Manual Brucelosis SENASA 2009 PDF

SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA
Manual de Diagnóstico serológico de Brucelosis Bovina Página 1 de 95

AUTORIDADES
Dr. Jorge Amaya

Presidente
Ing. Agr. Carlos Paz

Vicepresidente
Ing. Agr. Diana Guillén

Gerente General
Lic. Verónica Torres Leedham

Directora de Laboratorio y Control Técnico
Dr. Jorge Rodríguez Toledo

Coordinador General de Laboratorio Animal

OBJETIVO
El presente Manual pretende colaborar con los Laboratorios que se habiliten en la Red de Laboratorios
de SENASA para el diagnóstico serológico de la Brucelosis Bovina.
Contiene algunas normas de carácter práctico, requisitos técnicos y la trascripción de las técnicas que el
Programa de Control y Erradicación de la Brucelosis Bovina, considera como prueba oficiales.
Las mencionadas técnicas son las internacionalmente reconocidas y recomendadas por la

ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL (OIE) y EL SENASA
Los Laboratorios de Red deberán ejecutar las técnicas siguiendo las Buenas prácticas de Laboratorio
establecidas por el SENASA
Versión 3.0/2009 Elaborado por:

M.V. MSc, Ana M. Nicola
M.V., Sebastián Elena
Aprobado por: Dr. Jorge Rodríguez Toledo

Lic. Verónica Torres Leedham

INDICE
Definiciones y Abreviaturas 5
Introducción Brucelosis Bovina 6
Medidas Generales de Bioseguridad y Seguridad 9

en el Laboratorio
Pruebas de screening con antígenos 14

tamponados en placa (BPA y RB)
Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo 17
Pruebas de anillo en leche 23
Elisa Indirecto 27
Guía de problemas y soluciones 38
ELISA por competición 40
Ensayo de Polarización Fluorescente 46
Fijación de complemento 49
Normativa vigente 72
Informe de la Subcomisión Técnica de la 90

Comisión Nacional de Brucelosis
Referencias 93

Definiciones/Abreviaturas
- Ag: Antígeno
- BPA: (Buffered plate antigen) Aglutinación con antígeno buferado en placa
- CELISA: Enzimoinmnnoensayo competitivo
- C’: Complemento de cobayo
- DILAB: Dirección de Laboratorios y Control Técnico
- ELISA: Enzimoinmunoensayo
- FC: Fijación de Complemento
- FPA: Ensayo de Polarización Fluorescente
- IELISA: Enzimoinmnnoensayo Indirecto
- LPS: Lipopolisacárido
- IgG: Inmunoglobulina G
- IgM: Inmunoglobulina M
- SAT.: Seroaglutinación en tubo
- 2-ME: 2- Mercapto etanol
- M: Molar
- MRT (PAL): Prueba de anillo en leche
- OIE: Organización Mundial de Sanidad animal
- PA: Poder anticomplementario
- RENSPA: Registro Nacional Productor agropecuario
- UI/ml: Unidades Internacionales por mililitro
- UIFC: Unidad Internacional fijadora del complemento
- UC: Unidad de complemento
- UH: Unidad de hemolisina
- SH: sistema hemolítico
- TV: Tampón veronal calcio- magnesio

INTRODUCCIÓN
BRUCELOSIS BOVINA
(Manual OIE-5ta Edición-2004)
En el ganado bovino la brucelosis suele estar causada por biotipos de Brucella abortus. En algunos
países, particularmente en el sur de Europa y en el oeste de Asia, donde el ganado se asocia con
ovejas o cabras, la infección puede ser también debida a B. melitensis. En ocasiones, B. suis puede
causar una infección de las mamas en el ganado bovino pero no se ha descrito que origine abortos
Normalmente la enfermedad es asintomática en hembras no gestantes. Después de la infección
por B. abortus o por B. melitensis, las hembras adultas en gestación desarrollan una placentitis que
por lo general conduce al aborto entre el quinto y el noveno mes de gestación. Incluso en ausencia
de aborto se produce gran excreción de microorganismos a través de la placenta, los líquidos
fetales y las descargas vaginales. Las mamas y los ganglios linfáticos asociados también pueden
infectarse y los microorganismos pueden aparecer en la leche. Las gestaciones posteriores llegan
por lo general a término, pero la infección uterina y la mamaria se repite, con un número reducido
de microorganismos en los productos del parto y en la leche. En las infecciones agudas, el
microorganismo está presente en la mayoría de los ganglios linfáticos. Los machos adultos pueden
desarrollar orquitis, y la brucelosis puede causar esterilidad en ambos sexos. Una manifestación
corriente de la brucelosis en algunos países tropicales son los higromas, por lo general en las
articulaciones de las patas, que pueden representar el único indicador de la infección; con
frecuencia, el líquido de los higromas está infectado por Brucella.
La brucelosis se ha descrito también en el camello de una joroba (Camelus dromedarius) y en el de

dos jorobas (C. bactrianus) como consecuencia de contactos con rumiantes infectados con B.
abortus o B. melitensis. Además, se ha observado en el búfalo doméstico (Bubalus bubalus),
bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus
elaphus), así como en el búfalo africano (Syncerus caffer) y en varias especies de antílopes
africanos. Las manifestaciones de la brucelosis en estos animales son similares a las del ganado
bovino.
El manual de bioseguridad para laboratorios elaborado por la Organización Mundial de la Salud

(OMS) clasifica a los microorganismos del género Brucella en el Grupo de Riesgo III. La brucelosis
se transmite fácilmente al hombre y causa una enfermedad febril aguda –la fiebre ondulante- que
puede convertirse en crónica y producir complicaciones graves que afectan a los músculos
esqueléticos, al sistema cardiovascular y al sistema nervioso central. A menudo la infección se
debe a una exposición profesional y se adquiere por vía oral, respiratoria o conjuntival, pero el
riesgo mayor para la población general es la ingestión de productos lácteos contaminados. Los
veterinarios y granjeros que manejan animales infectados, fetos abortados o placentas, están
expuestos a riesgo laboral. La brucelosis es una de las enfermedades de más fácil adquisición en el
laboratorio, y se deben observar precauciones de seguridad muy estrictas cuando se manejen
cultivos y muestras infectadas, como los productos del aborto. Existen recomendaciones
específicas que han de seguirse con materiales infectados por Brucella. La manipulación en el
laboratorio de cultivos vivos o de material animal contaminado es peligrosa y debe realizarse en un
nivel de contención 3 o superior, para reducir la exposición ocupacional. Para manejar grandes
cantidades de Brucella se recomienda también un nivel de contención 3, como mínimo.
La evidencia genética e inmunológica indica que todos los miembros del género Brucella están
estrechamente relacionados, y se ha propuesto (aunque aún no está aceptado por el Subcomité
de Taxonomía) que el género contenga una sola especie de la que las especies clásicas (abortus,
melitensis, etc.), que serían entonces meros biotipos (para una revisión. Sin embargo existen
diferencias reales entre las principales variantes en cuanto a preferencia de hospedadores y a la
epidemiología, así como evidencias moleculares de variaciones genómicas. Desde el punto de
vista práctico resulta conveniente mantener la clasificación de las seis especies clásicas: Brucella
abortus, B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis. Las tres primeras se subdividen en
biotipos por propiedades de cultivo y serológicas. En la última década se han aislado cepas de
Brucella de mamíferos marinos que no pueden adscribirse a ninguna de las anteriores especies

reconocidas. Hay investigaciones en curso para establecer su posición correcta en la taxonomía

del género y se ha propuesto que podrían clasificarse en dos nuevas especies, B. cetaceae y
B. pinnipediae. Por último, Brucella muestra una estrecha relación genética con patógenos y
simbiontes de plantas de los géneros Agrobacterium y Rhizobium, así como con patógenos
animales (Bartonella) y con bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum).
Identificación del agente: La evidencia preliminar de Brucella la suministra la observación de la

morfología de Brucella, por tinción modificada de ácido-alcohol resistentes, en los materiales de
abortos o descargas vaginales, especialmente si está apoyada por pruebas serológicas. La reacción
en cadena de la polimerasa recientemente desarrollada proporciona medios adicionales de
detección. Cuando sea posible, se debe aislar Brucella en medios normales o selectivos cultivando
las descargas uterinas, los fetos abortados, las secreciones de las ubres o tejidos seleccionados,
como los ganglios linfáticos, los testis o el epidídimo. Las especies y biotipos deberían identificarse
por lisis fágica y por criterios de cultivo, bioquímicos y serológicos. Más recientemente, se han
introducido técnicas moleculares como métodos adicionales de biotipado.
Pruebas serológicas y alérgicas cutáneas: Las pruebas con antígeno tamponado de Brucella,
es decir la prueba con rosa de bengala y la prueba de aglutinación tamponada en placa, así como
la fijación de complemento, el enzimoinmunoensayo (ELISA) o el ensayo de polarización de
fluorescencia, son pruebas adecuadas para analizar rebaños y animales individuales. Sin embargo,
ninguna prueba serológica aislada es adecuada para todas y cada una de las situaciones
epidemiológicas. Por tanto, la reactividad de las muestras que son positivas en pruebas de análisis
deben confirmarse utilizando una estrategia confirmativa establecida. La prueba ELISA indirecta o
la del anillo de leche, realizadas con muestras de leche completa, son eficaces para analizar y
controlar la brucelosis en vacas lecheras, pero la prueba del anillo de leche es menos fiable en
grandes rebaños. Otra prueba inmunológica es la prueba cutánea de la brucelina, que puede
utilizarse en análisis o como una prueba confirmativa en rebaños cuando existe reacción serológica
positiva en ausencia de factores de riesgo obvios en rebaños no vacunados.
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
Todos los abortos en el ganado bovino deben considerarse como casos sospechosos de brucelosis
y deberían investigarse. El cuadro clínico no es patognomónico, aunque la historia del rebaño
puede servir de ayuda. El diagnóstico inequívoco de infecciones por Brucella solo puede hacerse
por aislamiento e identificación de Brucella, pero en situaciones en las que no es posible el análisis
bacteriológico, el diagnóstico puede basarse en métodos serológicos. No existe una prueba única
que permita la identificación de Brucella. Normalmente se necesita una combinación de las
características de crecimiento, métodos serológicos y bacteriológicos.
Pruebas serológicas
Ninguna prueba serológica aislada es adecuada en todas y cada una de las situaciones
epidemiológicas, presentando limitaciones en el análisis de animales individuales. Se deben
considerar todos los factores que influyen en la relevancia del método de prueba y de sus
resultados para una aplicación o interpretación diagnóstica específica. Los métodos serológicos que
se describen en esta capítulo son métodos estandarizados y validados, con características de
realización adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas en el comercio
internacional. Esto no impide el uso de pruebas modificadas o similares o la utilización de reactivos
diferentes. Sin embargo, los métodos y reactivos descritos en este capítulo suponen un estándar
de comparación respecto a la realización esperada del diagnóstico.
Debe resaltarse que la prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a
efectos del comercio internacional. La prueba de fijación de complemento (FC) es más específica
que la SAT para el diagnóstico y además posee un sistema estandarizado de unidades. Las
características diagnósticas de algunos inmunoenzimoensayos (ELISAs) y la prueba de polarización

de fluorescencia (FPA) son similares o superiores a la FC y, como son más fáciles de realizar
técnicamente y más consistentes, es preferible su utilización. Se ha comparado el rendimiento de
algunas de estas pruebas.
Para el control de la brucelosis a nivel nacional o local, son adecuadas para el análisis las pruebas
con antígeno tamponado de Brucella, es decir, la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de
aglutinación tamponada en placa (BPAT), así como ELISA y FPA. Las reacciones positivas deben
volverse a probar utilizando una estrategia confirmativa adecuada.
En otras especies, como por ejemplo en búfalos (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo
(Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), y camellos
(Camelus dromedarius, C. bactrianus) la infección por Brucella sigue un curso similar al del ganado
bovino. Para estos animales pueden utilizarse los mismos procedimientos serológicos, pero cada
uno debe ser validado en el animal estudiado.

MEDIDAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD Y SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Las personas que trabajan con agentes infecciosos o materiales potencialmente infectados deben
conocer los riesgos potenciales, y también deben estar capacitados y ser expertos en las prácticas
y técnicas requeridas para manipular dichos materiales en forma segura.
El director o la persona a cargo del laboratorio es responsable de brindar u organizar la
capacitación adecuada del personal.
Cada laboratorio está obligado a desarrollar o adoptar un manual de operaciones o de

bioseguridad que identifique los riesgos que se encontrarán o puedan producirse, y que
especifique las prácticas y procedimientos destinados a minimizar o eliminar las exposiciones a
estos riesgos.
Se debe alertar al personal acerca de los riesgos especiales y se le debe exigir que lea y cumpla las
prácticas y procedimientos requeridos.
El acceso al laboratorio debe ser limitado o restringido
Cada laboratorio debe contener una pileta para el lavado de manos.
El laboratorio deber ser diseñado para que su limpieza sea sencilla.
Las superficies de las mesas de trabajo deben ser impermeables al agua y ser resistentes al calor
moderado y a solventes orgánicos, ácidos, álcalis y productos químicos utilizados para
descontaminar la superficie de trabajo y los equipos.
Los muebles de laboratorio deben tener la capacidad de soportar cargas y usos previstos. Los
espacios entre las mesas de trabajo, gabinetes y equipos deben ser accesibles para su limpieza.
Si el laboratorio tiene ventanas que se abren hacia el exterior, deben estar provistas de
mosquiteros.
Se deben usar ambos, delantales, batas o uniformes de laboratorio de protección adecuados

durante la permanencia en el mismo. Se debe retirar y dejar esta ropa de protección en el
laboratorio antes de dirigirse a otras áreas (por ejemplo, cafetería, biblioteca, oficinas
administrativas), se debe usar además calzado cerrado y cabello recogido.
Se deben usar guantes cuando es posible que las manos entren en contacto con materiales
infecciosos, superficies o equipos contaminados. Puede ser apropiado el uso de dos pares de
guantes. Se deben descartan los guantes cuando están manifiestamente contaminados, y se
retiran cuando se completa el trabajo con los materiales infecciosos o cuando está comprometida
la integridad del guante. Los guantes descartables no se lavan, no se vuelven a usar ni se
utilizan para tocar superficies “limpias” (teclados, teléfonos, entre otras), y no se
deben usar fuera del laboratorio.
No está permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse o almacenar
alimentos para uso humano en áreas de trabajo. Las personas que usan lentes de contacto en
laboratorios deben también utilizar antiparras o un protector facial.
Se debe utilizar protección ocular para los procedimientos en los que se puedan producir
salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos.
La iluminación debe ser adecuada para todas las actividades, evitando los reflejos y el brillo que
puedan molestar la visión.

Las personas deben lavarse las manos luego de manipular materiales viables, luego de quitarse
los guantes y antes de retirarse del laboratorio
Los alimentos se almacenan fuera del área de trabajo en gabinetes o refrigeradores designados y
utilizados con este único fin.
Está prohibido pipetear con la boca; se debe utilizar dispositivos pipeteadores mecánicos.
Se debe aplicar políticas para el manejo seguro de objetos cortantes o punzantes.
Todos los procedimientos se llevan a cabo con precaución a fin de minimizar la creación de
salpicaduras o aerosoles.
Las superficies de trabajo se descontaminan como mínimo una vez por día, luego de finalizar las
tareas y ante todo derrame de material viable.
Todos los cultivos, stocks y otros desechos reglamentados se descontaminan antes de ser
desechados mediante un método de descontaminación aprobado, como por ejemplo, mediante
autoclave. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato son
colocados en un recipiente duradero, estanco y cerrado para su transporte desde el laboratorio.
Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato se embalan de
conformidad con las normas locales, estatales y federales aplicables antes de retirarlos del
establecimiento de acuerdo a las indicaciones de la Ley 24051 de Residuos Peligrosos
Agente: Brucella (B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. suis)
El género Brucella es clasificado por el “Manual de Bioseguridad en el Laboratorio de la OMS”, en el

grupo de riesgo III. El peligro al manipularlo es elevado para el operador, aunque escaso para la
comunidad ya que no se transmite de un individuo a otro.
La brucelosis sigue siendo la infección bacteriana de laboratorio más comúnmente informada.

Tanto B. abortus, B. canis, B. melitensis como B. suis han provocado enfermedades en personal de
laboratorio, Los casos que se han producido ocasionalmente han sido atribuidos a la exposición a
animales experimental y naturalmente infectados, o a sus tejidos.
Riesgos de laboratorio: El agente puede estar en sangre, en el fluido cerebroespinal, en el semen

y, a veces, en la orina. La mayoría de los casos de laboratorio se han producido en instalaciones de
investigación y se debieron a la exposición a organismos de Brucella cultivados en grandes
cantidades. También se han producido casos en el ámbito del laboratorio clínico por aspirar
cultivos bacteriológicos. En estos casos, generalmente, ha habido contacto directo de la piel con
los cultivos o con especimenes clínicos infecciosos de animales (por ejemplo, sangre, descargas
uterinas).
Los aerosoles generados durante los procedimientos de laboratorio, el pipeteo con la boca, las
inoculaciones parenterales accidentales y los aerosoles hacia los ojos, nariz y boca también han
provocado infecciones.
Precauciones Recomendadas: Para las actividades con especimenes clínicos de origen humano o
animal que contienen o que puedan contener Brucella spp. patógena, se recomienda el Nivel de
Bioseguridad 2. Para todas las manipulaciones de cultivos de Brucella spp. patógena y para
estudios experimentales con animales, se recomiendan las prácticas, el equipo de contención y las
instalaciones del Nivel de Bioseguridad 3.

