mS/cm, al menos
aproximadamente 14 mS/cm, al menos aproximadamente 15 mS/cm, al menos
aproximadamente 16 mS/cm, al menos aproximadamente 17 mS/cm, al menos
aproximadamente 18 mS/cm) y/o como máximo aproximadamente 20 mS/cm (por
ejemplo, como máximo aproximadamente 19 mS/cm, como máximo
aproximadamente 18 mS/cm, como máximo aproximadamente 17 mS/cm, como
máximo aproximadamente 16 mS/cm, en la mayoría aproximadamente 15 mS/cm,
como máximo aproximadamente 14 mS/cm, como máximo aproximadamente 13
mS/cm, como máximo aproximadamente 12 mS/cm, o como máximo
aproximadamente 11 mS/cm). Por ejemplo, el tampón de pre-tratamiento puede
tener una conductividad de cualquier valor entre aproximadamente 8 mS/cm y
aproximadamente 20 mS/cm. Los presentes inventores encontraron que el uso de
un filtro sin ser tratado con el anterior tampón de pre-tratamiento para filtrar una
solución de clara de huevo causaría que el filtro se obstruya rápidamente por los
precipitados formados durante el proceso de filtración. Por otra parte, los
presentes inventores encontraron inesperadamente que el uso de un tampón de
pre-tratamiento que tiene la anterior conductividad para tratar un filtro puede
ajustar la conductividad de la superficie del filtro para ser similar a la de la clara de
huevo, minimizando de este modo la precipitación de la clara de huevo durante la
filtración y aumentar significativamente el tiempo de vida del filtro.
En algunas realizaciones, la clara de huevo puede pasar a través de un
filtro bajo una presión diferencial relativamente pequeña (por ejemplo, inferior a
aproximadamente 30 psi, inferior a aproximadamente 25 psi, inferior a
aproximadamente 20 psi, inferior a aproximadamente 15 psi, inferior a
aproximadamente 12 psi, inferior a aproximadamente 10 psi, o inferior a
aproximadamente 5 psi). Sin desear estar limitado por la teoría, se cree que hacer
pasar la clara de huevo a través de un filtro bajo una presión diferencial
relativamente pequeña puede minimizar daños y/o obstrucción al filtro, lo que
reduce los costos del producto ya que el filtro puede ser muy costoso.
El contenido de todas las publicaciones citadas en el presente documento
(por ejemplo, patentes, publicaciones de solicitud de patente, y artículos) se
incorporan aquí por referencia en su totalidad.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
 17

