Fundamento de la

Tincin de Gram
1. Las bacterias Gram positivas, fijan el
colorante cristal violeta (colorante
primario), que al unirse al lugol (mordiente),
forman un complejo insoluble en agua,
debido a que las bacterias GP, poseen en su
pared celular, RNA en forma de
ribonucleato de magnesio. Este complejo
imposibilita que el colorante cristal sea
barrido por el alcohol acetona, quedando
teida de color morado.

2. Las bacterias Gram negativas, no poseen

este compuesto en su pared celular, por lo
tanto no forman el complejo insoluble, se
tien con el ltimo colorante ( fucsina
bsica) que es de color rosado.
Material
es Equipo:
Mechero de Bunsen

Microscopio ptico
Asa bacteriolgica

Portaobjetos

Varillas de soporte Reactivo

Gasas
s
Cristal Violeta
Piseta

Solucin de Lugol
Muestra
Alcohol acetona
Aleatoria
Aceite de
inmersin
 Tcnica

Durante el En cambio, por el

proceso de alto contenido
lipdico de la
La tincin de decoloracin
Posteriormente pared de los Gram
violeta es un con alcohol- negativos, el
se suma el
colorante que acetona, pared alcohol-acetona
lugol que es
penetra la de los Gram genera poros , por
mordente y se los cuales, escapa
pared celular positivos
forma un el cristal violeta,
de bacterias impide la salida
complejo con el la bacteria se
Gram positivas del colorante
cristal violeta. decolora y tie de
y negativa. manteniendo la color rojo con el
coloracin colorante de
violeta. contraste.
 1. Realizar frotis delgado del
material a estudiar y dejar secar.
2. Fijar el material en el portaobjeto
pasndolo 3 4 veces a travs
de la llama de un mechero
Bunsen.
3. Colocar el frotis sobre un soporte
para tincin y cubrir la superficie

Pasos
con solucin de cristal violeta
por el lapso de 1 min.
4. Lavar con agua destilada o buffer.
5. Cubrir el frotis con solucin de
yodo, durante 1 min.
6. Lavar nuevamente con agua.
7. Cubrir la placa con decolorante
de alcohol acetona hasta que
no desprenda mas el color
violeta, (10 seg.).
8. Lavar con agua corriente.
9. Cubrir la placa con safranina
durante 1 min.
10. Lavar con agua corriente y
colocar la placa en una posicin
que drene el exceso de agua y el
frotis seque.
 Paso N 1
Limpiar el portaobjetos y
prender el mechero de
bunsen.

Colocar una gota de agua

en el portaobjetos.
Esterilizar el asa
bacteriolgica.
 Paso N 2

Tomar una pequea muestra y

diluirla en el portaobjetos.
Realizar frotis delgado del material
a estudiar y dejar secar.
Despus esterilizar el asa
 Paso N4
Fijar la muestra al
calor flamendola en
el mechero Bunsen,
cuidando no quemar la
muestra.

Colocar el portaobjetos sobre un

soporte para tincin
 Paso N 5
Tapizar la superficie con solucin de
cristal violeta por el lapso de 1 min.
Paso N6
Lavar con abundante agua
(Puede ser destilada o buffer)
el exceso de colorante.

Tapizar con
lugol
(solucin
de yodo),
durante 1
min y lavar
nuevament
e con
agua.
Paso N7
Decolorar la placa con decolorante de alcohol acetona hasta
que no desprenda mas el color violeta aproximadamente
30 seg

Lavar con abundante agua para eliminar el resto de

decolorante.
Paso N8
Teir la placa con safranina
durante 1 min.

Lavar con abundante agua

corriente para eliminar el
colorante de contraste y colocar
la placa en una posicin que
drene el exceso de agua y el
frotis seque.
Paso N9
Secar la preparacin.

Observar al microscopio, con

objetivo de inmersin (100X)
Resumen de los pasos de

la Tincin de Gram

Realizar frotis delgado del material a
estudiar, dejar secar al aire.
Fijar el material en el portaobjeto
pasndolo 3 4 veces a travs de la
llama de un mechero Bunsen.
Colocar la lmina sobre un soporte
para tincin y tapar la superficie con
solucin fucsina fenicada por 3 min.
Mientras se calienta la placa de la
siguiente manera:
Pasar la llama por debajo de la
placa, hasta la emisin de vapores,
dejar helar. Repetir esta operacin 3
veces.
Tcnica de
tincin de
Ziehl- Neelsen
Es unatcnica de
tincindiferencial rpida
y econmica, usada para
la identificacin de
bacterias cido-alcohol
resistentes (BAAR) , como
M. tuberculosis o el
Phylum Apicomplexa
(coccidios intestinales)
entre otros.

Lavar la placa con abundante agua

corriente para eliminar el exceso de
colorante.
 Decolorar Dejar secar
con la la
Llenar la
solucin de preparacin
placa con
alcohol y examinar
azul de Lavar con
cido hasta Lavar la al
metileno o agua el
que el placa con microscopio
con cido exceso de
extendido agua. aplicando
pcrico por colorante.
no elimine una gota de
el lapso de
mas aceite de
1 min.
colorante, inmersin
30 seg. X100.
 Factores a considerar en la
tincin de Gram

No se debe sobrepasar los

tiempos de tincin y
decoloracin.
*Los
Gram+pueden
Los cultivos viejos hacen que hacerse Gram- al
las bacterias Gram positivas se aumentar la
tian parcial o totalmente de acidez.
color rosa.
*Los Gram-
Hay que tomar en cuenta que pueden hacerse
el agua usada en el frotis se Gram+ al
encuentre en el rango de Ph 7- aumentar la
7.8 ya que: alcalinidad.