Aseguramiento de calidad en el Laboratorio
Se deberá cumplimentar la reglamentación vigente de acuerdo a las BPL (SENASA), Norma

ISO/IEC 17025, OIE Quality Standard and guidelines for veterinary Laboratorios: Infectious
diseases
Para que los datos del diagnóstico sean uniformes y confiables, deben efectuarse siguiendo
técnicas estandarizadas, con operadores capacitados en la realización y lectura de los resultados,
utilizando equipos y reactivos controlados.
Los procedimientos de laboratorio están sujetos a múltiples causas de error que deben ser
detectados para poder aplicar acciones correctivas. Aún cuando la técnica es realizada de rutina
por un mismo operador, siguiendo la misma metodología, utilizando equipos y reactivos iguales,
las medidas no son idénticas.
Los procedimientos se pueden monitorear mediante el control interno, con la utilización diaria de
sueros con títulos conocidos y el control externo que se refiere al realizado por un laboratorio de
referencia. Este último se puede hacer mediante auditorias que revisen los métodos analíticos, la
organización del trabajo del laboratorio y los procedimientos de control de calidad internos
implementados y realización de ínter laboratorios.
El control permanente de la calidad de los resultados junto a las buenas prácticas de laboratorio
que incluye la utilización de técnicas evaluadas, personal capacitado y operaciones estandarizadas,
garantizan el diagnóstico serológico.
Control de calidad de insumos
Todos los insumos y reactivos que se utilizan en el laboratorio deben estar establecidos con
fórmulas y procedimientos detallados en manuales disponibles en el área de trabajo.
La composición, tipo de envase, identificación y lugar de almacenamiento debe ser la indicada en
los manuales. No introducir cambios que no estén registrados y autorizados por el responsable del
laboratorio.
Todos los insumos y materiales de referencia deben cumplir con las especificaciones registradas.
El agua empleada en el laboratorio de diagnóstico de brucelosis debe ajustarse a las

especificaciones recomendadas para cada uso. En general para el lavado del material de vidrio se
usa agua de tipo III, purificada y con una conductividad específica máxima de 5.0 micromhs/cm,
0.2 mega Homs/cm de resistencia específica (mínima), 0.01 mg/l (como máximo) de silicatos y de
metales pesados.
En la preparación de soluciones para pruebas serológicas, soluciones tamponadas, medios de

cultivo y colorantes se emplea agua purificada de tipo II. Admite como máximo una conductividad
específica de 2.0 micromhs/cm, 0.5 mega Homs/cm (mínimo) de resistencia específica, 0.01 mg/l
(máximo) de silicatos y de metales pesados.
Para preparar reactivos y soluciones de referencia, realizar pruebas de ELISA y reconstituir

liofilizados se utiliza agua de tipo I. Debe tener una conductividad específica de 0.1 micromhs/cm
(máximo), una resistencia específica de 10.0 mega Homs/cm (mínimo) y el mismo límite de
silicatos y metales pesados que los tipos anteriores.
Los reactivos biológicos que se emplean en las técnicas, deben utilizarse de acuerdo a las
especificaciones del Manual de Procedimientos Operativos, respetando las indicaciones para la
conservación, almacenamiento y titulación. (12)
Los reactivos que se comercializan en el país, pasan por el control de calidad de SENASA
(Resolución 1484/93)

Equipos
El laboratorio debe tener un programa de control y mantenimiento de los equipos que emplea en
el diagnóstico.
REGISTRO DE ENTRADA DE MUESTRAS
Los laboratorios deben contar con un registro de entrada de muestras, en el que figure como
mínimo la siguiente información:
Fecha de recepción de muestras
Cantidad de muestras
Especie
Fecha de extracción de muestras
Procedencia: establecimiento, número de RENSPA
Localidad: departamento, partido, provincia
Remitente: veterinario acreditado, nombre y número de

registro, otorgado por la Dirección Nacional de Sanidad
Animal (DNSA) SENASA.
Motivo del envío: saneamiento, traslado, importación, exportación y otros
Fecha de emisión de los resultados.
CARACTERISTICAS Y CONDICIONES DE LAS MUESTRAS
Condiciones de "recepción" de las muestras:
Sangre entera o suero refrigerados.
Suero congelado.
Tubos con identificación clara, de preferencia sobre cinta de papel o similar adherida al
tubo; otra opción es la marcación firme e indeleble en el cuerpo del tubo.
Condiciones de "rechazo" o demora del procesamiento de las muestras:
Falta de planillas protocolo o planillas incompletas.
Sangre entera congelada.
Sangre entera o suero, contaminados.

Sueros hemolizados.
Tubos no identificados.
Los Laboratorios reconocidos y autorizados deberán ser exigentes con la calidad de las
muestras a procesar, como así también con la planilla de toma de muestra firmada por
el veterinario acreditado actuante que debe acompañar a las muestras.
Los informes que elabore el Laboratorio deberán ser precisos para poder desarrollar
adecuadamente las acciones de saneamiento.
DIAGRAMA DE DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE BRUCELOSIS BOVINA en la REPÚBLICA

ARGENTINA
Animales a examinar: Reproductores machos mayores de 6 meses y hembras de 18 meses

con vacunación certificada.
BPA - SAT/2ME
IELISA + CELISA
FC
FPA
FC TECNICA CONFIRMATORIA
MRT (PAL)
VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA
IELISA leche

PRUEBAS SCREENING CON ANTÍGENO TAMPONADO EN PLACA (BPA y RB) PARA LA

DETECCIÓN DE ANTICUERPOS contra Brucella spp
Es una prueba tamiz de aglutinación en placa. Se fundamenta en la inhibición de las aglutininas

inespecíficas a bajo pH. Detecta anticuerpos IgG y algunos IgM específicos.
DESARROLLO
Materiales
1. Micropipetas de 10-100μl.
2. Gradillas.
3. Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45cm de largo x 35 cm de ancho x
15 cm de profundidad) con tapa de vidrio, provista de una placa de vidrio marcada con
cuadrados de aproximadamente 4 cm de lado, que se apoya cerca de la parte superior de
la caja de manera que pueda quitarse y ponerse fácilmente.
La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo
(cubiertas parcialmente), de la mezcla de suero y antígeno. El interior de la caja debe
pintarse de negro opaco.
4. Mezcladores de alambre o plástico
Reactivos
1. Antígeno BPA con volumen celular aprox. de 11%.
2. Antígeno Rosa de Bengala, volumen celular aprox. de 8%.
Conservar el Antígeno en la heladera a 2-8°C.
No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad.
3. Suero control positivo

4. Suero control negativo.
Ejecución del ensayo de BPA
-Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vortex

-Llevar las muestras de suero y antigeno a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC)
-Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante al menos
10 minutos (No usar vortex)
1. Colocar la placa de vidrio (Limpia y seca) sobre el aglutinoscopio.

2. Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 80 μl de suero.
Utilizar un tip para cada suero.
3. Con micropipeta descargar 30 μl de antígeno próximo a la gota del suero, con la precaución de
no tocar el suero para no contaminar con el tip el frasco de antígeno
4. Mezclar bien, con mezclador de alambre o acrílico, el suero con el antígeno abarcando una
superficie circular aproximada de 3 cm de diámetro.
5. Se retira la placa de vidrio y se imprimen 3 movimientos en forma rotativa hasta homogeneizar
la mezcla.
6. Se coloca la placa sobre el aglutinoscopio y se tapa, permaneciendo la luz apagada.
7. Se efectúa una nueva rotación, pasados 4 minutos (se repite lo indicado en el punto 5)
8. A los 8 minutos, rotando de nuevo la placa y con la luz encendida, se procede a la lectura.

Lectura e interpretación de resultados
Las reacciones se clasifican en:
POSITIVAS: Cuando se forman grumos, aún siendo finos (no confundir con artefactos producidos
por impurezas, hemólisis, etc.). Estas muestras deben someterse a las pruebas confirmatorias de
SAT y 2 ME, FPA, ELISA o FC
NEGATIVAS: Cuando la mezcla suero-antígeno es de turbidez homogénea y sin grumos.

Estas muestras se informan como negativas y no se realizan las pruebas complementarias.
Informe de resultados
Se aceptan las siguientes expresiones de resultados en las planillas
Positivo Negativo
+ -
POS Neg
P N

Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala
1. Colocar la placa de vidrio (limpia y seca) sobre el aglutinoscopio.

2. Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 30 μl de suero.
Utilizar un tip para cada suero.
3. Con micropipeta descargar 30 μl de antígeno próximo a la gota de suero.
4. Se mezcla bien, con mezclador de acrílico o alambre, el suero con el antígeno, abarcando una
superficie circular de aproximadamente 2 cm. de diámetro.
5. Se retira la placa de vidrio y se imprimen movimientos en forma rotativa durante 4 minutos a
razón de 10 a 12 movimientos por minuto. Esto se puede hacer en forma manual o con rotadores
diseñados especialmente.
6. Finalizados los 4 minutos y rotando la placa sobre la caja de lectura o aglutinoscopio con la luz
encendida, se procede a la lectura sobre fondo blanco.
Lectura e interpretación de resultados:
Las reacciones se clasifican en:
POSITIVAS: Cuando se forman grumos, aún siendo finos (no confundir con aglutinaciones
inespecíficas producidos por impurezas, hemólisis, etc.). Estas muestras deben someterse a las
pruebas confirmatorias
NEGATIVAS: Cuando la mezcla suero-antígeno es de turbidez homogénea y sin grumos.

Estas muestras se informan como negativas y no se realizan las pruebas complementarias.
Informe de resultados
Se aceptan las siguientes expresiones de resultados en las planillas
Positivo Negativo
+ -
POS Neg
P N
Criterios de aceptación del resultado
En paralelo a las muestras problemas se dispensan los sueros controles negativo y positivo.
Para aceptar los resultados ambos controles deben arrojar la lectura correspondiente. Si los
controles no arrojan la lectura esperada, las muestras se deben repetir utilizando otro frasco de
antígeno.

PRUEBAS DE SERO-AGLUTINACIÓN LENTA EN TUBO
Las pruebas de seroaglutinación detectan la presencia de los anticuerpos IgM e IgG. Los
anticuerpos IgM aglutinan más intensamente que los IgG ya que, al ser las moléculas
pentavalentes, poseen un mayor número de sitios de unión.
El título de un suero se determina por la más alta dilución que causa un determinado grado de
aglutinación y se expresa en unidades que corresponden al recíproco de esa dilución.
La prueba de 2-Mercaptoetanol es una prueba selectiva que detecta solamente la
presencia de IgG, se basa en que los anticuerpos IgM, con configuración de pentámero, se
degradan en cinco subunidades semejantes por la reducción de enlaces disulfuro, debido a al
acción de ciertos compuestos que contienen el radical tiol, tales como el 2- mercaptoetanol. Estas
subunidades conservan sus características de antigenicidad, pero pierden la actividad de
anticuerpo plurivalente y se comportan como univalentes. Aún cuando las subunidades están
integradas por dos cadenas pesadas y dos livianas, al combinarse con el antígeno no originan
complejos suficientemente grandes como para aglutinar, probablemente como consecuencia de
algún impedimento estérico. Las moléculas de IgG, en cambio, no sufren un efecto obvio que
altere su actividad para dar reacciones objetivas como la aglutinación.
La prueba se usa, por lo tanto, como evidencia presuntiva de la presencia de anticuerpos
de la clase IgG.
DESARROLLO
Materiales
1. Micropipetas de 10-100μl.
2. Gradillas.
3. Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45cm de largo x 35 cm de ancho x
15 cm de profundidad) con tapa de vidrio, provista de una placa de vidrio marcada con
cuadrados de aproximadamente 4 cm de lado, que se apoya cerca de la parte superior de
la caja de manera que pueda quitarse y ponerse fácilmente.
4. La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo
(cubiertas parcialmente), de la mezcla de suero y antígeno. El interior de la caja debe
pintarse de negro opaco.
5. Tubos de serología: tipo Wasserman de 13 por 100 mm de vidrio
6. Probetas (100ml y 1000ml).
7. Pipetas 1, 2, 5 y 10ml.
8. Erlenmeyers de volúmenes variados.
9. Pro pipetas
10. Dispensador automático o pipetas graduadas de 1-10 ml.
Reactivos
1. Antígeno Wright, volumen celular aprox. 4.5%.
Conservar el Antígeno en la heladera a 2-8°C.
No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad.
2. Suero control positivo

3. Suero control negativo

Ejecución del ensayo
a) Consideraciones generales:
Las muestras que resulten positivas a BPA deberán procesarse por las técnicas de
aglutinación lenta en tubo y 2-Mercaptoetanol.
La existencia de hemólisis excluye el empleo del método de tubo y placa.
La presencia de hemólisis en las muestras de suero interfiere en la prueba de aglutinación

en tubo, no sólo porque la coloración puede enmascarar la reacción de aglutinación, sino
porque se forma un precipitado como resultado de la acción del fenol que contiene la
solución de antígeno sobre la hemoglobina libre. Es muy difícil distinguir esta falsa reacción
de la aglutinación específica del antígeno.
b) Desarrollo:
Ambas pruebas se realizan simultáneamente procediendo de la siguiente manera:
-Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vortex.
-Llevar las muestras de suero y de antígeno a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC
-Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante 10

minutos (No usar vortex)
-Por cada muestra de suero problema positivo a BPA o RB, colocar en una gradilla 2 hileras de 4
tubos de 13 x 100 mm cada una.
-Identificar el primer tubo de cada hilera con el número correspondiente al suero problema.
-Una de las hileras se destina a la prueba de mercaptoetanol y se marca con una M. La otra hilera,
en la que se hará la prueba en tubo, se marca con una T
-Por cada muestra de suero debidamente identificada, se utilizan tubos en los cuales se descarga
con micropipeta 80 μl de suero en el fondo del primer tubo, 40 μl se distribuyen en el segundo
tubo, 20 μl en el tercero y 10 μl en el cuarto.
-Repetir el procedimiento descrito para depositar las mismas cantidades de suero en la segunda
fila.
-Incluir un suero control positivo y negativo conocido y un control de soluciones sin suero.
-Con una jeringa, dispensador automático o con pipeta de 10 ml, agregar 1 ml de solución de 2-
mercaptoetanol (0,1 M) en cada tubo de hileras M y mezclar muy bien agitando la gradilla.
-Con una jeringa, dispensador automático o con pipeta de 10 ml, agregar 1 ml de solución salina
fenolada al 0,5% a cada uno de los tubos de las hileras T.
-Dejar las gradillas con las mezclas durante 45 a 60 minutos a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC y
posteriormente agregar a cada tubo 1 ml de antígeno de tubo diluido al 2% (0,09%) en solución
salina fisiológica.
-Mezclar bien agitando la gradilla.

Incubación
La incubación se realiza a 36 ± 1 ºC durante 40-48 hs. y tiene por objeto obtener en el

tiempo más corto posible el máximo de aglutinación.
c) Lectura e interpretación de resultados
La lectura de las pruebas se hace después de la incubación. Debe hacerse contra el fondo negro
opaco de la caja de lectura o aglutinoscopio, iluminada desde atrás con una fuerte luz que
atraviese los tubos.
La aglutinación del complejo antígeno-anticuerpo bajo la forma de grumos y su depósito en el
fondo del tubo por gravedad, determina la clarificación de la columna de líquido en el tubo,
manteniéndose los grumos firmes después de una leve agitación del tubo.
La aglutinación es el resultado directo de la unión específica de los anticuerpos presentes en el

suero, con las Brucellas inactivadas contenidas en el antígeno. Las determinaciones se deben basar
tanto en la claridad/turbidez de las mezclas como en el grado de aglutinación y la firmeza de los
grumos al agitar suavemente el tubo.
El título de aglutinación del suero está dado por la dilución del último tubo en el que se presenta
una disminución de la turbidez evidente, manteniéndose los grumos firmes a pesar de una
agitación leve. Si esto ocurre, por ejemplo, en los 3 primeros tubos solamente, el título del suero
(recíproco de la dilución) es de 100 UI/ml de aglutinación.
El grado de aglutinación en cada una de las distintas diluciones puede clasificarse como completo
(+), incompleto (I) o negativo (-).
Aglutinación completa es aquélla en que el líquido de la mezcla suero- antígeno aparece

límpido, translúcido y la agitación suave no rompe los grumos.
Aglutinación incompleta es la que muestra la mezcla suero-antígeno parcialmente turbia y una

suave agitación no rompe los grumos.
Aglutinación negativa es aquélla en que la mezcla suero-antígeno aparece turbia y una suave
agitación no revela grumos.
Fenómeno de zona
En ciertas ocasiones, puede ocurrir que se encuentre aglutinación en las diluciones más altas,
pero no en las diluciones más bajas. Esta inhibición de la aglutinación en las diluciones bajas es
llamada “fenómeno de zona” y está asociado a un exceso en la concentración de anticuerpos en el
suero en las diluciones más bajas, provocando una aglutinación no visible por estar fuera de la
zona de equivalencia de la unión antígeno-anticuerpo.

PRUEBA SIMULTANEA EN TUBOS Y 2- MERCAPTOETANOL
SAT 2- ME
Volumen de suero en ml
0,08 0,04 0,02 0,01 0,08 0,04 0,02 0,01
Dilución correspondiente
1/25 1/50 1/100 1/200 1/25 1/50 1/100 1/200
1 ml DE SALINA FENOLADA (0,5%) 1 ml DE SOLUCION 2-ME (0,1 M)
45-60 Á TEMPERATURA AMBIENTE
1ml DE ANTIGENO AL 2%
ESTUFA A 36 +/-1 º C DURANTE 42-48 hs.
LECTURA

Expresión de Resultados
Ejemplo
Negativo
-
Neg
I 25
25
1/25
I: Incompleto
Interpretación de los resultados para
Hembras mayores de 18 meses de edad vacunadas con vacuna Brucella abortus cepa
19 entre los 3 a 8 meses de edad
BPA SAT 2-ME INTERPRETACION
- NH * NH NEGATIVO
+ ≤ 50 - NEGATIVO
+ I 100 - SOSPECHOSO
+ 100 - SOSPECHOSO
+ 200 - POSITIVO
+ 25 a 50 I 25 NEGATIVO
+ ≤ 25 ≤ 25 NEGATIVO
+ ≥ I 50 ≥ I 50 POSITIVO
* NH: No se hace
Animales no vacunados mayores de 6 meses de edad
BPA SAT 2-ME INTERPRETACION
- NH NH NEGATIVO
+ 25 - NEGATIVO
+ I 50 - SOSPECHOSO
+ 50 - SOSPECHOSO
+ 100 - POSITIVO
+ 200 - POSITIVO
+ ≥ 25 ≥ 25 POSITIVO

Preparación de Soluciones
SOLUCIÓN SALINA 0,14 M
• Cloruro de Sodio 8,5 g

• Agua destilada 1000 ml
SOLUCIÓN SALINA FENOLADA
Solución salina 0,14 M con la adición de 0,5 % de fenol
SOLUCIÓN 2-MERCAPTOETANOL 0,1 M
• 2-Mercaptoetanol 7,8 ml
(Con un grado de pureza del 98% y 1,12 de densidad, corresponde 7,14 ml en 992,86 ml de
Solución salina 0,14 M)
• Solución salina 0,14 M.
(No utilizar solución salina fenolada) 992,2 ml
El 2-Mercaptoetanol es sensible a la luz y al calor y se deteriora rápidamente por exposición al aire. Se

debe conservar en frasco color ámbar herméticamente cerrado a temperatura ambiente
SOLUCIÓN DE ANTÍGENO WRIGHT (SAT) al 2%
• Solución salina 0,14 M.(no utilizar solución salina fenolada) 98ml

• Antígeno Wright (4,5%) 2 ml
• Conservar las soluciones tampones bien cerradas a temperatura ambiente por un plazo no
mayor de 10 días.
• Las soluciones de 2-Mercaptoetanol y antígeno al 2% se pueden guardar por una semana en

heladera
• Descartar toda aquella solución que presenten turbidez o signos de contaminación