Ejemplo 1: Método de preparación de clara de huevo para procesamiento

cromatográfico a granel que tiene una etapa de asentamiento
De cincuenta a cuatrocientos kilogramos de clara de huevo congelada
almacenados a -20 ° C en botellas Nalgene de 4L se descongeló a temperatura
ambiente en baños de agua establecidos a 21 ± 1°C d urante aproximadamente 5 -
7 horas. Una vez cada hora, cada botella se retiró del baño de agua,
inspeccionada visualmente para determinar el grado de deshielo, invertida
repetidamente y colocada de nuevo en el baño de agua hasta que el deshielo era
completo. Las botellas descongeladas se retiraron de los baños de agua y se
almacenaron a 2-8°C. Después de que la última botel la de clara de huevo se
descongeló, la clara de huevo en las botellas se combinó en un recipiente de
mezcla de tapa abierta. Se añadió un tampón ácido que contiene acetato de sodio
5.7 M a pH 4,0 (aproximadamente 1.3% peso/peso con respecto al peso de la
clara de huevo) a la piscina de clara de huevo descongelada a 1 kilogramo por
minuto, asegurando que la duración de la adición del tampón ácido no excediera 5
minutos, para obtener un pH objetivo final de 6.0 ± 0.1 a 2-8ºC. La mezcla de clara
de huevo se agitó continuamente durante 1 hora en el recipiente de mezcla de
tapa abierta sin control de temperatura, y luego se decantó en un mezclador
cerrado de un solo uso, refrigerado a 2-8 ° C, y se mezcló durante 6 horas.
Después de que la mezcla se detuvo, el precipitado se dejó sedimentar durante 6
horas. Si fuese necesario, el pH se ajustó adicionalmente a 6.0 ± 0.1 a 2-8ºC
utilizando acetato de sodio 5.7 M o de hidróxido de sodio 1 N, seguido por un
mezclado adicional durante 1 hora y asentamiento durante 3 horas a temperatura
ambiente (mezcla total y tiempo de asentamiento no superan las 24 horas). Una
vez finalizado el asentamiento, la clara de huevo mezclada formó por tres capas,
es decir, capas superior, media e inferior. A continuación, se colocó un tubo en la
capa media y la capa media fue desviada o bombeada a través del tubo sin
perturbar las capas superior e inferior. Los filtros (filtros de profundidad de Pall
Corporation secuenciales, 40 µm, 3-6 µm, 0.1-0.3 µm, respectivamente) se pre-
enjuagaron con 80 litros de agua purificada por metro cuadrado de área de filtro
para eliminar el carbono orgánico total, lixiviables, y extraíbles, y luego drenada.
Los filtros pre-enjuagados se trataron a continuación con 1 volumen de retención
de filtro de una solución tampón de pre-tratamiento que contiene fosfato de sodio
20 mM y cloruro de sodio 140 mM a pH 6.0 y luego drenada. La solución de clara
de huevo se decantó, evitando las partículas de clara de huevo agregadas y
precipitadas asentadas, y se filtró a través de filtración sin salida a una velocidad
de flujo de 1 litro por metro cuadrado por tipo de filtro o una presión diferencial
 18

inferior a 30 psid para eliminar cualquier material precipitado no-asentado y se

recogió en un mezclador de un solo uso estéril. A la finalización de la filtración de
la clara de huevo, la clara de huevo retenida en el sistema de filtración se lavó
abundantemente con un volumen de retención de tren de filtro de la solución
tampón de pre-tratamiento que contiene fosfato de sodio 20 mM y cloruro de sodio
140 mM a pH 6.0 para recuperar el producto y recogerlo en un mezclador de un
solo uso estéril. La solución de clara de huevo filtrada se muestrea para la
medición de la actividad enzimática y absorbancia ultravioleta (UV) y se almacenó
a 2-8°C por hasta 24 horas antes de usarse para el aislamiento de proteínas
recombinantes en la clara de huevo por medio de cromatografía en columna. La
Tabla 1 muestra los resultados de la acidificación de la clara de huevo utilizando el
tampón ácido descrito anteriormente (es decir, NaOAc 5.7 M, pH 4.0, y 1.3%
peso/peso).

Tabla 1
Promedio
Peso Total (kg) de la Clara de
83.52 ± 2.03
Huevo Mezclada
pH Nativo 8.41 ± 0.06
Conductividad Nativa (mS/cm) 8.47 ± 0.25
5.7 M NaOAc, pH: 4.0 (mL) 1 ± 0.02
% de NaoAC 5.7M añadido (p/p) 1.30%
% de NaOAc 5.7M añadido (p/p) 1.20%

Tiempo Posadición Bolo (min) pH Conductividad (mS/cm)

10 5.79 ± 0.03 9.52 ± 0.08
30 5.92 ± 0.02 9.45 ± 0.08
90 5.93 ± 0 9.48 ± 0.09
180 6.01 ± 0.01 9.48 ± 0.06
1080 6.09 ± 0.01 9.49 ± 0.09

Ejemplo 2: Método de preparación de clara de huevo para el procesamiento

cromatográfico a granel sin una etapa de asentamiento
Cuatrocientos kilogramos de clara de huevo congelada (+/- 10%) de clara
de huevo congelada (-20ºC) se descongelaron a 2-8ºC (en una cabina de cuarto
frío) en aproximadamente 24 - 72 horas. La clara de huevo descongelada se
combinó en un recipiente de mezcla cerrado de un solo uso con chaqueta y se
mantuvo a 2-8ºC. Se añadió un tampón ácido que contiene acetato de sodio 5.7 M
 19

a pH 4.0 (1.08% peso/peso) a la clara de huevo descongelada a 1 kilogramo por

minuto, asegurando que la duración de la adición del tampón ácido no excediera 5
minutos, para obtener un pH objetivo final de 6.0 ± 0.5. La solución de clara de
huevo acidificada se agitó continuamente durante 3 horas a 2-8°C. A continuación,
la clara de huevo acidificada se calentó a 21 ± 3°C a través del tranque con
chaqueta antes de la filtración. Los filtros (filtros de profundidad de Pall
Corporation secuenciales, 40 µm, 3-6 µm, 0.1-0.3 µm, respectivamente) se pre-
enjuago con 80 litros de agua purificada por metro cuadrado de área de filtro para
eliminar el carbono orgánico total, lixiviables, y extraíbles. El agua purificada en el
tren de filtro se desplazó con una solución tampón de pre-tratamiento que contiene
fosfato de sodio 20 mM y cloruro de sodio 140 mM a pH 6.0 hasta que la
conductividad del efluente de filtro estaba dentro del rango de conductividad
aceptable del tampón de pre-tratamiento (por ejemplo, 10 - 15 mS/cm). La clara de
huevo acidificada homogéneamente mezclada se filtró a través de filtración sin
salida a una velocidad de flujo de 1 litro/min/m2 por tipo de filtro o resultando en
una presión diferencial ≤ 10 psi para eliminar cualquier material precipitado o
agregado. Se utilizó el volumen de efluente del filtro inicial igual al 80% del
volumen de retención del tren de filtro para desplazar el tampón de pre-tratamiento
y se descartó antes de la recogida del producto. El restante tampón de pre-
tratamiento filtrado y la clara de huevo se recogieron en un mezclador de un solo
uso estéril. A la finalización de la filtración de la clara de huevo, la clara de huevo
retenida en el sistema de filtración se lavó con 1.5 volúmenes de retención de tren
de filtro (0.5 de volúmenes de retención se recogen mientras que 1 volumen de
retención permanece en el tren de filtración) de la solución tampón de
pretratamiento que contiene fosfato de sodio 20 mM y cloruro de sodio 140 mM a
pH 6.0 para recuperar el producto y se recogió en el tanque de un solo uso estéril.
La clara de huevo filtrada fue muestreada para medir la actividad enzimática y la
absorbancia y se almacenó a 2-8°C durante un máximo de 24 horas antes de que
se use para el aislamiento de proteínas recombinantes en la clara de huevo por
medio de cromatografía en columna.

Ejemplo 3: Reducción de escala del proceso de fabricación de clara de huevo para

evaluar la carga directa sobre el rendimiento de la filtración de profundidad y la
robustez de la acidificación de la clara de huevo
Materiales
Todos los productos químicos utilizados para los estudios de Clarificación
fueron de grado USP/MC. Las materias primas de clara de huevo se enumeran en
la Tabla 2. Toda la materia prima se almacenó a -20 ° C y se descongeló a 2-8ºC
 20

48-72 horas antes de su uso. La materia prima se combinó y se mantuvo a 2-8°C

a través de la etapa de acidificación.

Tabla 2. Materias primas de clara de huevo

Alicuota de
Título
Corrida Clara de Cigosidad
(g/L)*
Huevo (L)
1 20 0.77 Homo
2 20 1.02 Homo
3 20 0.79 Homo
* Basado en actividad enzimática