PRUEBA DEL ANILLO EN LA LECHE (PAL)
La prueba se diseño para detectar la presencia de anticuerpos en leche. Estos anticuerpos

reaccionan con el antígeno coloreado con hematoxilina formando un complejo antígeno anticuerpo
que queda adherido a la superficie de los glóbulos grasos y asciende con ellos a la superficie,
formando una capa o anillo de crema de color púrpura azulada, de intensidad variable según el
grado de la reacción. Paralelamente, desaparece parcial o totalmente la tinción de la columna de
leche. Si la muestra no contiene anticuerpos específicos, el antígeno no se fijará a los glóbulos
grasos y permanecerá uniformemente distribuido, coloreando la columna de leche, mientras que la
capa de crema forma un anillo de color blanco natural. El porcentaje de grasa de la muestra
influye en la prueba, ya que la formación del anillo de crema en la superficie dependerá del tenor
graso.
La prueba de anillo en leche se usa especialmente como diagnóstico presuntivo para
descubrir rebaños infectados. También se emplea en la vigilancia epidemiológica en áreas de
control de la brucelosis.
Los animales de rebaños positivos a la prueba de anillo en leche deben ser examinados por las
pruebas serológicas para identificar los infectados.
Materiales
1. Tubos de serología: tipo Wassermann de 13 mm por 100 mm, de vidrio claro y

completamente limpio, con tapones.
2. Pipetas 1ml, 2ml, 5ml, 10ml
3. Gradillas
4. Estufa de Incubación 36 +/- 1 ºC
5. Reloj de Laboratorio
6. Heladera (2-8ºC)
Reactivos
1. Antígeno PAL con volumen celular aprox. 4%

2. Muestras de leche problemas
3. Solución de formalina 1%
4. Muestras de leche controles positivo y negativo
Toma de la muestra
a) En el campo, tan pronto se ha llenado el tarro y antes de que la crema suba, revolver bien
el contenido y tomar unos 50 ml de leche. Agregar 1 ml de solución de formalina al 1% por
cada 10 ml de leche. Las muestras, bien identificadas, se transportan refrigeradas hasta el
laboratorio.
b) En las plantas pasteurizadoras o lugares de acopio. Elegir los tanques del menor tamaño
posible, cuya procedencia pueda ser identificada. Mezclar bien la leche de cada tanque
para que la crema represente un término medio y tomar una muestra de unos 50 ml.
Agregar 1 ml de solución de formalina al 1% por cada 10 ml de leche.
Ejecución del ensayo
Las muestras de leche deben mantenerse en refrigeración a una temperatura de 4 a 8ºC

hasta que hayan transcurrido no menos de 24 horas desde su recolección (preferiblemente, 48 a
72 horas). Una hora antes de la prueba, se llevan a temperatura ambiente tanto las muestras de
leche como el antígeno.

a) Mezclar cada muestra invirtiendo varias veces el recipiente (tubo o frasco).
b) Colocar 1 ml de la muestra en un tubo 13 x 100 mm.
c) Agregar 30 µl de antígeno a cada tubo. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias

veces, sin que se llegue a formar espuma. No debe quedar antígeno sobre las paredes.
d) Incubar a 36 +/- 1 ºC durante una hora.
Lectura
- Anillo de crema, blanco; columna de leche, azul.
+ Anillo de crema y columna de crema, del mismo color, o casi igual.

++ Anillo de crema de color más pronunciado que la columna de leche.
+++ Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche tiene aún un poco de color.
++++ Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche es blanca.
Observaciones
a) El exceso o la escasez de crema dificulta la interpretación de la prueba.
b) La agitación vigorosa, así como el uso de leche "homogeneizada" dificulta la

realización de la prueba.
c) El calentamiento de la leche interfiere con los resultados; por lo tanto, la prueba

no se puede efectuar con leches pasteurizadas, a menos que se les agregue crema de
leche sin pasteurizar o que se las diluya con leche fresca de vacas negativas.
d) Cuando la prueba se efectúa el mismo día en que se ha recolectado la leche, se

pueden obtener algunos resultados positivos falsos o dudosos.
e) La leche de calostro puede dar resultados falsos positivos.
f) La leche de vacas con mastitis también puede dar falsos positivos o impedir la
interpretación de la prueba debido al descolorimiento del antígeno.
g) La leche de vacas próximas a secarse puede dar resultados dudosos o falsos

positivos.
h) Hay vacas infectadas con brucelas que no eliminan anticuerpos por la leche.
Estas vacas son positivas en las pruebas de sangre y negativas en la prueba del anillo.
i) Si la leche es de mala calidad por su alto contenido bacteriano, agregar dos gotas
de una solución saturada de bicarbonato de sodio antes de añadir el antígeno.
Modificación de la prueba para tanques muy grandes
Para hacer más sensible la prueba, aumentar la cantidad de leche, manteniendo constante
la cantidad del antígeno (30 µl)
< 150 vacas 1 ml de leche

150 – 450 vacas 2 ml de leche
451- 700 vacas 3 ml de leche

Prueba del Anillo en la Leche con Diluciones
Esta prueba se utiliza para el diagnóstico en la leche de un animal
Técnica
a) Tomar leche en forma independiente de cada cuarto mamario.
b) Agregar 1 ml de formalina al 1% por cada 10 ml de leche y dejar en refrigeración

durante no menos de 24 horas.
c) Hacer una prueba "tamiz", para lo cual se mezclan cantidades iguales de cada
cuarto. Colocar 0,5 ml de la mezcla en un tubo 12 x 75 mm, agregar 0,5 ml de leche
negativa tomada de distintas vacas y 30 µl del antígeno para la prueba del anillo.
d) Incubar a 36 +/- 1 ºC y leer.
e) Si la prueba tamiz da resultado positivo, continuar de la forma siguiente:
I) Disponer en cada una de cuatro filas, 10 tubos de 12 x 75 mm.
II) Colocar 1 ml de leche negativa de vacas distintas en cada tubo.
III) En el primer tubo de cada fila, colocar 1 ml de la leche de un cuarto,

mezclar bien con la leche negativa y transvasar 1 ml al segundo tubo.
Después de mezclar, trasvasar 1 ml al tercer tubo. Continuar así hasta el último

tubo de la fila, del que se descartará 1 ml de la mezcla. Repetir el procedimiento
en las filas restantes.
IV) Agregar 30 µl de antígeno a cada tubo. Mezclar bien, incubar una hora a
37 +/- 0,5 º C y leer.
Interpretación
Un título de 1:16 o superior se correlaciona generalmente con infección por Brucella. Con
frecuencia la infección está localizada en uno o dos cuartos, los cuales coinciden con los cuartos
que obtuvieron el título más alto en la prueba del anillo.

Prueba de vigilancia epidemiológica para muestras individuales o de pool de leche
30 ul de antígeno PAL
NEGATIVO
Mezclar bien por inversión

varias veces
1ml Incubar a 37ºC 60min

leche
POSITIVO

Enzimoinmunoensayo Indirecto (I ELISA)
Todo Kit comercial utilizado debe estar aprobado por SENASA y debidamente
estampillado
El enzimoinmunoensayo Indirecto (I ELISA) permite detectar la presencia de anticuerpos

contra Brucella abortus en animales domésticos y salvajes.
La técnica consiste en la adsorción del antígeno lipopolisacárido liso (LPS) sobre una matriz
sólida (Microplaca de 96 pocillos), a continuación se añade la dilución de los sueros a analizar y
controles y se incuban durante treinta minutos. Después del periodo de incubación, la microplaca
se lava y a seguir se añade el anticuerpo monoclonal de ratón anti IgG1 bovina conjugado con
enzima peroxidasa de rábano rusticano. Se incuba nuevamente la placa treinta minutos. El paso
final de la prueba es la adición de la solución substrato/cromógeno. Después de un periodo de
tiempo de diez minutos, la reacción se frena y se mide fotométricamente.
Si el suero problema contiene anticuerpos anti Brucella (suero positivo), estos se adhieren
al antígeno LPS, y al conjugado a la IgG1, por lo tanto al agregar la solución Substrato/Cromógeno
se produce un cambio de color cuya intensidad esta directamente relacionada con la concentración
de anticuerpos presente en la muestra.
MATERIALES Y EQUIPAMIENTO
Fotómetro de placas automático con filtros (405 nm, 414 nm, 450nm)
Computadora
Agitador orbital de placas
Agitador magnético
Lavador manual o automático de placas
Heladera (2 a 8ºC) y freezer (-20 +/- 5ºC)
Estufa de incubación en el rango de +10ºC a +37ºC
Vortex
Sistema purificador de agua (mínima calidad de agua requerida: destilada o desionizada)
Peachímetro (rango de 0 a 14 ± 0,01 pH)
Balanza analítica
Micropipetas monocanal de volumen variable (0,5 - 10μl), (5 - 50μl), (50 -200μl), (200 -
1000μl)
Micropipetas multicanal de volumen variable (5 - 50μl), (50 - 250μl)
Dispensadores automáticos
Timer o reloj de laboratorio
Pro pipetas
Placas de poli estireno fondo plano de 96 pocillos, NUNC 2-69620 o Polysorp (NO
SUSTITUIR)
Selladores de placas de acetato o parafilm
Cubetas plásticas para pipetas multicanales
Microtubos (para realizar las diluciones previas de los sueros)
Crío tubos de polipropileno para el almacenamiento de los sueros.
Gradillas
Vajilla de cristal (probetas, pipetas, erlenmeyers, etc. de distintos volúmenes)
Toallas o papel absorbente
REACTIVOS
Productos Químicos
ABTS [2,2’-azino bis (3 etilbenzotiazolina 6 ácido sulfónico)] anhidro.PM 548.70

EDTA [(Acido Etilendiaminotetraacético) sal disódica] P.M. 372.24

EGTA [Etillenglicol- bis-(β éter aminoetilo)N,N,N',N' ácido tetraacético] PM 380.40

Peróxido de hidrogeno (agua oxigenada 3%) P.M. 34.01
Acido cítrico anhidro A.C.S. P.M. 192.12
Polioxietilenosorbitano monolaurato (Tween 20)
Bicarbonato de sodio anhidro A.C.S. P.M. 84.01
Carbonato de sodio anhidro A.C.S. P.M. 106.99
Fosfato de sodio dibásico anhidro A.C.S. P.M. 141.96
Fosfato de sodio monobásico A.C.S. P.M. 137.99
Citrato trisódico P.M. 294.10
Cloruro de Sodio A.C.S. PM 58.44
Hidróxido de sodio (lentejas).A.C.S. PM 40.00
Estándares para pH aprobados pH 4.00 ± 0.01
pH 7.00 ± 0.01
pH 10.00 ± 0.01
Productos Biológicos
Todos los productos biológicos enumerados a continuación deben usarse solamente en pruebas in
vitro.
Todos los productos de desecho se consideran sustancias biológicas peligrosas y los recipientes
empleados para la preparación y el uso de estos reactivos biológicos deben ser desinfectados por
procedimientos químicos y/o con el tratamiento de autoclave antes de desecharlos o reutilizarlos.
Ninguno de estos reactivos biológicos ni sus derivados deberán ser distribuidos a ningún otro
laboratorio o persona sin autorización del Laboratorio de Referencia.
Los productos biológicos enumerados a continuación están normalizados y son suministrados por
Laboratorios de Referencia. No se permiten sustituciones.
1. Antígeno Lipopolisacárido liso (SLP-l) de Brucella abortus, cepa 1119-3, en una

concentración final de uso de 1μg/ml, (Brucellosis Centre Expertise, A.D.R.I., Nepean,
Ontario, Canadá).
2. Conjugado: Anticuerpo monoclonal de ratón anti IgG1 bovina conjugado con
peroxidasa de rábano rusticano (M23) (Brucellosis Centre Expertise, A.D.R.I.,
Nepean, Ontario, Canadá).
3. Suero control positivo fuerte (C++)
4. Suero control positivo débil (C+)
5. Suero control negativo (C-)
Todos los productos biológicos liofilizados deberán ser reconstituidos un día antes de ser utilizados.
Es importante no agitar los productos biológicos de forma violenta, evitando la formación de
espuma.
PREPARACION DE LA PRUEBA
Es muy importante asegurarse de la calidad del agua con la cual trabaja en el laboratorio para
preparar las soluciones de trabajo.

Si las muestras presentan una visible contaminación, serán inválidas para su procesamiento y serán
desechadas. Una nueva muestra de sangre será solicitada.
Preparación de los Reactivos
Solución tampón de recubrimiento de antígeno (solución tampón carbonato 0,06M, pH

9,6 ± 0,2).
Pesar en una balanza analítica
Bicarbonato de sodio Na HCO3............... .................. 3,8g

Carbonato de sodio (Na2CO3).................................... 1,93g
Mezclar las drogas en 1 litro de agua destilada Milli-Q y mezclar bien con agitación
El pH de la solución tampón carbonato debe ser 9,6 ± 0,2. De no ser así deséchelo y prepare uno
nuevo. Antes de prepararlo asegúrese que el agua utilizada es de buena calidad, que el medidor de
pH y las balanzas estén bien calibradas, que se utilicen recipientes de vidrio limpios, productos
químicos correctos y que se pesen las cantidades precisas.
Solución de lavado / diluyente (PBS-T) (Solución salina tampón fosfato 0,01 M

más Tween 20 al 0,05 % (v/v), pH 7,2 ± 0,1)
En una balanza analítica pesar:
Fosfato de sodio dibásico Na2HPO4......................... 4.40 g

Fosfato de sodio monobásico NaH2PO4 H2O..............1,26 g
Cloruro de sodio (ClNa)........................................ 34 g
Mezclar las drogas en 4 litros de agua destilada con agitación hasta lograr la disolución
Separar 200 ml para otros usos (Ej.: dilución del conjugado).
Mientras se está homogeneizando agregar a la solución remanente, 1.90 ml de

Tween 20
Medir el pH de la solución tampón que debe ser un pH 7,2 ± 0,1,
Rotular y guardar en envase de polipropileno a temperatura ambiente hasta terminarlo
El Tween 20 es muy viscoso, se debe tener atención en transferir el volumen preciso a la solución
tampón de fosfatos.
La solución tampón de lavado/diluyente (PBS-T) debe ser de pH 7,2 ± 0,1. De no ser así deséchela
y prepare otra.

Solución tampón EDTA-EGTA usada para diluir sueros (15mM EDTA + 15 mM EGTA en
PBS-T, pH 6,3 ± 0,05)
Pesar por separado:
EDTA.............. 1,12 g/100ml de PBS-T

EGTA.............. 1,14 g/100ml de PBS-T
Mezclar bien el EDTA en 100 ml de PBS-T hasta que esté bien disuelto, esto lleva
aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente.
Mezclar bien el EGTA en 100ml de PBS-T hasta que esté parcialmente disuelto, esto lleva
aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente. Disolver el remanente llevando a pH 7 con
(OH) Na 6M
Mezclar volúmenes iguales (50:50) de las soluciones EDTA y EGTA, agregando el EDTA en el
EGTA.
Medir el pH del EDTA/EGTA, este debe ser de pH 6,3 ± 0,1. Si no ajustar el pH con HCl 1M para
bajarlo o (OH) Na 1M para subirlo
Rotular y guardar a temperatura ambiente. Esta solución tampón permanece estable hasta 6
meses.
Hidróxido de Na 6M
Disolver 24 g de (OH) Na en 100ml de agua destilada.
Hidróxido de Na 1M
Disolver 4 g de (OH) Na en 100ml de agua destilada.
Solución tampón substrato (solución tampón de citrato de sodio / ácido cítrico 0,05M,
pH 4,5 ± 0,05).
Acido cítrico (H3C6H5O7)............................. 2,3 g

Citrato trisódico(Na3C6H8O7. 2H20). ........... 3,82 g
Disolver las drogas en 500 ml de agua destilada en agitación

Ajustar el pH que debe ser de 4,5 ± 0,05, rotular y conservar refrigerado en envase de vidrio
hasta terminarlo
Previamente a su utilización debe ser equilibrado a temperatura ambiente.
Solución de tampón substrato/cromógeno
Tampón citrato pH 4,5 ± 0,05 ...................................12ml

ABTS (0,223g/10ml de agua destilada) ............ ........ 300μl
Peróxido de hidrogeno 3%(H2O2) ............................... 60μl
El volumen arriba indicado es el necesario para una microplaca.
Esta solución debe ser preparada inmediatamente antes de su uso

Antígeno concentrado (LPS-l)de Brucella abortus
Reconstituir el antígeno liofilizado con agua destilada estéril hasta el volumen recomendado.
Fraccionar en volúmenes proporcionales según las instrucciones de uso, en viales criogénicos a

20ºC o -70ºC
No guardar el antígeno en recipientes de poli estireno
Conjugado: Anticuerpo monoclonal de ratón anti IgG1 bovina conjugado con

peroxidasa de rábano rusticano, (M4-1 para cabras y ovejas y M167 para cerdos) (Brucellosis
Centre Expertise, A.D.R.I., Nepean, Ontario, Canadá).
Reconstituir el conjugado liofilizado con PBS 0,01 M, pH 7,2 – glicerol (v/v) hasta el volumen
recomendado.
Conservar a -20º C
Opcionalmente se puede reconstituir el reactivo con agua destilada estéril hasta el volumen
recomendado, en este caso, el reactivo se guardará en heladera.
Sueros controles (C++, C+, C-)
Reconstituir los sueros liofilizados con PBS 0,01 M, pH 7,2 – glicerol (v/v) hasta el volumen
recomendado.
Fraccionar, rotular y conservar a -20ºC o -70ºC.
Substrato concentrado (peróxido de hidrogeno - agua oxigenada al 3%)
Separar 10 ml en un recipiente de vidrio oscuro y limpio.
Guardar la fracción y el resto del substrato concentrado en heladera
Reponer la fracción cuando sea necesario.
Cromógeno donante de hidrogeno [2,2’-azino bis (3 etilbenzotiazolina 6 ácido

sulfónico] anhidro.
Pesar en una balanza analítica la cantidad precisa de ABTS según el contenido de agua de la
droga. Ver la siguiente tabla
Contenido de H2O Gramos / 10ml
0,0 0,2195 g
0,5 0,2231 g
1,0 0,2267 g
1,5 0,2303 g
2,0 0,2339 g
Añadir 10 ml de agua destilada, mezclar bien hasta que esté disuelto.

Guardar a + 4º C en un recipiente limpio color caramelo para resguardarlo de la luz.

Manipular el ABTS con cuidado como un potencial mutágeno. Evitar la inhalación y contacto con la
piel durante el pesado del mismo.
La solución de ABTS debe ser de color verde claro. De no ser así antes de desecharla, comprobar
los resultados de la prueba para detectar cualquier anormalidad. Si no se detecta ningún problema,
la solución de ABTS puede ser utilizada, ya que el color depende del colorante utilizado por el
fabricante en la preparación de ABTS. Si los controles de la prueba no son aceptables deberá
verificar si se han pesado las cantidades precisas, si el recipiente estaba limpio, la calidad del agua
destilada utilizada. Si no hay errores en todo lo enumerado se deberá cambiar el ABTS por otro
lote.
EJECUCION DE LA PRUEBA
Es una buena práctica de laboratorio planificar la prueba con antelación. Revisar que todos los
equipos están funcionando apropiadamente y que todos los reactivos y sueros controles y
problemas estén preparados y en volumen suficiente
Para una óptima "performance" de la prueba todas las soluciones guardadas a 4ºC deben ser
equilibradas a temperatura ambiente antes de su uso, Esto tiende a disminuir el efecto de
formación del gradiente térmico dado que las microplacas tienden a "entibiarse" desde los bordes
externos hacia el centro. El gradiente térmico se torna más evidente cuando las placas se apilan en
la estufa de incubación.
Las reacciones biológicas son dependientes de la temperatura, por lo tanto si se produce la
formación del gradiente térmico, los pocillos "entibiados" alrededor del borde externo de la
microplaca, tienden a desarrollar un efecto de fondo ("background") y / o un color específico más
alto que en los pocillos más fríos de las áreas internas de la placa.
Cuando se utilizan micropipetas mono y multicanales es importante asegurarse que éstas estén
calibradas y los tips se ajusten herméticamente y funcionen correctamente (Ej.: los tips deben
llenarse iguales, sin burbujas de aire)
Para cada operación de pipeteo, tips nuevos y limpios deben ser usados. Solo se deben usar las
microplacas recomendadas y éstas no deberán ser reutilizadas. Cualquier cambio en el tipo de
microplaca puede alterar la "performance" del diagnóstico.
Recubrimiento de las microplacas con el antígeno
Agitar vigorosamente el antígeno SLP-l concentrado (preferiblemente con vortex), para asegurar una
dispersión uniforme.
Preparar inmediatamente una dilución de trabajo para obtener una concentración final de 1 μg/ml
de antígeno) con solución tampón carbonato (0,06M, pH 9,6 en un volumen suficiente para el
número de placas que se desea preparar (11ml por placa de la solución de trabajo).
Dispensar 100 μl con pipeta multicanal en cada pocillo de la microplaca. Golpear suavemente a los
lados de la placa para asegurarse la distribución uniforme de la solución en el fondo de los pocillos.
Sellar la placa con una lámina de acetato y dejar incubar durante toda la noche ( ∼ 18 hs) a 25º ±
4°C en estufa o sobre la mesada del laboratorio.
Un conjunto de placas (15 - 20) pueden ser preparadas de esta manera y luego ser congeladas a -
20ºC hasta su posterior uso. El día de la prueba las placas deben ser descongeladas a temperatura
ambiente por aproximadamente una hora.

Es importante que las placas NUNCA sean apiladas unas encima de otras para evitar la formación
del gradiente térmico antes mencionado. Esto es especialmente importante al congelar las placas.
Una vez congeladas pueden ser apiladas.
Adición de los sueros controles y problemas
Preparación de los sueros controles y problemas en solución tampón PBS-T + EDTA/EGTA
Sueros problemas y controles
En el día de la prueba los sueros son descongelados y agitados para asegurar su

homogeneización. Se prepara una dilución 1/50 en tampón PBS-T/EDTA/EGTA en tubos de
vidrio, microtubos o microplacas de polipropileno y se mezcla bien con la ayuda de vortex
o la acción de pipetear. Se recomienda un volumen mínimo de 0,5 ml. (Ej.: 490μl de
tampón diluyente más 10 μl de suero)
Diluir el stock de sueros controles en un volumen suficiente para el trabajo del día
Hay cuatro tipos de controles, el control de conjugado (Cc) consiste en solución buffer
EDTA/EGTA que es usado para el cálculo del porcentaje de inhibición, el control positivo
débil (C+), el control negativo (C-) y el control positivo fuerte (C++)
Todas las diluciones son preparadas y mantenidas a temperatura ambiente.
Para el ELISA con muestras de leche, las muestras de leche son diluidas 1:2 con el mismo
tampón PBS-T/EDTA/EGTA.
Como controles se utiliza los sueros diluidos 1:50
Lavado
Descartar la solución de antígeno de la placa invirtiendo la placa y dando golpes abruptos

hacia abajo. Con lavador manual o equivalente llenar todos los pocillos de la placa con
solución tampón de lavado PBS-T (pH 7,2 ± 0,1), descartar el contenido y repetir tres
veces más, el ciclo de lavado. Después del último lavado se invierte la placa golpeándola
abruptamente sobre papel absorbente. Lavar una placa por vez y no proceder con la
siguiente placa hasta que las muestras y el anticuerpo monoclonal hayan sido
dispensados.
Es importante que la placa no se seque, lo que podría incrementar la actividad inespecífica del
ensayo.
Adición de los sueros controles y problemas.
Después, de cuatro ciclos de lavado y tomando cuidado de no dejar contenido residual en

las microplacas, dispensar 100 μl de dilución de los sueros controles y problemas en los
pocillos correspondientes según el protocolo de trabajo utilizado. La dilución de los sueros
controles son dispensados en primer lugar por duplicado o cuadruplicado según el
protocolo en uso
Se sella la placa y se incuba 30 minutos a temperatura de laboratorio 22 +/- 4 °C

Adición del conjugado
Preparación del conjugado
Diez a quince minutos antes que termine el tiempo de incubación de los sueros preparar la
dilución óptima del conjugado en solución tampón diluyente PBS - T (NO USAR PBS-T +
EDTA/EGTA porque los agentes quelantes pueden afectar adversamente a la enzima.
Es importante no agitar el concentrado del conjugado con vortex, o cualquier acción que pueda
causar espuma. Es suficiente mezclarlo varias veces manualmente por inversión del recipiente.
Adición de la dilución del conjugado
Después de finalizado el tiempo de incubación de los sueros, LAVAR nuevamente las

placas como previamente se explico.
Dispensar 100μl/pocillo en toda la placa de la dilución de uso del conjugado, usando

pipeta multicanal.
Sellar la placa con la lámina de acetato e incubar nuevamente a temperatura de

laboratorio durante 30 minutos.
Asegúrese durante este periodo de incubación de encender el lector de placas por lo menos 15 a 30
minutos antes de la lectura para calentar el equipo y verificar que la fuente de luz esté
funcionando.
No descartar el remanente de la dilución de trabajo del conjugado y de la solución de

substrato/cromógeno, éstas, serán de utilidad para chequear si ocurre un problema con la enzima –
solución substrato /cromógeno.
Ver guía de problemas y soluciones
Adición de la solución de substrato/cromógeno y solución de frenado.
Unos diez a quince minutos antes que finalice el periodo de incubación del conjugado
preparar la solución de substrato/cromógeno
La solución de substrato/cromógeno debe equilibrarse en estufa a 25ºC antes de su uso, ya que si

la solución está fría puede retardar el desarrollo de color e incrementar el riesgo de formación de
gradiente térmico explicado anteriormente.
Una microplaca nueva (sin recubrimiento de antígeno) será utilizada como placa blanco para la
lectura fotométrica.
Finalizado el tiempo de incubación del conjugado, se procederá al LAVADO de la placa

Inmediatamente adicionar 100μl/pocillo de la solución substrato / cromógeno en toda la

placa con pipeta multicanal, comenzando por los ocho pocillos de la primera columna 1(A-
H) de la placa blanco, seguida por los 96 pocillos de la placa problema. Comenzar a
cronometrar el tiempo inmediatamente después de adicionar la solución substrato
cromógeno en la primera columna de la placa blanco.
Transferir la microplaca sobre un agitador orbital a temperatura ambiente por un período

de 10 minutos.
Después de los 10 minutos de incubación dispensar inmediatamente 100μl de la solución

de frenado (SDS 4%) en toda la microplaca, comenzando por la primera columna de la
placa blanco, seguida por la placa problema en el mismo orden que se adicionó la solución
de substrato cromógeno.
Agitar brevemente con el agitador de placas para asegurar la mezcla.
Los pocillos de la placa contienen un volumen final de 200 μl (100μl de solución substrato
cromógeno + 100 μl de solución de frenado).
LECTURA
Como se mencionó anteriormente, es importante encender el equipo de lectura por lo menos 15 a

30 minutos antes para que se caliente y de ésta manera asegurar la uniformidad de la lectura.
Verificar que el filtro correspondiente esté presente. La longitud de onda óptima para el ABTS es
414 nm, pero si éste filtro no está disponible, el filtro 405 puede ser utilizado en su lugar.
Antes de leer las placas asegúrese que no hay presencia de burbujas de aire en los pocillos, lo que
puede causar aberraciones ópticas. Verifique que no hay condensación o suciedad en el fondo de la
placa (Ej.: marca de los dedos, si es necesario rompa las burbujas con la punta de un tip nuevo y
limpie el fondo de la placa con papel tisú.
Diferentes modelos de Lectores de placa pueden tener distintos tiempos de calentamiento y
procedimiento para la lectura blanco. Por favor consulte el manual del fabricante para ver detalles.
Disponer la placa blanco en el carro del lector de placas y proceder a la lectura de la placa blanco.
Continuar con la lectura de la placa problema.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
La recolección y expresión de los datos obtenidos se realiza mediante programas de computación

compatibles diseñados especialmente para este fin.
Los programas de computación específicos automatizan la lectura, calculan e imprimen los

resultados de las pruebas y monitorea el desempeño de los sueros controles.
Cálculo y aceptación de los valores de los controles del ensayo
Los sueros controles de la prueba deben ajustarse a los límites especificados durante la
normalización, el perfeccionamiento y puesta a punto de la técnica.
Una vez obtenidos los valores de DO (Densidad Óptica) los resultados se expresan en
Porcentajes de Positividad (%P), con respecto al Control de suero positivo fuerte (C++),
aplicando la siguiente fórmula:

Valor promedio de DO de cada control

%P = × 100
Valor promedio de DO del C++
Valor promedio de la DO de la muestra problema

%P= × 100
Valor promedio de la DO del C++
Por ejemplo si la OD es 0.300 y C++ es 1.030, nos da
%P = (0.300 ÷ 1.030) x 100 = 29.1%
Los controles del ensayo debe estar dentro de los valores límites establecidos en la
estandarización, optimización e implementación del ensayo
Los controles incluidos en cada kit vienen con un valor de control máximo (UCL) y un valor control
mínimo (LCL) que pueden variar según el kit.
Ejemplo
Controles PP LCL UCL UCL/DO LCL/DO
C++ 87% 113% 1.000 - 1.800

C+ 50% 80%
C- -5% 31%
Cc -4% 8%
Primer nivel de aceptación de los sueros controles
El promedio de los valores duplicados de DO para el control de C++ debe estar dentro de los
límites especificados. En caso contrario se rechaza la microplaca.
Si la microplaca pasa el primer nivel de aceptación de los controles, entonces el valor promedio
de la DO del C++ se usará en el cálculo de todos los valores de % P posteriores para los otros
controles y los sueros de prueba.
Nota: si la microplaca no pasa el primer nivel de aceptación el programa informático sigue

calculando y produciendo resultados de pruebas aunque no tengan sentido.
Segundo nivel de aceptación de los sueros controles
El valor medio del (%P) de cada control (Cc, C++, C+, C-) debería entrar dentro de los límites
especificados.
Si las medias de dos controles cualesquiera que sean (Cc, C-, C+ y C++), no están
comprendidos dentro de los límites especificados, la placa será rechazada por el
programa informático.
Cualquier combinación de dos de los cuatro controles, resultará en el rechazo de

la placa.

Resultado del ensayo
Valor de corte negativo
El valor de corte negativo para cada especie (ver apéndice)
Resultados positivos
Las muestras que resulten positivas según el valor de corte establecido deberán ser repetidas
Si el valor de la media del control C+ está por encima del límite superior (UCL), todas las muestras
positivas deben ser repetidas. Los resultados negativos pueden ser informados
Si el valor de la media del control C+ está por debajo del límite superior (LCL), todas las muestras
negativas deben ser repetidas.
La condición de una muestra problema se determina de la siguiente manera:
El estatus de una muestra problema se determina de la siguiente manera en la República

Argentina. Cada país deberá validar y establecer el valor de corte de acuerdo a su
realidad epidemiológica
Elisa Indirecto para muestras de suero Bovino
Estatus %P
Negativo <53 % indicado como N

Positivo ≥53 % indicado como Pos
Elisa Indirecto para muestras de leche
Estatus %P

Elisa Indirecto para muestras de pool de leche
Estatus PP


Guía de Problemas y Soluciones
Señal Posible causa Solución

Color irregular 1.Error de pipeteo Práctica
2.Falta de mezcla de reactivos Mejorar técnica
3.Falta de lavados Precaución
1. Se omitió el substrato Revisar

No hay color 2. Errónea concent. Substrato Revisar
3. Substrato con pH erróneo Controlar pH
4. Conjugado muy diluido Revisar
5. Se omitió el conjugado Revisar
6. El Ag. no se adhirió Intentar otro método
Color parejo en toda la placa 1. Conjugado muy concentrado Controlar

2. Falla en el lavado Mejorar técnica
3 Substrato contaminado Revisar
Elevado color de fondo 1. Reacción inespecífica Cambiar solución de lavado

“background” 2. Material de vidrio sucio Mejorar lavado
3. Agua de mala calidad Controlar calidad
4. Poco detergente(Tween 20) Revisar
5. Tampones contaminados Preparar soluciones nuevas
1. Substrato muy concentrado Revisar

2. Conjugado muy concentrado Controlar dilución
Desarrollo de color muy rápido 3.Solución substrato con pH Controlar
erróneo
4.Concent. Cromógeno errónea Revisar
1. Substrato muy diluido Revisar

2. Conjugado muy diluido Revisar dilución
Desarrollo de color muy lento 3.Solución substrato con pH Revisar
erróneo
4. Concentración Cromógeno Revisar
errónea
5.Conc, de Tween errónea Revisar
1. Incubación despareja Utilizar estufa

Efecto borde 2. Congelación despareja Utilizar estufa
3. Resecación por aire Mantener la placa cubierta
4. Tampón de lavado residual Eliminarlo

Ejemplo protocolo de Trabajo
SENASA
DIRECCIÓN DE LABORATORIOS
Protocolo ELISA Brucelosis
Y CONTROL TÉCNICO
Fecha
Competencia Kit Nº Indirecto Analista
Placa Nº Antígeno Lote Fecha reconstitución
Dilución Incubación
C ++ C+ C-
Ac Monoclonal Lote Fecha reconstitución Dilución
Conjugado Lote Fecha reconstitución Dilución
Substrato/Cromógeno Lote Fecha preparación Dilución

Muestras: OA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A C++
B C++
C C+
D C+
E C-
F C-
G Cc
H Cc
Firma y aclaración:

ELISA POR COMPETICIÓN
La técnica consiste en la adsorción del antígeno lipopolisacárido liso (LPS-l) de Brucella sobre una
matriz sólida (Microplaca de 96 pocillos). A continuación se añade la dilución de los sueros y el
anticuerpo monoclonal de ratón, específico para un epitope de la cadena O del LPS-l. Se mezclan
los dos junto con el antígeno adherido y se dejan incubar durante treinta minutos. Después de la
incubación, se lava la microplaca y a continuación se añade el conjugado de anticuerpo de cabra
anti-ratón (IgG H+L) conjugado con enzima peroxidasa de rábano rusticano. Es importante
mencionar que el anticuerpo del conjugado ha sido previamente adsorbido con suero normal (no
infectado) de bovino, equino y humano para reducir las reacciones inespecíficas entre especies. La
etapa final de la prueba es la adición de la solución substrato / cromógeno. Después de un periodo
de tiempo fijo de diez minutos, la reacción se mide fotométricamente. Entre cada uno de los pasos
del ensayo la placa debe ser lavada debidamente.
En la ausencia de anticuerpos anti Brucella en los sueros problemas (sueros negativos), el
anticuerpo monoclonal se liga con el epitope de la cadena O del LPS-l, lo cual es indicado en la
prueba por el desarrollo de color. En el caso que el suero problema contenga anticuerpos anti-
Brucella (suero positivo) estos compiten con el anticuerpo monoclonal por sitios del epitope e
inhiben el enlace del anticuerpo monoclonal con la porción de cadena O del LPS-l, manifestándose
por la ausencia de color en el ensayo. Los sueros con anticuerpos post vacunales por cepa 19, no
compiten con el anticuerpo monoclonal porque su afinidad, especificidad y concentración es baja,
resultando en una reacción negativa (excepto los animales vacunados en los tres meses anteriores
al sangrado).
El valor de corte para esta prueba ha sido determinado por análisis estadístico de la curva ROC,
tomando un porcentaje de inhibición del 40% (%PI =40) para la República Argentina,
según los trabajos de validación realizados por distintos grupos de trabajo (INTA, CNEA, SENASA).
Se sugiere volver a sangrar a los animales con valores de porcentaje de inhibición entre 38%PI y
43%PI.
MATERIALES
Idem Elisa Indirecto
Reactivos químicos
Ídem Elisa Indirecto
Nota: en el caso que se utilice el kit comercial todas las drogas enunciadas anteriormente no son
necesarias
Productos Biológicos
Todos los productos biológicos enumerados a continuación deben usarse solamente en pruebas in
vitro.
Todos los productos de desecho se consideran sustancias biológicas peligrosas y los recipientes
empleados para la preparación y el uso de estos reactivos biológicos deben ser desinfectados por
procedimientos químicos y/o con el tratamiento de autoclave antes de desecharlos o reutilizarlos.
Ninguno de estos reactivos biológicos ni sus derivados deberán ser distribuidos a ningún otro
laboratorio o persona sin autorización del Laboratorio de Referencia.
Los productos biológicos enumerados a continuación están normalizados y son suministrados por
Laboratorios de Referencia. No se permiten sustituciones.