Para todas las preparaciones tampón, se llevaron a cabo mediciones de

conductividad utilizando medidores de pH/conductividad con temperatura
compensada a 25°C. El pH de los tampones fue medido a 20°C. Las
formulaciones de preparación de tampón en proceso se enumeran en la Tabla 3 a
continuación.
Tabla 3. Formulación de tampón
Especificaciones
Tampón Materia prima g/L Cond
pH
(mS/cm)
Acetato de
Acetato de Sodio 136.1
Acidificación de 4.0 ± 36.0 ±
Sodio 5.7 M, Trihidrato
clara de huevo 0.1 5.0
pH 4.0 Ácido Acético
285.0
Glacial
Fosfato de NaH2PO4·H2O 2.24
Enjuague de Sodio 20 mM, Na2HPO4·7H2O 1.02 6.0 ± 16.0 ±
Filtro/Equilibrado NaCl 140mM, 0.1 2.0
NaCl 8.18
pH 6.0)
Fosfato de NaH2PO4·H2O 2.24
6.0 ± 0.45 ±
Lavado 1 Sodio 5 mM,
Na2HPO4·7H2O 1.02 0.1 0.15
pH 6.0
Tris 5 mM, Base Tris 0.61
7.2 ± 88.0 ±
Lavado 2 NaCl 1 M, pH
NaCl 58.44 0.1 5.0
7.2
Tris 5 mM, Base Tris 0.61 7.2 ± 23.0 ±
Lavado 3
NaCl 0.25 M, NaCl 14.61 0.1 3.0
 21

pH 7.2
Base Tris 0.61
Tris 5 mM, AIP 7.2 ±
Elución Alcohol < 2.0
17%, pH 7.2 133.0 0.1
Isopropílico
Ácido Fosfórico
Lavado Ácido Ácido Fosfórico 16.9 N/A N/A
0.85%

Equipos de Proceso
Los patines de proceso (Exploradores AKTA) eran servicio (mantenimiento
preventivo) de GE healthcare. Los equipos de proceso (chasis Pall Stax y
Exploradores AKTA) fueron mantenidos por personal de Synageva PD durante
todo el estudio de caracterización. La Tabla 4 a continuación enumera todos los
equipos de hardware usados en este Ejemplo.

Tabla 4. Lista de equipos

Etapa Descripción del Equipo Fabricante Parte No.
Accumet XL550
medidor de Fisher Scientific X13-12005
pH/conductividad
Báscula de Mesa 3.2kg Mettler Toledo ML3002E
Báscula de Piso 50kg Ohaus CD-33
General
Bomba Masterflex L/S
Cole-Parmer 7523-60
(10-600 rpm)
Masterflex I/P 73 C-flex Cole Parmer 06427-73
Masterflex L/S 24
Cole Parmer 06508-24
Bioprene
Chasis Stax Pilot Pall SXLSC02W
Chasis Stax Pilot Pall SXLSC02W
Bomba Masterflex I/P (33-
Cole-Parmer 77410-10
600 rpm)
Clarificación
Celda de Flujo de Presión SciLog 080-696-PSX-5
Monitor de Presión
SciLog 080-690
SciPres
Báscula de Piso 250kg Ohaus CD-33
Explorador AKTA GE Healthcare 29001622
PHIC SDM
Columna XK16 GE Healthcare N/A
A280 Nanodrop 2000 Thermo Scientific N/A
 22

Etapa Descripción del Equipo Fabricante Parte No.

Mini-PROTEAN TGX 4%- 456-1096
Bio-Rad
20% (L/N: 400091244)
Patrones de Color Dual 161-0374
SDS-PAGE Bio-Rad
Plus de precisión (L/N: 35001785)
Celda Tetra Mini
Bio-Rad 165-8000
PROTEAN

El chasis Pall STAX (PN# SXLSC02W) se instalaron usando los filtros de

profundidad STAX enumerados en la Tabla 5 en la siguiente configuración (40 µm,
3-6 µm y 0,1-0,3 µm) y un filtro de 0,2 µm adicional Sartobran P.
Chasis #1: (inferior) Colector → T2600 → Placa de ventilación (superior)
Chasis #2: (inferior) Colector → K200P → Placa de ventilación → Colector
→ Bio10 → Placa de ventilación (superior)
Cada filtro se intercala entre un colector de 1.5" de entrada/salida (P/N:
7.008.225) y una placa de ventilación superior. Se determinó el volumen de
retención de cada filtro individual empíricamente durante el flujo inicial de agua.