Antígeno Lipopolisacárido liso (SLP-l) de Brucella abortus, cepa 1119-3, en una concentración
final de uso de 1μg/ml, (Brucellosis Centre Expertise, A.D.R.I., Nepean, Ontario, Canadá).
Anticuerpo Monoclonal (M84), de ratón específico para un epitope de la cadena O del

lipopolisacárido (Brucellosis Centre Expertise, A.D.R.I., Nepean, Ontario, Canadá).
Conjugado: Anticuerpo de cabra anti - ratón (IgG) conjugado con peroxidasa de rábano
rusticano, pre absorbido con suero normal bovino, equino y humano (Jackson Laboratories, West
Grove, PA, USA).
Suero control positivo fuerte (C++)

Suero control positivo débil (C+)
Suero control negativo (C-)
Ejecución de la prueba
a) Recubrimiento de las microplacas con el antígeno
Ídem IELISA
(No es necesario cuando se utiliza el kit comercial)
b) Adición de los sueros controles y problemas, y del Anticuerpo monoclonal M84
Si las muestras se reciben del campo en forma de sangre entera coagulada, se deberá centrifugar
el tubo a 1000 - 2000 G durante 10 minutos para obtener el suero límpido que será utilizado como
muestra en la prueba.
Distribuir los sueros en crío viales rotular y guardar a -20ºC o -70ºC.
Si las muestras presentan una visible contaminación, serán inválidas para su procesamiento y
serán desechadas. Una nueva muestra de sangre será solicitada.
En el día de la prueba los sueros son descongelados y agitados para asegurar su

homogeneización. Se prepara una dilución 1/10 en tampón PBS-T/EDTA/EGTA (50:50 v/v de
0.015 M EDTA y 0.015 M EGTA en PBS/T pH 6.3 ± 0.05). 7.5 mM EDTA/EGTA es la
concentración final en PBS/T, en tubos de vidrio, microtubos o microplacas de polipropileno y se
mezcla bien con la ayuda de vortex o la acción de pipetear, sin formar burbujas (Ej.: 180 μl de
tampón diluyente más 20 μl de suero). Se recomienda un volumen mínimo de 0,5 ml
Diluir el stock de sueros controles en un volumen suficiente para el trabajo del día
Hay cuatro tipos de controles, el control de conjugado (Cc) consiste en solución buffer
EDTA/EGTA que es usado para el cálculo del porcentaje de inhibición, el control positivo débil
(C+), el control negativo (C-) y el control positivo fuerte (C++)
Todas las diluciones son preparadas y mantenidas a temperatura ambiente.
• Anticuerpo Monoclonal M 84.
Preparar la dilución óptima de uso del Ac monoclonal en solución tampón PBS -T + EDTA/EGTA.
En el kit comercial el Ac monoclonal ya viene preparado.
El concentrado del anticuerpo monoclonal y su dilución de uso deben ser manipulados con cuidado,
mezclándolos suavemente por inversión del recipiente. NO USAR VORTEX.

c) Lavado
Descartar la solución de antígeno de la placa invirtiendo la placa y dando golpes abruptos hacia
abajo. Con lavador manual o equivalente llenar todos los pocillos de la placa con solución tampón
de lavado PBS-T (pH 7,2 ± 0,2), descartar el contenido y repetir tres veces más, el ciclo de lavado.
Después del último lavado se invierte la placa golpeándola abruptamente sobre papel absorbente.
Este paso no es necesario en la presentación comercial.
Es importante que la placa no se seque, lo que podría incrementar la actividad inespecífica del
ensayo.
d) Adición del anticuerpo monoclonal, sueros controles y problemas
-Después, de cuatro ciclos de lavado y tomando cuidado de no dejar contenido residual en las
microplacas, dispensar 50 μl de la dilución apropiada del Ac monoclonal M84 e inmediatamente
adicionar la dilución de los sueros controles y problemas en los pocillos correspondientes según el
protocolo de trabajo utilizado. La dilución de los sueros controles son dispensados en primer lugar
por duplicado. La dilución final de los sueros será 1/20.
-Se sella la placa y se coloca sobre un agitador orbital durante 5 minutos, luego se incuba 30
minutos a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC
Es muy importante que la dilución de los sueros y la dilución del monoclonal, se mezclen bien en la
placa, lo cual maximiza el enlace.
e) Adición del conjugado
• Preparación del conjugado
Diez a quince minutos antes que termine el tiempo de incubación de los sueros con el Ac
monoclonal preparar la dilución del conjugado en solución tampón diluyente (previamente titulado
según el lote).
NOTA: Usar PBS - T (NO USAR PBS-T + EDTA/EGTA porque los agentes quelantes pueden
afectar adversamente a la enzima).
Es importante no agitar el concentrado del conjugado con vortex, o cualquier acción que pueda causar
espuma. Es suficiente mezclarlo varias veces manualmente por inversión del recipiente.
• Adición de la dilución del conjugado
-Después de finalizado el tiempo de incubación de los sueros y el M84, LAVAR nuevamente las
placas como previamente se explicó
-Dispensar 100μl/pocillo en toda la placa de la dilución de uso del conjugado, usando pipeta
multicanal.
-Sellar la placa con la lámina de acetato e incubar nuevamente a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC,
durante 30 minutos

f) Adición de la solución de substrato / cromógeno
-Unos diez a quince minutos antes que finalice el periodo de incubación del conjugado preparar la
solución de substrato / cromógeno
La solución de substrato/cromógeno debe equilibrarse a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC, durante 30 minutos

antes de su uso, ya que si la solución está fría puede retardar el desarrollo de color e incrementar el riesgo de
formación de gradiente térmico explicado anteriormente.
Una microplaca nueva (sin recubrimiento de antígeno), y previamente lavada, será utilizada como placa
blanco para la lectura fotométrica.
-Finalizado el tiempo de incubación del conjugado, se procederá al LAVADO de la placa
Inmediatamente adicionar 100μl/ pocillo de la solución substrato/ cromógeno en toda la placa con
pipeta multicanal, comenzando por los ocho pocillos de la primera columna 1(A-H) de la placa
blanco, seguida por los 96 pocillos de la placa problema. Comenzar a cronometrar el tiempo
inmediatamente después de adicionar la solución substrato cromógeno en la primera columna de
la placa blanco.
-Transferir la microplaca sobre un agitador orbital a temperatura ambiente por un período de 10
minutos.
-Después de los 10 minutos de incubación proceder a la lectura a 414 o 405 nm.
-Si se desea, se puede añadir directamente a todos los pocillos 100μl de SDS 4% como agente de
frenado de la reacción
LECTURA
Antes de leer las placas asegúrese que no hay presencia de burbujas de aire en los pocillos, lo que puede
causar aberraciones ópticas. Verifique que no hay condensación o suciedad en el fondo de la placa (Ej.: marca
de los dedos, si es necesario rompa las burbujas con la punta de un tip nuevo y limpie el fondo de la placa con
papel tisú).
- Disponer la placa blanco en el carro del lector de placas y proceder a la lectura de la placa
blanco.
- Continuar con la lectura de la placa problema
El tiempo final del desarrollo de la prueba debe ser de 10±2 minutos. Si hay un error en el tiempo de
desarrollo, es posible que deba repetirse la prueba según los resultados de los controles internos de calidad.
Si el tiempo de desarrollo regularmente excede el tiempo especificado, esto puede indicar un problema con la
prueba. Controlar todas las soluciones tampones y pH, especialmente el tampón citrato.
Cálculo e interpretación de los resultados
Los resultados de los controles y las muestras son expresados como porcentaje de inhibición (%I)
de la actividad del anticuerpo monoclonal contra el control de conjugado a los 10 minutos.
La recolección y expresión de los datos obtenidos se realiza mediante el papel térmico del lector de
microplacas

Cálculo de los resultados
- Una vez obtenidos los valores de DO (Densidad Óptica), los resultados se expresan en
porcentajes de inhibición (%I), con respecto al Control de conjugado (Cc), aplicando la
siguiente fórmula:
Valor promedio de DO de cada control

%I = 100 − × 100
Valor promedio de DO del Cc
Valor promedio de la DO de la muestra problema

%I = 100 − × 100
Valor promedio de la DO del Cc
Por ejemplo si la DO de una muestra es 0.300 y la DO del conjugado es 1.030, aplicando la

formula resulta
%I =100 - ((0.300 / 1.030) x 100) = 70.9%
Criterios de aceptación de los resultados del ensayo
b) Si se utiliza un kit comercial, los valores de los controles deben encontrarse dentro del límite
de control máximo (UCL) y el límite de control mínimo (LCL) establecido por el fabricante.
Ejemplo
Controles PI LCL UCL UCL/DO LCL/DO

C++ 90% 110%
C+ 35% 65%
C- -10% 15%
Cc -12% 9% 1,000 1,800
• Primer nivel de aceptación de los sueros controles
El promedio de los valores duplicados de DO para el Cc debe estar dentro de los límites
especificados. En caso contrario se rechaza los resultados de la microplaca.
Si la microplaca pasa el primer nivel de aceptación de los controles, entonces el valor promedio de
la DO del Cc se usará en el cálculo de todos los valores de PI posteriores para los otros controles
y los sueros de prueba.
• Segundo nivel de aceptación de los sueros controles
El valor medio del PI de cada control (Cc, C++, C+, C-) debería entrar dentro de los límites
especificados.
Si las medias de dos controles cualesquiera (Cc, C-, C+ y C++), no están comprendidos dentro de
los límites especificados, la placa será rechazada

NOTA: Cualquier combinación de dos de los cuatro controles, resultará en el rechazo de

la placa.
La interpretación de los resultados de una muestra problema en la República Argentina, se

determina de la siguiente manera
Valor de corte negativo
El valor de corte negativo para cada especie (ver anexo)
Resultados positivos
Las muestras que resulten positivas según el valor de corte establecido deberán ser repetidas
Si el valor de la media del control C+ está por encima del límite superior (UCL), todas las muestras
positivas deben ser repetidas. Los resultados negativos pueden ser informados
Si el valor de la media del control C+ está por debajo del límite superior (LCL), todas las muestras
negativas deben ser repetidas.
ELISA POR COMPETENCIA PARA MUESTRAS DE SUERO EN LA REPÚBLICA ARGENTINA
Condición %I
Negativo < 40% indicado como N

Positivo ≥ 40 % indicado como Pos

ENSAYO DE POLARIZACION FLUORESCENTE PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS

CONTRA Brucella abortus EN SUERO
El ensayo de Polarización Fluorescente (FPA) para la detección de anticuerpos contra Brucella

abortus tiene la capacidad de ser una prueba multi-especies, permitiendo el diagnóstico presuntivo
en bovinos, porcinos, caprinos, ovinos y ciervos y bisontes,
Este ensayo, validado para bovinos, tiene la capacidad de distinguir animales infectados con
Brucella de los animales vacunados con cepa 19, y de los animales con reacción cruzada con
bacterias gran negativas en más del 90% de los casos.
El ensayo ha sido desarrollado para ser comparable en su performance con el CELISA
A diferencia de los enzimoinimunoensayos, el FPA es un ensayo homogéneo que no requiere la
necesidad de varias etapas de lavado. Los reactivos son agregados secuencialmente en solución y
el tiempo total de la prueba no excede los 5 minutos para sueros frescos. En resumen la prueba
involucra la adición de una determinada cantidad de suero a una solución tampón de dilución en
un tubo de vidrio. A continuación la muestra es equilibrada por aproximadamente 2 minutos.
Después de equilibrada, la muestra es leída en el analizador fluorescente para obtener una lectura
de referencia (auto fluorescente).
A continuación el antígeno conjugado con el isotiocianato de fluoresceína (FITC)) es agregado a la
solución y luego, la muestra es equilibrada nuevamente por aproximadamente por 2 minutos para
permitir que el antígeno y el anticuerpo interactúen. Después de equilibrada, la muestra es leída
nuevamente en el polarizador. Si anticuerpos específicos contra Brucella están presente (suero
positivo), el resultado será un valor alto de unidades de mili polarización (mP). En ausencia de
anticuerpos anti brucella (suero negativo), el resultado es un valor bajo en mP.
El valor de corte para la República Argentina se ha determinado en 94% mP,

Animales negativos los que se encuentren por debajo de este valor.
- Animales sospechosos: Los valores entre 94%mP y 104mP
- Animales positivos: valores igual o mayor a 105mP
MATERIALES Y EQUIPAMIENTO
Analizador de Polarización Fluorescente (Ej.: Sentry 1000, Sentry 100, Tecan) Diachemik
Computadora con puerto serial para RS-232 y disponibilidad de PC-card, puerto USB
Vortex
Micropipetas monocanal de volumen variable (0 - 10μl), (20 - 200μl)
Heladera (2 a 8ºC) y freezer (-20ºC)
Sistema purificador de agua (Milli Q Tipo 1,18 Mego Hom agua de pirógeno reducido)
Tubos de vidrio: Tubos de borisilicato de 10 x 75 mm. La marca de uso corriente es Kimax

51 VWR . Marcas equivalentes pueden ser usadas.
Vajilla de cristal (vaso de precipitado de 20 - 4000ml, erlenmeyers de 50 a 1000ml,

probetas graduadas de 10 - 2000ml, etc.
Peachímetro (rango de 0 a 14 ± 0,01 pH)
Balanza

REACTIVOS
Serán provistos por los kits comerciales autorizados por el SENASA
Todos los productos biológicos deben usarse solamente en pruebas in vitro, y en ningún caso
deben ser introducidos o inoculados en animales de Laboratorio o animales salvajes (incluyendo
pájaros y peces).
Todos los productos biológicos liofilizados deberán ser reconstituidos un día antes de ser utilizados.
Es importante no agitar los productos biológicos de forma violenta, evitando la formación de
espuma.
PREPARACION DE LA PRUEBA
Preparación de los Reactivos
Se deben seguir las instrucciones del prospecto que acompaña al kit comercial
Preparación del equipamiento/instrumentos
El usuario debe leer el manual de instrucciones y familiarizarse con los controles de los
instrumentos, calibración y la solución de los problemas de todos los equipos.
EJECUCIÓN DE LA PRUEBA
En el día de la prueba preparar y controlar la calidad de los sueros controles, siguiendo con lo
especificado en los puntos posteriores. Si el control de calidad de los sueros no se ajusta dentro de
los límites especificados, el ensayo debe ser rechazado.
- Dispensar 1ml de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos de vidrio de

borosilicato (10x 75mm).
- Dispensar 10 μl de los sueros a analizar dentro de los tubos y mezclar bien con vortex
evitando la formación de espuma
Es importante evitar la formación de espuma en la muestra.
En caso de ser visibles partículas en suspensión, dejar el suero equilibrarse por lo menos 10
minutos para asegurarse que estas partículas hayan sedimentado. Las partículas puedan interferir
con la lectura de la muestra.
- Encender el equipamiento y proceder, continuado al periodo de equilibración, realizar

la lectura blanco de las muestras.

- Dispensar la cantidad de antígeno conjugado con FITC determinado en cada tubo y

mezclar bien.
- Dejar que la muestra y el antígeno se equilibren por lo menos por 2 minutos.
- Leer las muestras exactamente en el mismo orden que fueron blanqueadas.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Control del ensayo
Los sueros controles del ensayo deben estar dentro de los límites especificados por el control de
calidad desarrollados durante la estandarización, optimización e implementación del ensayo. Los
datos son expresados en unidades de mili polarización mP para todos los controles.
Aceptación de los controles
Si los controles (BAC++ y BAC-) están fuera de los límites especificados, la prueba será
rechazada y los controles y las muestras deberán ser repetidas.
Resultados de la prueba
El estatus de las muestras de suero bovino es determinado como se muestra a

continuación:
Estatus Unidades mP
Negativo < 94mP

Sospechoso 94 a 104 mP
Positivo ≥ 105mP
Dilución y cut off en otras especies animales
Especie Cut Off Dilución Sensibilidad Especificidad Performance

(mp) (volumen de (95% CI) (95% CI) Index
suero)
Bovinos > 94 1/100 (10 ul) 99.3 100 199.3

(98.5-99.7) (99.9-100)
Caprinos > 85 1/25 (40 ul) 94.9 99.4 194.3

(93.8-95.8) 98.7-99.7)
Porcinos > 84 1/25 (40 ul) 93.5 97.2 190.7

(90.5-95.6) (96.9-97.5)
Ovinos > 78 1/40 (25 ul) 91.5 89.6 181.1

(81.8-96.5) (87.8-91.2)

FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
La fijación del complemento (FC) es la prueba de referencia internacional para el

diagnóstico serológico de la brucelosis bovina, ovina y caprina.
La prueba permite la detección y cuantificación relativa de los anticuerpos específicos

antibrucélicos ¨capaces de fijarël complemento (IgG1 y algunas IgM específica), cuya presencia
en determinados niveles posee una gran correlación con el estado de Änimal infectado¨
La FC es una prueba confirmativa ampliamente usada y aceptada pese a la complejidad de

su realización y a la necesidad de buenas instalaciones y personal entrenado para titular y
mantener los reactivos adecuadamente. Existen muchas variaciones de FC, pero la prueba más
adecuada se realiza en formato de microtitulación. Para la incubación de suero, antígeno y
complemento, se puede utilizar fijación en caliente o en frío: 37°C durante 30 minutos o 4°C
durante 14-18 horas. Varios factores influyen en la elección del método: la actividad
anticomplementaria de muestras de suero de baja calidad es más evidente con la fijación en frío,
mientras que a 37°C aumenta la frecuencia e intensidad de las prozonas, y se deben probar varias
diluciones para cada muestra.
Se han propuesto varios métodos para FC que utilizan diferentes concentraciones de

eritrocitos de oveja (GR) frescos o conservados (normalmente se recomienda una suspensión al
2,5% o al 3%). Los GR están sensibilizados con un volumen igual de suero anti-GR de conejo
diluido hasta contener varias veces (en general de dos a cinco veces) la concentración mínima
necesaria para producir un 100% de lisis de los GR en presencia de una solución titulada de
complemento de cobayo. El último se titula independientemente (en presencia o ausencia de
antígeno, según el método) para determinar la cantidad de complemento necesaria para producir
el 50% o el 100% de lisis de GR sensibilizados por unidad de volumen de una suspensión
estándar; éstas se definen como la unidad hemolítica de complemento al 50% o al 100%/ dosis
hemolítica mínima (C´H ó MHD50 ó C´H ó MHD100), respectivamente. Se suele recomendar titular
el complemento antes de cada serie de pruebas, para la determinación óptima de C´H50.
Normalmente se utilizan en la prueba 1,25-2 C´H100 o 5-6 C´H50.
Variantes para la prueba de FC:
• La macrotécnica, se realiza en tubos de Khan a un volumen final de 1 ml.
• La microtécnica, se realiza en placas de polipropileno de 96 pocillos, fondo en U con

capacidad para 250 µl. La prueba se realiza a un volumen final de 100 µl.
Materiales
- Tubos de vidrio.
- Recipientes de vidrio de volúmenes varios
- Pipetas de: 1 ml, 2 ml, 5 ml y 10 ml
- Gradillas
- Probetas volúmenes varios
- Tips
- Papel de acetato
- Placas de polipropileno de 96 pocillos fondo en U
Equipos
1. Centrífuga de placas 1000 ×g.

2. Estufa 37 + /- 0.5º C
3. Baño termostático a 37ºC +/- 1°C

4. Baño Termostático a 58ºC (56-60ºC).

5. Agitador de placas.
6. Termo de nitrógeno líquido o freezer de –70ºC.
7. Freezer (–20ºC +/- 5°C)
8. Heladera (2 a 8 °C)
9. Espectrofotómetro (540 nm)
10. Micropipetas regulables automáticas monocanales de rango 10 µl a 100 µl o de 20 µl a
200 µl
11. Micropipetas multicanales regulables de rango 10 µl a 100 µl o de 20 µl a 200 µl
12. Vortex
13. Termómetros certificados
Reactivos
1. Suspensión de glóbulos rojos 2% (GR 2%).

2. Hemolisina producida en conejo (Hem).
3. Complemento de cobayo (C’).
4. Antígeno de Brucella para la prueba de Wright (Ag)
Sueros
- Suero control positivo (SENASA suero patrón Nacional BR01/05), estandarizado de

acuerdo al Patrón Internacional del Suero Anti-Brucella abortus OIESS
Suero control negativo (SENASA suero patrón Nacional BR 03/05)

- Sueros problemas a analizar.
Drogas y soluciones
- Tampón veronal calcio magnesio 5X (TV 5X)

- Tampón veronal calcio magnesio 1X (TV 1X)
- Solución fisiológica.
Cuidados y precauciones
- Utilizar guantes durante todo el trabajo

- No utilizar los reactivos más allá de su plazo de validez
- No usar ni mezclar antígenos de diferentes frascos, lotes o fabricantes
- No usar soluciones que presenten señales de alteración tales como -precipitados, turbidez o
contaminación
- No pipetear con la boca.
- Descartar pipetas y tips utilizados en una solución de hipoclorito de sodio al 1%
- Una vez finalizada la tarea en la mesada, limpiar y desinfectar con Solución de Hipoclorito
de sodio al 1% o Etanol al 70%.
Manejo y conservación de las muestras
- Conservar los sueros en heladera (2º a 8º C) no más de dos días, para períodos mayores,
conservarlos a –20 ± 5 º C.
- Evitar repetidos ciclos de congelamiento/ descongelamiento.
- No usar sueros contaminados, que presenten precipitados o intensa hemólisis.
- Homogeneizar los sueros antes de usarlos.

Ejecución de la prueba (Microtécnica)
Utilizar microplacas de 96 pocillos fondo en U. Presentar la microplaca de manera que las letras
indiquen columnas (diluciones del suero) y los números indiquen las filas (sueros a analizar). De
esta manera, en cada placa se incluyen 12 muestras de suero para análisis y a cada muestra se
le realizan 8 diluciones dobles (1:2 – 1:256).
El procedimiento se desarrolla en caliente (incubación en estufa a 37º +- 0,5°C) y

utiliza los siguientes reactivos en volumenes de 25 μl:
a) Sistema hemolítico obtenido por la mezcla de volúmenes iguales de una solución de

hemolisina en TV que contenga 2 UH/ml y de una suspensión de eritrocitos de carnero
en TV al 2%
b) Solución de complemento de cobayo en TV que contenga 2 UC/ml
c) Solución de antígeno en TV a la dilución de trabajo
d) Hacer diluciones en base 2, a partir de la dilución 1/2 de los sueros problemas y
controles.
Inactivación de los sueros
- Las muestras de suero se inactivan en un baño termostático para eliminar el

complemento natural contenido en las mismas.
- La temperatura del baño se controlará mediante la introducción de un termómetro
certificado durante todo el tiempo de exposición de las muestras al agua y dependerá de
la especie animal a estudiar:
• Suero bovino: 30 minutos en baño termostático a 58º C ± 0.5º C.
• Suero porcino, ovino y caprino: 30 minutos en baño termostático a 60º C ± 0.5º C.
- Las muestras podrán ser sumergidas en el baño de la siguiente forma:

• En tubos de ensayo tapados herméticamente, contenidos en gradillas
• En microplacas de fondo plano o en U tapadas con papel de acetato. En este caso
la microplaca será perforada en sus 4 esquinas para impedir que se formen
burbujas de aire por debajo de ella en la inmersión.
- El procedimiento de inactivación de las muestras podrá realizarse un día antes del
análisis. En este caso, una vez sacadas del baño termostático se dejarán a temperatura
ambiente durante al menos 30 minutos para luego conservar en heladera. Si el
análisis se realizaría después de las 24 hs las muestras se conservaran a -20°C.
Controles utilizados
• Controles de antígeno
- Control de la ausencia de poder anticomplementario: se dispensa por

duplicado en la microplaca de los controles 25 μl/ pocillo de la solución de
antígeno; luego de adiciona 25 μl de TV y luego 25 μl de C.
• Control del sistema hemolitico
- Sin complemento: Se dispensa 75 μl de TV por duplicado en la placa de

controles.
- Con complemento: Se dispensa 50 μl de TV y 25 μl de C.
Sueros controles:

Para su uso los sueros controles se descongelarán y se guardarán en refrigeración para el

trabajo diario como máximo por un periodo de 5 días.
El suero control positivo (SENASA suero patrón Nacional BR01/05) y el suero control
negativo (SENASA suero patrón Nacional BR 03/05) que se encuentran conservados
liofilizados se utilizarán para realizar los controles diarios.
• Control negativo
- Reconstituir el suero control negativo liofilizado con 1 ml de agua destilada, luego
inactivar, alicuotar y conservar a –20 ± 5 º C.
- Realizar el mismo procedimiento de diluciones que las muestras a examinar (base ½)
• Control positivo
- Reconstituir el suero control positivo liofilizado con 1 ml de agua destilada,
- Prediluir el suero 1/12,5 con TV, inactivar, alicuotar y conservar a –20 ± 5 º C.
- En la fila 1 de la placa control dispensar desde la columna G hasta la columna B, 25
μl/pocillo de TV
- Dispensar en el pocillo H1, 50 μl del suero control positivo diluido 1/12,5. Tomar 25 μl
de suero del pocillo H1 dispensarlo en el pocillo G1, homogeneizar los dos
componentes, luego pasar 25 μl al siguiente pocillo F1, y repetir la misma secuencia
hasta el pocillo A1. (tabla 1)

Placa de controles
Tabla 1
H
A
1:12,5 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800
Dilución suero 50 µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl
control positivo
Suero
1
POS
25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 3
Dilución suero 25 µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl

control negativo Suero
puro NEG 4
25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV
25µl TV 25µl TV
Control de Ag 25µl Ag 25µl Ag 6
25µl C’ 25µl C’
75µl TV 75µl TV
Control del SH 7
sin C'
Control de 50µl TV 50µl TV

SH con C’ 25µl C’ 25µl C’ 8
10
11
12

Dilución de las muestras de sueros
Tabla 2 Distribución de las muestras a analizar en una microplaca de 96 de pocillos fondo

en U (12 sueros × 8 diluciones)
H
D
G
A
C
E
F
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 25µl
25 µl
25µl suero 1
1
25 µl TV 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl
TV TV TV TV TV TV TV
Suero 2 2
Suero 3 3
Suero 4 4
Suero 5 5
Suero 6 6
Suero 7 7
Suero 8 8
Suero 9 9
Suero 10 10
Suero 11 11
Suero 12 12
En la columna con la dilución 1:2 se evalúa la actividad anticomplementaria de cada suero a

analizar. En lugar del antígeno se debe completar el volumen con solución SV.
1. Dispensar en cada pocillo de acuerdo a la cantidad de sueros a procesar 25 μl de TV.
2. Dispensar 25 μl de suero en el pocillo H1, homogeneizar los dos componentes con

pipetas monocanal o multicanal, luego pasar 25 μl del pocillo H1 al G1, homogenizar y
pasar 25 μl al pocillo F1, luego repetir la misma secuencia hasta el pocillo A1.
3. La secuencia de operaciones se detalla en la tabla 2. Las diluciones se realizarán con

pipetas monocanal o multicanal. La homogenización de los dos componentes de cada
dilución se mezclan mediante el pipeteo por cinco veces consecutivas

Preparación de la solución de antígeno y complemento y su distribución en la

microplaca
- Se preparan las soluciones de C’ y Ag según la dilución de trabajo establecida como

óptima.(Ver Anexo II)
- Una vez diluidos los sueros con la TV, dispensar la solución de antígeno a razón de 25
μl /pocillo, en todos los pocillos salvo en la columna H de la dilución 1/2 que actuarán
como controles de poder anticomplementario (PA) de cada suero
- A continuación dispensar 25 μl/pocillo de la solución de C’ en todos los pocillos de la

microplaca.
Primera incubación en caliente
- Cubra y agite las microplacas en agitador de placas durante 2 – 4 minutos

- Incube las microplacas a 37ºC +/-0,5 °C durante 30 minutos.
Dispensado del sistema hemolítico
- Finalizada la incubación, dispense el sistema hemolítico a razón de 25 μl en todos los

pocillos de las placas
Segunda incubación en caliente
- Cubra y agite las microplacas en agitador de placas durante 2 – 4 minutos

- Incube las microplacas a 37º C durante 30 minutos.
Centrifugación de la microplaca
- Finalizada la incubación, centrifugue las microplaca a una fuerza de 1000 rpm durante
5 minutos

- Tabla 3 Distribución final de los reactivos en la placa
G
H
A
E
F
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
25 µl suero 1 25µl suero 25µl suero 25µl suero 25µl suero 25µl suero 25µl suero 25µl suero
50 µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV
25µl C’ 25µl Ag 25µl Ag 25µl Ag 25µl Ag 25µl Ag 25µl Ag 25µl Ag
25µl C’ 25µl C’ 25µl C’ 25µl C’ 25µl C’ 25µl C’ 25µl C’
Incubación Incubación Incubación Incubación Incubación Incubación Incubación Incubación
1
25µl SH 25µl SH 25µl SH 25µl SH 25µl SH 25µl SH 25µl SH 25µl SH
Incubación Incubación Incubación Incubación Incubación Incubación Incubación Incubación

Lectura Lectura Lectura Lectura Lectura Lectura Lectura Lectura
Suero 2 2
Suero 3 3
Suero 4 4
Suero 5 5
Suero 6 6
Suero 7 7
Suero 8 8
Suero 9 9
Suero 10 10
Suero 11 11
Suero 12 12
Cálculos y expresión de los resultados
El grado de fijación del complemento se traduce en mayor o menor medida en la presencia o

ausencia de hemolisis del sistema hemolitico. Se expresa en forma de UIFC (unidades
internacionales fijadoras del complemento) y como título o dilución a la positividad de la muestra
(1/4,1/8, etc) seguido de 1, 2, 3 o 4 cruces según el grado de hemolisis en dicha dilución.
El título menor que se cuantifica es 1/4 + (16,6 UIFC) y el rango de trabajo esta comprendido
entre 1/4 + y 1/256 ++++ (16,6 a 1702,7 UIFC).
El poder anticomplementario de los sueros se controla en la dilución 1/2.
Se considera resultado positivo cualquier valor ≥40 UIFC (1/8 ++) para animales
hembras vacunadas entre los 3 a 8 meses de edad con B. abortus cepa 19 y para
animales no vacunados se considera positivo cualquier valor ≥20 UIFC (1/4 ++)

Los casos en que la muestra presente poder anticomplementario se informarán los resultados con
la leyenda “PA”
En otros casos se informará de las siguientes formas:

Muestra hemolisadas y en putrefacción con la leyendas “hemolisadas” y “en putrefacción”
respectivamente.
Cuando el volumen de la muestra sea insuficiente se informará como “muestra con volumen
insuficiente”
El resultado de la reacción será “positivo” o “negativo”. En el primer caso la reacción positiva se

cuantificará mediante la determinación del titulo y su grado de hemólisis.
Reacción positiva:
- Sedimentación en grado variable de los eritrocitos en el fondo del posillo

- El sobrenadante estará afectado por un cierto tinte rojizo en función de la hemólisis que se
haya producido. Este grado de hemólisis debe cuantificarse y consignarse mediante un sistema de
cruces.
a. ++++: fijación completa. Sobrenadante translucido, en el fondo de la placa un botón de

depósito de eritrocitos: equivalente a un 0% de hemólisis.
b. +++: sobrenadante rojizo en un 25% de intensidad; en el fondo un deposito claro de
eritrocitos: equivalente a un 25% de hemólisis.
c. ++: sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad; en el fondo un deposito tenue de
d. +: sobrenadante rojizo en un 75% de intensidad; en el fondo un deposito muy tenue de
Reacción negativa:
- Se considera la reacción negativa cuando hay 100% de hemólisis con ausencia de depósito de
eritrocitos.
Determinación del titulo del suero: será la dilución más alta que siga dando un
grado de sedimentación de los eritrocitos. Este grado de fijación será consignado mediante el
sistema de cruces descrito.
Expresión de los resultados en unidades internacionales de fijación del

complemento
El sistema de expresión de los resultados en UI-FC se basa en el Procedimiento IZS TE B2. 1.6
SOP 004 del Centro Internacional de Referencia OIE para Brucelosis Istituto Zooprofilattico
Sperimentale dell”Abruzzo e del Molise G. Caporale. Teramo. Italia
El porcentaje de hemólisis se expresa de acuerdo a la siguiente escala:
+ Î 25%
++ Î 50%
+++ Î 75%
++++ Î 100%

Expresión de los resultados de FC en UI-FC de acuerdo al título de la muestra y porcentaje de

hemólisis.
Dilución % hemólisis UI-FC

+ 16,6
++ 20
1:4
+++ 23,2
++++ 26,6
+ 33,2
++ 40
1:8
+++ 46,4
++++ 53,2
+ 66,4
++ 80
1:16
+++ 92,8
++++ 106,4
+ 132, 8
++ 160
1:32
+++ 185,6
++++ 212,8
+ 265,6
++ 320
1:64
+++ 371,2
++++ 425,6
+ 531,2
++ 640
1:128
+++ 742,4
++++ 851,2
+ 1062,4
++ 1280
1:256
+++ 1484,8
++++ 1702,4
Los resultados de la FC están expresados en unidades internacionales (UI) ajustados con el

Segundo Suero Patrón Internacional anti-Brucella abortus (OIESS).
Lectura de los controles
La aprobación del análisis debe realizarse mediante la constatación de que los controles han dado
los resultados esperados:
• Suero control positivo: 50 % de fijación (++) en la dilución 1:200 que corresponde a 1000
UI.
• Suero control negativo: ausencia de fijación de complemento (100% de hemólisis en
todos las diluciones)
• Control de poder anticomplementario de los sueros: los sueros de la prueba y los sueros
controles deben tener 100% de hemólisis (ausencia de fijación del complemento) en las
diluciones ½ (sin antígeno)
• Control AG-poder anticomplementario: hemólisis del 100%
• Control del sistema hemolitico sin C: 0% de hemólisis
• Control del sistema hemolitico con C: 100% de hemólisis

En el caso que los controles no se encuentren dentro de los límites aceptables, el ensayo será
considerado como no válido y la prueba deberá ser repetida. Si los controles fallan
nuevamente, se deberá estudiar el posible origen del fallo que dará origen a una “no
conformidad” y su posterior resolución. Mientras esta resolución no se produzca no se podrá
continuar con el ensayo.
La presencia de, al menos, un 25% de sedimento de eritrocitos (+) en la fila A (dilución ½)
indica que la muestra puede tener poder anticomplementario. En tal caso, se da el resultado
“PA”, lo que implicará la solicitud de una nueva muestra.
Anexo I

Metodología para la estandarización de la suspensión de glóbulos rojos de carnero al

2% para ser empleada en la prueba de Fijación de Complemento.
La sangre de carnero es obtenida por punción en la vena yugular con solución de alsever
Se busca determinar una suspensión al 2% que contenga 5,4 X 108 de glóbulos rojos
Materiales:
- Cámara de Burker.
- Erlenmeyers de capacidad: 100 ml, 500 ml
- Pipetas de: 1 ml, 2 ml, 5 ml y 10 ml.
- Gradillas.
- Probetas volúmenes varios.
- Tips
- Tubos de centrifuga graduado
Equipos
Se utilizan los mismos equipos descriptos en el ensayo de FC
Reactivos
- Tampón veronal calcio- magnesio pH 7.3-7.4.

- Hematíes de carnero
Drogas y soluciones
- Cloruro de Sodio
- 5-5 dietil barbiturato de sodio
- Cloruro de Magnesio
- Cloruro de Calcio
- Ácido Clorhídrico
- Citrato de Sodio
Manejo y conservación de la sangre
- Conservar la sangre en heladera (2º a 8º C) no más de 30 días

- No usar sangre contaminada, que presenten precipitados o intensa hemólisis.
- Homogeneizar la sangre antes de su uso.
- Usar la sangre 5 días después de su recolección
Condiciones de realización
La estandarización de la suspensión de globulos rojos se puede realizar por medio de dos

metodos: Método espectrofotométrico o Método en cámara de Neubawer

Realización
a) Lavado de glóbulos rojos:
- Filtrar la sangre a través de una gasa y depositar en un tubo de centrífuga graduado

de 10 ml.
- Centrifugar la sangre a 1000 G durante 5 minutos.
- Descartar el sobrenadante, tratando de arrastrar los leucocitos que forman una capa
amarillenta en la parte superior de la columna de hematíes.
- Resuspender los eritrocitos en TV, homogeneizar y centrifugar. Este paso realizarlo 3
veces
- Luego de la última centrifugación descartar el sobrenadante.
b) Estandarización de glóbulos rojos al 2%:
Método espectrofotométrico:
Tubo 1: para determinar el volumen de la columna de glóbulos y calcular la cantidad

de solución TV necesaria para hacer una suspensión al 2% (0,2 ml GR + 9,80 de TV).
Tubo 2: Para determinar la lisis 100%. Realizar una dilución de los GR 2% 1/15 con
agua destilada (0,2 ml de glóbulos rojos + 2,8 ml de agua destilada), de esta forma se
produce la lisis de los eritrocitos.
Tubo 3: blanco de lectura para el espectrofotómetro. Agregar en un tubo 5,6 ml de

agua destilada + 0,4 ml de TV que será el blanco
• Una vez lisados los eritrocitos, se lee la densidad óptica(DO) a 545 nm contra el
blanco
• La DO esperada es de 0.450 (Esto puede variar según el espectrofotómetro)
Método en cámara de Neubawer:
• Determinar el volumen de la columna de glóbulos y calcular la cantidad de

solución TV necesaria para hacer una suspensión al 2% aproximadamente (0,2 ml GR
+ 9,80 de TV).
• Realizar el recuento de glóbulos rojos en la cámara.
• La suspensión deberá tener 5,4 X 108 gr/ml

Tampón Veronal Calcio magnesio
Preparación de la solución madre (5X)

NaCl 83 g
Na 5-5 dietil barbiturato 10,19 g
Ácido clorhídrico 1 N (*) 34,58 ml
Solución concentrada de Ca++ y Mg++ 5 ml
Agua destilada c.s.p. 2000 ml
(*) De la solución de ácido clorhídrico comercial (PM = 36,46; 31 a 32% de pureza; densidad 1.16) se
miden 99,77 ml y se llevan a 1000 ml con agua destilada.
Preparación
a) En un matraz aforado de 2000 ml, disolver el NaCl y el barbiturato en 500 ml de agua destilada.
b) Agregar el ácido clorhídrico.
c) Agregar 5 ml de la solución concentrada de Ca++ y Mg++, la cual se prepara en la forma

siguiente:
CaCl2.2 H2O 4,4 g

Mg Cl2.6 H2O 20,3 g
Agua destilada 100 ml
d) Completar el volumen hasta 2000 ml con agua destilada y mezclar.
e) Realizar un dilución 1/5 con agua destilada la cual será la dilución de trabajo (1X) y
tomar el pH que debe estar entre 7,3 y 7,4. Descartar la solución de uso (1x), después de
transcurridos 5 días.
Preparación de la solución alsever para conservación de los glóbulos rojos de oveja
Fórmula
Dextrosa 20,5 g
Citrato de sodio 8,0 g
Cloruro de sodio 4,2 g
Ácido cítrico 0,55 g
Agua destilada 1000 ml
Preparación
a) La solución se esteriliza por filtración. También se puede esterilizar en autoclave a 15 libras de

presión durante 15 minutos, evitando que llegue a caramelizarse; en caso de que ello ocurra se
debe descartar la solución.
b) Conviene seleccionar 4 ovejas sanas que suministren eritrocitos de fragilidad normal. Cada
semana se sangra una oveja, de forma que la misma oveja será sangrada a la quinta semana.
c) La sangre se recogerá asépticamente en un recipiente que contenga un volumen de solución

Alsever similar al de la sangre que se va a tomar. Se mezclan bien y se conservan en refrigerador.