Tabla 5. Equipo de filtración de profundidad

Relación Vol de
Tamaño de Filtros Stax
Corrida Filtro de Carga Retención
Poro (um) (S.A. m2)
(L/m2) (L)
T2600 20 40 1.0 6.5
K200P 20 3-6 1.0 6.0
1
BIO10 20 0.1-0.3 1.0 5.5
Sartobran P 160 0.22 1.8 1.35
T2600 20 40 1.0 6.5
K200P 20 3-6 1.0 6.0
2
BIO10 40 0.1-0.3 0.5 3.8
Sartobran P 160 0.22 1.8 1.35
T2600 20 40 1.0 6.5
K200P 20 3-6 1.0 6.0
3
BIO10 40 0.1-0.3 0.5 4.0
Sartobran P 160 0.22 1.8 1.35

Las columnas XK 16/20 (GE Healthcare) se utilizaron para todos los

empaques de columna de la cromatografía de interacción hidrofóbica de fenilo
 23

(PHIC, por su sigla en inglés). Toda la cromatografía se realizó en un explorador

AKTA equipado con la versión de software Unicorn 5.31 (GE Healthcare).
Procedimientos
Antes de iniciar la etapa de clarificación, las alícuotas de clara de huebo
congelada (un total de 20 L) se descongelaron a 2-8°C durante 48-72 horas. La
clara de huevo descongelada se combinaron en un tanque de polipropileno de
tamaño apropiado (25 L) con el papel protector estéril (Thermo Scientific / Hyclone
P/N 343050-0005). La clara de huevo combinada fue mezclada hasta la
homogeneidad utilizando un mezclador superior (330 rpm) a 2-8°C. A
continuación, la clara de huevo combinada fue acondicionada al pH objetivo a
través de la adición de acetato de sodio 5.7 M a pH 4,0. La Tabla 6 muestra el
volumen de acetato de sodio 5.7 M añadido para cada corrida de clarificación para
alcanzar el pH objetivo. El pH se controló durante más de 2 horas para asegurar
que el pH objetivo se lograra.

Tabla 6. Acidificación de clara de huevo combinada

Volumen Vol. Acetato
Acetato pH pH Tiempo de
de la pH Acetato 5.7 M
Corrida 5.7 M Inicial Final Acidificación
Piscina Objetivo 5.7 M (% p/p)
(% v/v) (h)
(L) (mL)
1 20 6.0 180 0.94 0.90 N/A 5.94 18
2 20 5.7 245 1.27 1.22 8.11 5.67 24
3 20 6.3 164 0.83 0.80 8.21 6.25 6

Antes de la filtración, los filtros se enjuagaron individualmente con 80 L/m2

con agua RO/DI filtrada. Durante el enjuague con agua, el volumen de retención
para cada filtrada fue determinado empíricamente. Al terminar el enjuague con
agua, los filtros se sondearon en un tren continuo y se enjuagaron con 16 L/m2 de
tampón de equilibrado de PHIC (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 140 mM,
pH 6.0). El enjuague del tampón terminó cuando el pH y la conductividad del
efluente cumplieron las especificaciones del tampón de enjuague (por ejemplo, pH
6.0±0.1, conductividad 16.0±2.0). La clara de huevo combinada se cargó en el tren
de filtro usando un tubo de inmersión de 3/8” (tubo I/P 73 Cole) a 1.0 L/min con
mezcla continua (mezclador superior, 300 rpm). Se recogió el 80% del volumen de
retención medido, acumulativo (~ 13.2 L) y dirigido a los residuos. El filtrado fue
entonces recogido en un recipiente de tamaño adecuado separado hasta que el
precipitado de baja densidad congelado entró en el tubo de inmersión. Después el
tren de filtración se enjuagó con 1.5 volúmenes de retención (~ 25 L) con un
 24

tampón de equilibrado de tampón. El filtrado final se mezcló bien mediante una

paleta de tanque limpio para asegurar la homogeneidad antes del muestreo. El
filtrado se almacenó a 2-8°C durante la noche antes de la separación PHIC.
Antes de la separación PHIC, el filtrado almacenado a 2-8°C se calentó
utilizando un baño de agua a temperatura ambiente. El filtrado se filtró en segundo
lugar a través de un cartucho Sartobran 150 (0.45um/0.22um, P/N 5231307H4-
00) para generar la carga de PHIC final. La Tabla 7 enumera los tampones y los
parámetros en proceso utilizados.

Tabla 7. Etapas de operación unitaria de cromatografía PHIC

Velocidad Velocidad
Etapa Tampón CV Linear de Flujo
(cm/h) (mL/min)
Fosfato de Sodio
Equilibrado 20mM, NaCl 140mM, 5 120 cm/h 4.02
pH 6.0
Carga 60 cm/h 2.01
2.01
Fosfato de Sodio (1CV)
Lavado 1 8 120 cm/h
5mM, pH 6.0 4.02
(7CV)
Tris 5mM, NaCl 1M,
Lavado 2 8 120 cm/h 4.02
pH 7.2
Tris 5mM, NaCl
Lavado 3 4 120 cm/h 4.02
0.25M, pH 7.2
Tris 5mM, AIP 17%, UV

Pre-Elución 120 cm/h 4.02
pH 7.2 40mAU
Tris 5mM, AIP 17%, UV

Fracción 1 120 cm/h 4.02
pH 7.2 800mAU
Tris 5mM, AIP 17%,
Elución 1.9 120 cm/h 4.02
pH 7.2
Tris 5mM, AIP 17%,
Post Elución 2.0 120 cm/h 4.02
pH 7.2
60 cm/h
Tira RO/DI 5 Flujo 2.01
ascendente
60 cm/h
Lavado Ácido Ácido Fosfórico 0.85% 3 2.01
Flujo
 25

Velocidad Velocidad
Etapa Tampón CV Linear de Flujo
(cm/h) (mL/min)
ascendente
60 cm/h
Enjuague con
RO/DI 5 Flujo 2.01
Agua
ascendente
60 cm/h
Flujo
CIP NaOH 0.5N 3 ascendente 2.01
(Retención
1h)
60 cm/h
Enjuague con
RO/DI 5 Flujo 2.01
Agua
ascendente
60 cm/h
Almacenamiento Etanol 20% 3 Flujo 2.01
ascendente

Resultados y discusión
(1) Carga directa de la clara de huevo acidificada (es decir, sin etapa de
asentamiento)
Inicialmente, se llevó a cabo una corrida de punto central único ("Corrida 1";
escala 1:20; 20 L de clara de huevo acidificada a un pH de aproximadamente 6)
para evaluar el impacto de la carga directa (sin asentamiento, ración de carga de
20 L/m2) en el rendimiento de la filtración de profundidad con el fin de establecer
un modelo a escala experimental representativo. Para cada filtro (es decir, T2600,
K200P, Bio10), aunque la presión de alimentación de entrada en el filtro se
incrementó linealmente a lo largo de la carga de clara de huevo acidificada, la
presión diferencial no excedió 10 psid. Además, la presión de alimentación no
aumentó aún más durante el enjuague de tampón y exhibió una disminución
dramática en el filtro T2600. Estos resultados sugieren que la carga directa de la
clara de huevo acidificada a los filtros no bloqueó significativamente los filtros
durante esta corrida.
Los resultados de la recuperación de proteína se resumen en la Tabla 8 a
continuación. Como se muestra en la Tabla 8, la recuperación de proteína
después de la etapa de clarificación cumplió con la expectativa objetivo (> 70%).
 26

Tabla 8. Recuperación de proteína después de la clarificación

Resultados Proteína
Volumen
Corrida 1 Prom. Aju Recuperada
(mL)
(U/mL) (mg)
Piscina de Clara de Huevo 199.5 20000 15344.6
Piscina de Clara de Huevo
253.4 20000 19493.6
Acidificada
Piscina de Clara de Huevo
122.8 32700 15438.2
Clarificada
Rendimiento Etapa Clarif* (Clara
100.6%
de Huevo Descongelada)
Rendimiento Etapa Clarif* (Clara
79.2%
de Huevo Acidificada)