Anexo II
Determinación de la dilución de trabajo óptima del complemento y hemolisina que

debe emplearse como reactivo en la cuantificación de anticuerpos para el
serodiagnóstico de brucelosis mediante la técnica de fijación del complemento.
Se aplica como un paso previo para la reacción de la técnica de fijación del complemento.
Se busca determinar en conjunto el valor de sensibilizacion de la hemolisina para los hematíes de

carnero expersado como UH (Unidades Hemoliticas) y la concentración de uso del complemento en
la reaccion de fijación del complemento expresado como UC (unidad complemento)
Reactivos
- Suspensión de glóbulos rojos al 2%. Se preparará según Anexo 1
- Hemolisina: Reactivo conservado a -20º C hasta el momento de su titulación
- Complemento de cobayo: Reactivo conservado a -70º C - 186° C hasta el momento de su

titulación
Drogas y soluciones
- Tampón veronal calcio magnesio 1X
Condiciones de realización
Trabajar a temperatura de laboratorio, las incubaciones del ensayo se realizarán en

estufa a 37°C ± 0,5 º C.
Realización
- La titulación simultánea del complemento y la hemolisina se debe realizar cada

vez que un nuevo lote de complemento, hemolisina y/o glóbulos rojos son
producidos.
- El control de 2 Unidades de C debe ser realizado cada día antes del ensayo
usando GR 2%
- El complemento que sea objeto de titulación debe descongelarse a temperatura

de laboratorio. Una vez descongelado se mantendrá en refrigeración y solo se sacará
de la heladera en el momento de su utilización. Si se prevee que se va a utilizar más
de un vial se juntarán todos en uno solo y se titulará el conjunto. Tras su uso diario
se guradará a una temperatura de -70º C o a – 186° C
- La hemolisina que se encuentra concervada a – 20º C se descongelará a

temperatura de laboratorio. Una vez descongelada se mantendrá en refrigeracion
y solo se sacará de la heladera en el momento de su utilización.
Preparacion de las diluciones
• Dilución del complemento:
- Preparar una dilución 1:10 de complemento en TV (100 μl de complemento +

900 μl de TV) y conservar en una caja con hielo durante la titulación.

- Realizar las siguientes diluciones de complemento a partir de la dilución 1:10

(tabla 1) y conservar en caja con hielo durante la titulación:
Tabla 1 Diluciones del complemento

Dilución Complemento 1/10 Tampón veronal
1/40 100 μl 300 μl
1/50 100 μl 400 μl
1/60 100 μl 500 μl
1/70 100 μl 600 μl
1/80 100 μl 700 μl
1/100 100 μl 900 μl
1/120 50 μl 550 μl
1/140 50 μl 650 μl
1/160 50 μl 750 μl
1/240 50 μl 1150 μl
1/280 50 μl 1350 μl
1/320 50 μl 1550 μl
• Dilución de hemolisina:
- Prediluir la hemolisina 1:100 en TV ( 10 μl de hemolisina + 990 μl de TV)

- Diluir la hemolisina 1:1000 en VB (500 μl de hemolisina 1:100 + 4500 μl de VB)
- A partir de la dilución de hemolisina 1:1000 preparar en tubos las siguientes

diluciones (tabla 2 )
Tabla 2 Dilución de hemolisina

Dilución Hemolisina 1/1000 Tampón veronal
1/2000 1000 μl 1000 μl
1/4000 500 μl 1500 μl
1/6000 500 μl 2500 μl
1/ 8000 500 μl 3500 μl
1/10000 500 μl 4500 μl
1/12000 500 μl 5500 μl
1/14000 500 μl 6500 μl
Preparación del sistema hemolítico
- Prepare y enumere un set de 7 tubos, uno por cada dilución de hemolisina
- Agregue en cada tubo 1000 μl de hemolisina de cada dilución
- Agregue 1000 μl de glóbulos rojos estandarizados al 2 % en todos los tubos que

contienen las diluciones de hemolisina.
- Incube en estufa a 37º +/- 0,5 °C durante 15 minutos
Ejecución de la titulación cruzada en microplaca del complemento y

la hemolisina (Tabla 5)
a) Distribución de TV
- Desde la fila A hasta la fila G de la microplaca agregue 50 μl/pocillo de TV.
b) Distribución del C’

- Agregue 25 μl/pocillo de cada dilución del complemento en todos los

pocillos de la microplaca excepto en la fila H como se muestra en la tabla 3
Tabla 3 Distribución de las diluciones del complemento

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 1/320
B 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 1/320
C 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 1/320
D 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 1/320
E 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 1/320
F 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 1/320
G 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 1/320
H
c) Distribución de la hemolisina
- Finalizada la incubación de las diluciones del sistema hemolítico distribuir

25 μl/pocillo del sistema hemolítico en la microplaca según el esquema
indicado en la tabla 4
- Dispensar 25 μl del sistema hemolítico 1/2000 en los controles de sistema

hemolítico con complemento y el de sin complemento. (H1 y H2)
- Dispensar 25 μl de glóbulos rojos al 2 % en el control de integridad (H3)
Tabla 4 Distribución de las diluciones de la hemolisina

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000
B 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000
C 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000
D 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000
E 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000
F 12000 12000 12000 12000 12000 12000 12000 12000 12000 12000 12000 12000
G 14000 14000 14000 14000 14000 14000 14000 14000 14000 14000 14000 14000
H CSH CSH CI GR
c/C s/C
2000 2000
Tabla 5 Complemento
40 50 60 70 80 100 120 140 160 240 280 320
Hemolisina 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2000 A
4000 B
6000 C
8000 D
10000 E
12000 F
14000 G
H CSH CSH CI GR
c/C s/C
2000 2000

d) Distribución de los controles
• Control del sistema hemolítico con complemento (CSH c/C)

-Dispensar en el pocillo H1:
50 μl de TV
25 μl de complemento dilución 1:40
• Control del sistema hemolítico sin complemento (CSH s/C)

-Agregue en el pocillo H2:
75 μl de TV
• Control de integridad de glóbulos rojos (CI GR)

-Agregue en el pocillo H3:
75 μl de TV
e) Incubación
- Cubra y agite la microplaca en agitador de placas durante 2 – 4 minutos
- Incube las microplaca a 37º C +/- 0,5 ° C durante 30 minutos.
f) Centrifugación/reposo de la placa
- Finalizada la incubación, centrifugue la placa a 1000 rpm durante 5 minutos o bien

déjela en reposo en heladera durante 30 minutos antes de su lectura.
Expresión de resultados
El resultado de la reacción en cada pocillo se evaluará por el grado de hemólisis presente en el

mismo y se consignará mediante un sistema de cruces.
e. ++++: fijación completa. Sobrenadante translúcido, en el fondo de la placa un botón

de depósito de eritrocitos: equivalente a un 0% de hemólisis.
f. +++: sobrenadante rojizo en un 25% de intensidad; en el fondo un depósito claro de
g. ++: sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad; en el fondo un depósito tenue de
h. +: sobrenadante rojizo en un 75% de intensidad; en el fondo un depósito muy tenue
de eritrocitos: equivalente a un 75% de hemólisis.
i. N: 100% de hemólisis, ausencia de depósito de eritrocitos, sobrenadante rojo
cristalino.
Los resultados de la lectura se consignarán en la hoja de laboratorio
Lectura de controles
Antes de realizar la lectura de la prueba, verificar los resultados de los controles. En el caso
que los controles no se encuentren dentro de los límites aceptables, el ensayo será
considerado como no valido y la prueba deberá ser repetida nuevamente.
• Control del sistema hemolítico con complemento: 100 % de hemólisis

• Control del sistema hemolítico sin complemento: 0 % de hemólisis
• Control de integridad de glóbulos rojos: 0 % de hemólisis

Lectura de la titulación
• Título del complemento: Es la más alta dilución del complemento que da 100 % de
hemólisis con la más alta dilución de la hemolisina. Esto es 1 unidad de complemento
(UC), pero para el ensayo principal se usará 2 unidades de complemento (2UC)
• Título de la hemolisina: Es la más alta dilución de hemolisina que da 100 % de

hemólisis con la más alta dilución de la complemento. Esto es 1 unidad de hemolisina
(UH), pero para el ensayo principal se usará 2 unidades de hemolisina (2UH).
Calculo de la dilución de trabajo
Supongamos que UC = 1/60 (según el desarrollo en el presente procedimiento)
DDT 2 x UC = 2 x 1/ 60 = 1/30
Para calcular la dilución de trabajo de la hemolisina se procede de la misma manera: Supongamos

que UH = 1/3000
DDT 2 x UH = 2 x 1/ 3000 = 1/1500
Control de 2 Unidades de complemento (2 U)
Una vez obtenida la dilución de trabajo se realizara el control de 2 UC y 2 UH, también se

chequeara las diluciones de complemento 1/ 40 y 1/50 y para la hemolisina la dilución 1/1000 y
1/1500; esto nos permitirá seleccionar la dilución óptima de trabajo.
La prueba se efectúa por duplicado utilizando 4 pocillos por cada dilución de complemento.
a) Preparación de sistema hemolítico:
- Preparar y agregar en dos tubos 1000 μl de las diluciones de hemolisina 1/1000 y 1/1500
- Agregar a los tubos que contienen la hemolisina 1000 μl de glóbulos rojo estandarizado al
2%
- Agitar e incubar en estufa a 37º C por 15 minutos
b) Preparación del complemento
- Prepare 3 diluciones de complemento (1/30, 1/50, 1/60)
c) Distribución en la microplaca
- Dispensar 25 μl/pocillo de TV en las columnas según el esquema indicado en la tabla

6
Tabla 6 Distribución de TV
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl
B 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl
C 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl
D 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl
E
F
G
H

- Dispensar 50 μ/pocillo de complemento de la diluciones 1/30, 1/40 y 1/50 en las

columna 1, 5 y 9 respectivamente como se indica en la tabla 7
Tabla 7 distribución del complemento

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 50μl 50μl 50μl
B 50μl 50μl 50μl
C 50μl 50μl 50μl
D 50μl 50μl 50μl
E
F
G
H
- Con la pipeta multicanal pasar 25 μl /pocillo de la columna 1 a la columna 2. La

homogenización de los dos componentes de cada dilución se realizará mezclando mediante
la acción pipetear durante 5 veces. Recoja 25 μl/pocillo de la columna 2 y páselo a la
columna 3, vuelva a homogeneizar, recoja 25 μl/pocillo y páselo a la columna 4,
homogenice y recoja 25 μl/pocillo y páselo a la columna 5, homogenice, tome 25μl/posillo
y descártelo.
Repita la misma operación con las diluciones que se encuentran en la columna 6 y 9.
- Las diluciones del complemento quedarán dispuestas en la microplaca como muestra la tabla 8
Tabla 8 Diluciones del complemento

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl
2UC 1UC 0,5 0,25 2UC 1UC 0,5 0,25 2UC 1UC 0,5 0,25
UC UC UC UC UC UC
B 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl
2UC de TV 0,5 0,25 2UC de TV 0,5 0,25 2UC de TV 0,5 0,25
UC UC UC UC UC UC
C 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl
UC UC UC UC UC UC
D 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl
UC UC UC UC UC UC
E
- Finalizada la incubación del sistema hemolítico, agregar 25 μl/pocillo de SH 1/1000 en la fila

A y B y 25 μl /posillo de SH 1/1500 en la fila C y D.
d) Incubación

- Cubra y agite la microplaca en agitador de placas durante 2 – 4 minutos
- Incube las microplaca a 37º C +/- 0,5 °C durante 30 minutos.
e) Centrifugación/reposo de la placa
- Finalizada la incubación, centrifugue la placa a 1000 rpm durante 5 minutos o bien

déjela en reposo en heladera durante 30 minutos antes de su lectura.
Lectura y elección de la dilución de trabajo
La dilución del complemento y hemolisina que se aceptará deberá dar como resultado en
la primera y segunda dilución (2 UC y 1UC) 100% de hemólisis, en la tercera dilución (0,5
UC) 50% de hemólisis y 0 % de hemólisis en la cuarta dilución (0,25).
REGISTROS Y ARCHIVOS:
Se archivan los siguientes registros:
- Planilla de ingreso de globulos rojos

- Planilla de ingreso de complemento
- Planilla de ingreso de hemolisina
- Planilla de titulación

Anexo III
PLANILLA DE TITULACION DEL COMPLEMENTO Y HEMOLISINA
FECHA: OPERADOR:
Glóbulos rojos:
Hemolisina:
Complemento:
• Titulo 1 UC: Controles: SH con C:
SH sin C:
GR:
• Titulo 1UH:
Control 2 UC y 2 UH
2UC 1UC 0,5UC 0,25UC 2UC 1UC 0,5UC 0,25UC 2UC 1UC 0,5UC 0,25UC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
• Dilución de trabajo 2 UC:

• Dilución de trabajo 2 UH:

ANEXO IV: CONFECCIÓN DE LA ESCALA VISUAL
Preparación de la escala visual
En un tubo de ensayo se coloca 1 ml de la suspensión de glóbulos rojos al 2% + 9ml de

buffer diluido. (O aquella suspensión de glóbulos rojos usada para confeccionar el sistema
hemolítico).
En otro tubo de ensayo colocar 1ml de la suspensión de glóbulos rojos al 2% + 7ml de

agua destilada, agitar para provocar la completa hemólisis de los GR. (solución de
hemoglobina), y agregarle 2ml de buffer concentrado (5x) para mantener la presión
osmótica.
Estos dos tubos mantienen la misma relación de GR. intactos en el primer caso y de
glóbulos lisados en el segundo, que el que el 0% de hemólisis y el 100% de hemólisis en
la prueba.
De esta manera mezclándolas en distintas proporciones podremos obtener la imagen que

corresponde a los distintos grados de hemólisis, luego de centrifugar durante 5 minutos a
1000 G (cuadro N° 5).
PORCENTAJE DE HEMÓLISIS
REACTIVOS EN 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
µl
Solución de 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
hemoglobina
Suspensión de 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
glóbulos rojos
Control y Titulación del Antígeno
Para verificar la sensibilidad y especificidad del antígeno empleado se utilizaran 5 sueros positivos y
5 sueros negativos en la dilución 1:4 respectivamente.
El nuevo lote de antígeno debe presentar un titulo en el cual el suero de referencia Internacional
(OIESS) y Nacional (Senasa 01/05) arroja un resultado de ++ en 1:200 y negativo en 1:250, título
que corresponde a 1000 UIFC/ml de suero
El suero negativo debe arrojar resultado negativo

NORMATIVA VIGENTE
LEY 24.696
Declárase de interés nacional el control y erradicación de la enfermedad reconocida

como Brucelosis (Brucella abortus) en las especies bovina, suina, caprina y otras en
todo el Territorio Nacional.
Sancionada: Setiembre 4 de 1996.
Promulgada: Setiembre 26 de 1996.
El Senado y Cámara de Diputados de la Nación Argentina reunidos en Congreso, etc.,
Sancionan con fuerza de Ley:
ARTICULO 1º- Declárase de interés nacional el control y erradicación de la enfermedad

reconocida como Brucelosis (Brucella Abortus) en las especies bovina, ovina, suina, caprina y otras
especies en todo el Territorio Nacional, conforme al tipo de explotación y a la especie animal al

cual
estén dirigidas las campañas gubernamentales que al efecto se encaren.
ARTICULO 2º - El Servicio Nacional de Sanidad Animal, dependiente de la Secretaría de

Agricultura, Pesca y Alimentación del Ministerio de Economía y Obras y Servicios Públicos de la
Nación, será la autoridad de aplicación de la presente ley.
ARTICULO 3º - Créase una Comisión Nacional para la lucha contra la brucelosis, la que estará
integrada de la siguiente forma:
- El Administrador General del Servicio Nacional de Sanidad Animal, quien ejercerá en ella el cargo
de Presidente.
- Un representante de Confederaciones Rurales Argentinas, como vocal.
- Un representante de la Sociedad Rural Argentina, como vocal.
- Un representante de la Federación Agraria Argentina, como vocal.
- Un representante de la Confederación Intercooperativa Agropecuaria Cooperativa Limitada, como

vocal.
- Un representante de la Cámara Argentina de Productos Veterinarios, como vocal.
- Un representante de las Provincias del Noroeste Argentino, como vocal.
- Un representante de las Provincias del Noreste Argentino, como vocal.
- Un representante de las Provincias Patagónicas, como vocal.

- Un representante de las Provincias pertenecientes a la denominada "Pampa Húmeda", como
vocal.
- La Comisión que por este artículo se crea, funcionará de acuerdo a los reglamentos que al efecto
dicte.
ARTICULO 4º - El Servicio Nacional de Sanidad Animal, en forma conjunta con la Comisión que
se crea en virtud del artículo anterior, tendrá a su cargo la planificación, seguimiento y evaluación
de los programas de lucha contra la citada enfermedad.
ARTICULO 5º - El Servicio Nacional de Sanidad Animal y la Comisión que por la presente se crea,
propiciarán los convenios que consideren convenientes para erradicar y controlar la enfermedad,
pudiendo suscribir los mismos, con los entes nacionales y/o internacionales, provinciales o
municipales, públicos o privados que se relacionen con ella.
ARTICULO 6º - Siendo la enfermedad de denuncia obligatoria, los animales reaccionantes

positivos detectados de cualquier especie, serán certificados con documentación especial
establecida por el Servicio Nacional de Sanidad Animal para tal fin, debiendo eliminarse con destino
distinto al de la producción.
ARTICULO 7º - La Comisión Nacional de Lucha contra la Brucelosis, en forma conjunta con el

Servicio Nacional de Sanidad Animal, tendrá a su cargo el diseño, implementación y coordinación
de los sistemas nacionales de vigilancia específicos de la enfermedad.
ARTICULO 8º - Autorízase al Servicio Nacional de Sanidad Animal, a establecer las normas de

control de vacuna en sus etapas de elaboración, comercialización e importación.
ARTICULO 9º - En aquellos casos de importación de vacunas, el Servicio Nacional de Sanidad

Animal, será el encargado de autorizar el ingreso a plaza de las mismas, debiendo otorgar a esos
fines, los correspondientes certificados de aprobación para su posterior comercialización.
ARTICULO 10. - Convalídanse las fundaciones y entes de lucha existentes hasta el presente en el
marco de la Resolución de la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca 578/88.
Las que en el futuro se crearen podrán adoptar la figura jurídica sin fines de lucro que consideren
más apropiada para la concreción de los objetivos que se fijaren alcanzar.
ARTICULO 11. - Facúltase al Servicio Nacional de Sanidad Animal, y a las Comisiones Provinciales
de Sanidad Animal, con conocimiento de la Comisión Nacional de Lucha contra la Brucelosis, a
establecer zonas de erradicación obligatoria, zonas libres y fronteras epidemiológicas.
ARTICULO 12. - El Servicio Nacional de Sanidad Animal, será responsable del control de la
vacunación, pudiendo delegar dichas acciones en entidades según lo acuerde para dar
cumplimiento a los objetivos establecidos en la presente.
ARTICULO 13. - Todo movimiento y traslado de hacienda será realizado con el consiguiente
certificado de vacunación.
ARTICULO 14. - Los plazos de aplicación de lo dispuesto en el artículo 6 de la presente,

quedarán sujetos a lo que establezca el Servicio Nacional de Sanidad Animal y las Comisiones
Provinciales de Sanidad Animal oportunamente, considerando la prevalencia de la enfermedad,
conforme al ámbito en el que aquélla se presentare.