* Basado en Actividad Enzimática

El rendimiento de la columna de PHIC de la Corrida 1 era comparable a los

resultados obtenidos de corridas incluyendo una etapa de asentamiento de la clara
de huevo acidificada. Además, la pureza de las proteínas se midió mediante un
análisis de SDS-PAGE usando 4-20% de gel de Tris-glicina. Las fracciones de
eluyente de PHIC de la Corrida 1 no revelaron diferencias en el patrón de bandas
en comparación con corridas incluyendo una etapa de asentamiento. Estos datos
sugirieron que la carga directa de la clara de huevo acidificada durante la
clarificación (es decir, la filtración) no tuvo impacto en la recuperación de proteínas
o en el rendimiento de PHIC en términos de rendimiento y pureza.
Los resultados anteriores sugieren que la clara de huevo acidificada se
puede cargar directamente a los filtros durante la etapa de clarificación sin pasar
por una etapa de asentamiento. A continuación, este método se aplicó a las
corridas de estudio de Robustez (es decir, Corridas 2 y 3) descritas en la siguiente
sección.
(2) La robustez de la acidificación de la clara de huevo
Una diseño experimental de 2 factores, 2 niveles (alto/bajo, baja/alta) se
utilizó para evaluar la robustez de la etapa de acidificación de la clara de huevo.
Las condiciones experimentales se definen en la Tabla 6. En la Corrida 2, la
acidificación se llevó a cabo durante 24 horas para lograr un pH final de 5.67 (es
decir, aproximadamente 5.7). En la Corrida 3, la acidificación se llevó a cabo
durante 6 horas para lograr un pH final de 6.25 (es decir, aproximadamente 6.3).
Los resultados muestran que ambas corridas exhibieron aumentos de presión de
 27

alimentación lineales comparables y presiones máximas de alimentación debido al

aumento del ensuciamiento del T2600. Se observó una presión de alimentación
máxima más baja en la Corrida 2, la cual se cree que es debido a una correlación
entre el pH de la clara de huevo y la viscosidad de la clara de huevo (es decir,
menor pH de la clara de huevo resulta en menor viscosidad de la clara de huevo).
En ningún caso la presión de alimentación excedió 10 psig, mostrando un
rendimiento comparable al de la Corrida 1.
Después de la etapa de clarificación, las recuperaciones de proteína en las
Corridas 2 y 3 fueron, respectivamente, 71% y 83%, lo que cumplió con las
expectativas objetivo de (es decir, ≥ 70%) y fueron comparables con la Corrida 1
(es decir, 79%). Después de la separación PHIC, los rendimientos de proteína en
las Corridas 2 y 3 fueron, respectivamente, 59% y 68%, los cuales fueron
comparables con los obtenidos de las corridas incluyendo una etapa de
asentamiento. Las superposiciones de cromatogramas comparando las Corridas 2
y 3 ambas con la Corrida 1 confirmaron el rendimiento de la columna comparable.
Los resultados anteriores sugieren que la variación del pH de acidificación y
el tiempo no dieron lugar a ningún impacto negativo significativo en relación con la
actividad enzimática o el rendimiento. Por lo tanto, la etapa de clarificación fue
robusto cuando se realiza dentro de los dos rangos de prueba (es decir, pH de
acidificación 5.7-6.3 y tiempo de acidificación de 6-24 horas).
(3) Estabilidad en proceso de la clara de huevo
Se realizaron estudios de retención de proceso para definir los tiempos de
retención máximos para siguientes tres puntos de retención de operación unitaria:
(1) clara de huevo descongelada (2-8°C), (2) clara de huevo acidificada (2-8°C y
temperatura ambiente), y (3) clara de huevo aclarada (2-8°C y temperatura
ambiente). La estabilidad del producto (en términos de actividad enzimática) se
evaluó en un período de tiempo de 72 - 96 horas. Se realizaron dos estudios de
estabilidad independientes para evaluar el impacto sobre la varianza del
parámetro de aclaración sobre los tiempos de retención de producto en las etapas
de clara de huevo acidificada y aclarada. Se tomaron alícuotas Sesenta mL (dos
para cada uno de clara de huevo acidificada y aclarada) de cada uno de los dos
experimentos de robustez anteriores (es decir, las Corridas 2 y 3) y almacenadas
a 2-8°C o temperatura ambiente. Muestras de 1.5 ml se tomaron cada 24 horas ya
fuera hasta 72 horas (pH 5.7/24 horas) o 96 horas (pH 6.3/6 horas). Por falta de
tiempo, un estudio de estabilidad no se llevó a cabo en la Corrida 1 (punto central).
Los parámetros de diseño de estabilidad se resumen en la Tabla 9 a continuación.
 28

Tabla 9. Diseño de estabilidad en proceso

Objetivo Parámetros de Estudio
Temp de
de Temp Tiempo
Punto de Retención Tiempo de
Proceso de de
Retención Comercial pH Acidificación
Comercial Estudio Retención
(°C) (h)
(hr) (°C) (h)
Clara de 2-8 N/A N/A
huevo 72 – 96 2-8 0 – 168*
2-8 N/A N/A
congelada
Clara de 6 hr 2-8 0–72 (24h)
5.7–
huevo (Rango de 2-8 6-24
TR** 6.3 0 – 96 (6h)
acidificada 6 – 24 hr)
≤ 6 hr (sin 2-8 0–72 (24h)
Clara de refiltración)
5.7–
huevo ≤ 24 hr TR o 2-8 6-24
TR** 6.3 0 – 96 (6h)
clarificada (con
refiltración)

* T=0 equivale al comienzo de la Descongelación (tiempo de retención adicional

incluyendo el tiempo de descongelación)
** TR=18-25°C (Promedio: 22°C)

Los resultados muestran que la actividad enzimática de los tres puntos de

retención en proceso (clara de huevo descongelada, acidificada, y aclarada) se
mantuvo estable durante la totalidad del tiempo de estudio (hasta 96 horas) a 2-
8°C. Además, la variación ya fuera del pH de acidif icación o el tiempo de
acidificación en general no impactó negativamente en la actividad enzimática. Un
único conjunto de parámetros de ensayo (pH 5.7, temperatura ambiente) para el
punto de retención de clara de huevo acidificada exhibió una disminución de ~20%
en la actividad enzimática. Sin embargo, el objetivo de almacenamiento de
proceso comercial actual para la clara de huevo acidificada es 2-8°C y, por lo
tanto, esta observación no es un riesgo para el proceso comercial. Basándose en
los datos, la clara de huevo descongelada/combinada fue estable durante hasta
168 horas (incluyendo el tiempo inicial de descongelación de 72 horas) a 2-8°C, la
clara de huevo acidificada fue estable hasta 96 horas a 2-8°C y la etapa de clara
de huevo clarificada fue estable hasta 96 horas a 2-8°C o temperatura ambiente.
(4) Estudio de aclaramiento de ADN suplementario
 29

Aunque la clara de huevo en sí no contiene ADN, el proceso de recolección

de clara de huevo puede resultar en la presencia de ADN genómico anfitrión a
través de la introducción de cantidades menores de yema de huevo en la piscina
de clara de huevo. La clara de huevo acidificada y aclarada derivada de los
estudios de las Corridas 1-3 anteriores se analizaron para determinar ADN
genómico anfitrión. Los análisis revelaron lo siguiente:
1. Se detectó ADN en la clara de huevo acidificada y combinada
2. Se identificó un aclaramiento de ADN significativo durante la etapa
de Clarificación.
Estos datos sugirieron que, además del aclaramiento de la proteína anfitrión
de la clara de huevo, la etapa de clarificación proporciona un medio para eliminar
el ADN genómico anfitrión de la piscina de producto.
Otras realizaciones están dentro del alcance de las siguientes
reivindicaciones.