ARTICULO 15. - En los casos citados en los artículos 6 y 14 de esta ley, los animales deberán ser
faenados en establecimientos aprobados por el Servicio Nacional de Sanidad Animal o en
establecimientos provinciales o municipales bajo el control de personal dependiente de dicho
organismo del Estado Nacional, debiendo éstos informar en forma quincenal o mensual conforme
lo establezca la reglamentación, a la autoridad de aplicación el resultado de la faena realizada.
ARTICULO 16. - Facúltase al Servicio Nacional de Sanidad Animal, a las Comisiones Provinciales
de Sanidad Animal y a los entes de lucha creados, a formalizar encuestas, requerir información a
personas físicas o jurídicas privadas u organismos oficiales, como así también elaborar bases de
datos y confeccionar estadística conforme a los planes que sobre ello apruebe la autoridad de
aplicación.
La información recabada será utilizada exclusivamente para los fines propios del Programa
Nacional de Lucha contra la Brucelosis, debiendo remitirse la misma en forma semestral a las
Comisiones de Agricultura y Ganadería de las Cámaras del Senado y de Diputados del Congreso de
la Nación.
ARTICULO 17. - Facúltase a la autoridad de aplicación a sancionar toda infracción a la presente

ley, mediante el procedimiento que establezca la reglamentación.
Las resoluciones sancionadas, serán apelables ante la Cámara Nacional de Apelaciones en lo

Contencioso Administrativo de la Capital Federal.
Las que se apliquen a personas físicas o jurídicas domiciliadas en el interior del país, lo serán por
ante la Cámara Federal de Apelaciones respectiva.
ARTICULO 18. - El Servicio Nacional de Sanidad Animal y la Comisión Nacional de Lucha contra la
Brucelosis, elaborarán los proyectos de capacitación para que el personal destinado a dicho plan,
reciba perfeccionamiento por el sistema que estime conveniente.
ARTICULO 19. - Los fondos necesarios para la implementación del artículo anterior, serán
analizados a través del Servicio Nacional de Sanidad Animal, con su aprobación.
ARTICULO 20. - El Servicio Nacional de Sanidad Animal, aprobará los laboratorios públicos o
privados que se dediquen a la producción de vacunas, la investigación del mal y en general, todas
las actividades relacionadas con el objetivo de la presente ley.
ARTICULO 21. - Las universidades u organismos de investigación nacionales, estatales o privados

que deseen investigar dicha enfermedad, como así también, desarrollar nuevas vacunas, deberán
presentar sus proyectos al Servicio Nacional de Sanidad Animal y a la Comisión Nacional de Lucha
contra la Brucelosis, quienes determinarán conforme a dichas presentaciones, la aprobación de los
mismos.
ARTICULO 22. - Se ejercerá vigilancia epidemiológica en todas las especies susceptibles que
tengan un programa oficial implementado, a través del control de los movimientos de hacienda,
pruebas serológicas en lugares de concentración de animales y mataderos con habilitación nacional
o provincial.
ARTICULO 23. - Las Comisiones Provinciales de Sanidad Animal, creadas por la Ley 23.899,
deberán asesorar a las autoridades nacionales, acerca de la aplicación de la presente ley, dentro
del marco provincial, municipal o zonal.

ARTICULO 24. - El Servicio Nacional de Sanidad Animal y la Comisión Nacional de Lucha contra la
Brucelosis, dispondrá de todas las medidas técnicas y administrativas interpretativas, no
contempladas en la presente ley.
ARTICULO 25. - El Poder Ejecutivo Nacional, reglamentará la presente ley, dentro de los sesenta
días de publicación en el Boletín Oficial.
ARTICULO 26. - Comuníquese al Poder Ejecutivo. - ALBERTO R. PIERRI. - CARLOS F. RUCKAUF.

- Esther H. Pereyra Arandía de Pérez Pardo. - Edgardo Piuzzi.
DADA EN LA SALA DE SESIONES DEL CONGRESO ARGENTINO, EN BUENOS AIRES. A LOS

CUATRO DIAS DEL MES DE SETIEMBRE DEL AÑO MIL NOVECIENTOS NOVENTA Y SEIS.
Decreto 1092/96
Bs. As., 26/9/96
POR TANTO:
Téngase por Ley de la Nación Nº 24696 cúmplase, comuníquese, publíquese, dése a la Dirección
Nacional del Registro Oficial y archívese. - MENEM. - Jorge Rodríguez. - Roque B. Fernández.

RESOLUCIÓN SENASA 150/02
Visto el expediente N° 2024/2002 del registro del Servicio Nacional de Sanidad Animal y Calidad
Agroalimentaria, la Ley N° 24.696, la Resolución N° 115 del 1° de marzo de 1999 de la Secretaría
de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentación y, considerando
que se hace necesario perpeccionar los sistemas de prevención, control y erradicación de las
enfermedades animales, atento a lo expresado en el artículo 1° de la Ley N° 3959, Ley de Policía
Sanitaria Animal.
Que resulta imprescindible dentro de los alcances del artículo 2° de la Ley N° 3959, invitar a los
Gobiernos Provinciales y Municipales a desarrollar acciones que propendan y contribuyan, dentro
de los límites de su respectivo territorio, a los propósitos de esta norma.
Que la Ley N° 24.696 declara de interés nacional el control y la erradicación de la Brucelosis en las
especies bovina, ovina, suina, caprina y otras especies en el Territorio Nacional.
Que por Resoluciones Nros. 202 del 4 de febrero de 1970, 395 del 5 de julio de 1979 y 698 del 28
de octubre de 1980 todas del registro de la ex-Secretaría de Estado de Agricultura y Ganadería se
estableció y amplió la vacunación antibrucélica obligatoria en todo el país, al norte de los ríos
Barrancas y Colorado.
Que el Decreto N° 1585 del 19 de diciembre de 1996, sustituido por su similar N° 394 del 1° de
abril de 2001, asigna al Servicio Nacional de Sanidad Animal y Calidad Agroalimentaria, la
responsabilidad de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal y
vegetal, verificando el cumplimiento de la normativa vigente, siendo el garante internacional, por
medio de sus certificaciones, de las exportaciones agropecuarias y agroalimentarias del país.
Que por Resolución N° 115 del 1° de marzo de 1999 de la Secretaría de Agricultura, Ganadería,
Pesca y Alimentación, se aprobó en todo el Territorio Nacional, el Plan Nacional de Control y
Erradicación de la Brucelosis y Tuberculosis Bovina, Etapa 1998-2001.
Que la aplicación de estrategias como la regionalización, inmovilización de animales, identificación,

trazabilidad y la vacunación estratégica para la prevención, son acciones sanitarias
económicamente viables.
Que el artículo 12 de la Ley N° 24.696 faculta al Servicio Nacional de Sanidad Animal y Calidad
Agroalimentaria, a delegar las acciones de control de la vacunación en entidades, según lo
acuerde, para dar cumplimiento a los objetivos establecidos en la citada ley.
Que mediante la Resolución N° 108 del 16 de febrero de 2001 de la Secretaría de Agricultura,

Ganadería, Pesca y Alimentación, se autorizó la suscripción de convenios con los entes sanitarios, a
fin de ejecutar en comunes acciones sanitarias específicas y que la vacunación antibrucética es una
de ellas.
Que el artículo 13 de la Ley N° 24.696, exige que todo movimiento y traslado de hacienda será
realizado con el consiguiente certificado de vacunación antibrucélica.
Que la Resolución N° 1244 del 25 de agosto de 2000 del Servicio Nacional de Sanidad Animal y
Calidad Agroalimentaria, suspendió temporariamente las exigencias sanitarias exigidas para la
movilización de ganado en el marco del Plan Nacional de Control y Erradicación de la Brucelosis
Bovina.
Que el Servicio Nacional de Sanidad Animal y Calidad Agroalimentaria, por Resolución N° 34 del 4
de enero de 2002, estableció períodos de vacunación antiaftosa para bovinos por Regiones, en el
Territorio Nacional, acorde al cronograma que surja de las condiciones epidemiológicas, de las

características geográficas y productivas de las mismas, incluyendo además otras exigencias que
deben ser atendidas.
Que de acuerdo al resultado de los monitoreos y evaluaciones efectuados en diferentes planes en

la casi totalidad de las regiones bajo vacunación antibrucélica sistemática, resulta necesario
ordenar las fechas y períodos de vacunación, en función de las condiciones geográficas,
epidemiológicas y productivas de las distintas regiones y adecuarlas a las vigentes para la
vacunación antiaftosa.
Que la vacunación de las terneras es una herramienta básica en la lucha contra la Brucelosis, dado
que permite lograr un marcado descenso de la cantidad de animales enfermos en los rodeos.
Que la adopción de un sistema operativo de vacunación simultánea con el de la Fiebre Aftosa, es

posible lograr una alta cobertura vacunal y al mismo tiempo disminuir significativamente el costo
operativo de las acciones sanitarias.
Que la medida propuesta al reducir la prevalencia de la enfermedad, hace posible la segregación

de animales seropositivos, con menor costo financiero en la reposición de vientres y disminución
del número de abortos.
Que es oportuno restablecer la vacunación a partir de la existente organización social que

eficazmente se encuentra abocada al combate de la Fiebre Aftosa.
Que existen establecimientos donde los rodeos tienen una baja tasa de reaccionantes, lo que
constituiría una condición técnica que posibilitaría la eliminación de la infección.
Que por ser la Brucelosis bovina una enfermedad zoonótica, corresponde tomar recaudos
sanitarios para evitar el riesgo de transmisión a la población humana, dado que disminuye la
capacidad laboral del individuo y desmejora la calidad de vida del mismo.
Que se debe remarcar la importancia de contar con rodeos sanos en la producción de alimentos
desde su origen, facilitando de esta manera el control sanitario de calidad total en la cadena de
producción, y respondiendo a las crecientes exigencias de los mercados.
Que debe asegurarse que las terneras a movilizar se encuentren previamente vacunadas y deben
con seguridad encontrarse debidamente protegidas con anterioridad a su egreso o movilización.
Que se hace necesario restablecer un control serológico sobre los movimientos que realicen los
bovinos con destino distinto al de faena.
Que la Dirección de Asuntos Jurídicos ha tomado la intervención que le compete, no encontrando

reparos de orden legal que formular.
Que el suscripto es competente para dictar el presente acto, de conformidad con las atribuciones
conferidas por el artículo 8°, inciso e) del Decreto N° 1585 del 19 de diciembre de 1996, sustituido
por su similar N° 394 del 1° de abril de 2001.
Por ello, el presidente del Servicio Nacional de Sanidad Animal y Calidad Agroalimentaria resuelve:
Artículo. 1 - Restablecer el Programa de Control y Erradicación de la Brucelosis Bovina en todo el

país, conforme las actividades que se detallan en la presente resolución y que incluyen las
exigencias mínimas de cumplimiento para todo el Territorio Nacional.
Artículo 2 - Las Comisiones Provinciales de Sanidad Animal (Coprosas) podrán presentar los planes
que superen las exigencias mínimas establecidas en la presente resolución, a fin de lograr la
erradicación definitiva de la enfermedad.

Dichos planes deberán contar para su aprobación por el Servicio Nacional de Sanidad Animal y
Calidad Agroalimentaria (Senasa) con los siguientes requisitos: a) justificación técnica; b) metas y
plazos para alcanzarlas; c) descripción de mecanismos de auditoría y d) la voluntad expresa de
aquellos productores que representan el sesenta por ciento (60%) o más de la población bovina
del área de aplicación del referido plan y que se obligan a cumplir con las acciones sanitarias
propuestas.
Artículo 3 - La vacunación antibrucélica obligatoria incluye exclusivamente al cien por cien (100%)
de las terneras de tres (3) a ocho (8) meses de edad con Vacuna Brucella abortus Cepa 19,
controlada y aprobada por el Servicio Nacional de Sanidad Animal y Calidad Agroalimentaria e
identificada con estampilla oficial con su serie y vencimiento, se efectuará de acuerdo a lo previsto
en la presente resolución.
Artículo 4 - Los Entes Sanitarios autorizados efectuarán la ejecución, coordinación y el

gerenciamiento bajo su responsabilidad de la totalidad de las actividades de la campaña de
vacunación antibrucélica.
Artículo 5 - La campaña de vacunación antibrucélica será efectuada bajo el sistema de

simultaneidad con las campañas de vacunación antiaftosa, las excepciones para predios con
distintos status sanitarios o por otras causas de fuerza mayor deberán estar debidamente
justificadas por el productor y avaladas y autorizadas por el Ente Sanitario Local, debiendo
realizarse en todos los casos, la vacunación de la totalidad de las terneras existentes en el
establecimiento.
Artículo 6 - El Médico Veterinario Acreditado, corresponsable sanitario, podrá realizar el acto

vacunal exclusivamente, en aquellos predios que se mencionan en el artículo 12 de la presente
resolución, en los que previamente se haya acordado dicha actividad, de acuerdo a lo prescripto en
el artículo precedente.
Artículo 7 - La vacunación antibrucélica acreditada mediante constancia de su registro, será

requisito indispensable para la emisión del Documento para el Tránsito de Animales (DTA).
Artículo 8 - La identificación de todas las terneras vacunadas, será responsabilidad de los Entes
Sanitarios mediante un método uniforme para cada predio, pudiéndose optar entre aquellos
permanentes y fácilmente auditables, no podrán movilizarse terneras vacunadas sin encontrarse
previamente identificadas.
Control de egresos.
Artículo 9 - Hacienda de carne: Todo animal susceptible a la enfermedad (machos enteros mayores
de seis (6) meses y hembras mayores de dieciocho (18) meses) en la categoría reproductores,
deberá contar con un certificado de seronegatividad otorgado por Médico Veterinario Acreditado y
pruebas serológicas realizadas en laboratorio de red.
Artículo 10. - Hacienda de tambo: Todo movimiento de bovinos en las categorías susceptibles a la
enfermedad (machos enteros mayores de seis (6) meses y hembras mayores de dieciocho (18)
meses) que tengan un destino distinto al de faena, deberán contar con un certificado de
seronegatividad otorgado por Médico Veterinario Acreditado y pruebas serológicas realizadas en
laboratorio de red.
control de egresos: Excepciones
Artículo 11. - Quedarán exceptuados de las exigencias previstas en los artículos 9° y 10° de la
presente resolución, los siguientes animales:
a) Aquellos animales que provengan de establecimientos certificados como oficialmente libres de

Brucelosis.

b) Aquellos animales que serán trasladados de un establecimiento a otro, ambos pertenecientes a

un mismo propietario (destino a sí mismo).
c) Aquellos animales que tengan a la faena como destino final.
d) Aquellos animales que provengan de establecimientos en saneamiento y/o saneado y donde los
exámenes serológicos hayan sido realizados con anterioridad en un lapso que no supere los treinta
(30) días. Los mismos deberán arrojar resultado negativo.
Status sanitario de los establecimientos
Artículo 12. - Los status obtenidos hasta el presente por los establecimientos, mantendrán su
reconocimiento como tales. Los mencionados status sanitarios adquiridos son los siguientes:
Establecimiento en Saneamiento: es aquel establecimiento que ha realizado un sangrado inicial a la

totalidad de la hacienda en las categorías susceptibles con pruebas serológicas en laboratorios de
red.
Establecimiento Saneado: es aquel establecimiento que ha alcanzado dos (2) sangrados totales
consecutivos negativos con sesenta (60) a ciento veinte (120) días de intervalo, con pruebas
serológicas en laboratorios de red.
Establecimiento Oficialmente Libre: es aquel establecimiento que ha alcanzado tres (3) sangrados
totales consecutivos negativos en las categorías susceptibles, realizando los dos (2) primeros con
sesenta (60) a ciento veinte (120) días de intervalo y el tercero en un plazo no mayor a trescientos
sesenta y cinco (365) días, con pruebas serológicas en laboratorios de red.
Artículo 13. - A partir de los ciento ochenta (180) días corridos de la puesta en vigencia de la
presente resolución, los establecimientos lecheros, las cabañas y/o los establecimientos dedicados
a la comercialización de reproductores machos, deberán estar incluidos en las categorías de status
sanitarios reconocidos en el artículo precedente.
Recertificación
Artículo 14. - La recertificación que permite a los establecimientos oficialmente libres continuar con
el status sanitario adquirido, será realizada anualmente mediante una serología realizada a la
totalidad de animales susceptibles.
Artículo 15. - Los productores y/o tenedores a cualquier título de ganado bovino y todas las
personas físicas y/o jurídicas vinculadas a la ganadería en todo el Territorio Nacional, estarán
obligados a cumplir las exigencias ordenadas en la presente norma y prestar la colaboración
necesaria con los medios a su alcance.
Artículo 16. - La presente resolución entrará en vigencia a partir de su publicación en el Boletín

Oficial.
Artículo 17. - Comuníquese, publíquese, dése a la Dirección Nacional del Registro Oficial y
archívese. - Bernardo G. Cané.

RESOLUCIÓN 79/2003
Visto el expediente N° 402/2000 del registro del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad
Agroalimentaria, y considerando:
Que se hace necesario perfeccionar los sistemas de prevención, control y erradicación de las
enfermedades animales, atento a lo expresado en el artículo 1° de la Ley N° 3959, Ley de Policía
Sanitaria de los Animales.
Que un sistema eficiente de vigilancia epidemiológica permite la detección temprana de la

Brucelosis Bovina en los establecimientos lecheros con bajos costos, permitiendo implementar
inmediatas medidas de control y erradicación.
Que dicho sistema de vigilancia es necesario para mantener áreas libres de la enfermedad, con
garantías de control, ofreciendo a los compradores de productos lácteos, una evidencia
documental del status sanitario.
Que la incorporación de la Técnica de I-ELISA en leche total del tambo, significará una mejora en
la sensibilidad y especificidad del diagnóstico aplicado a la vigilancia epidemiológica.
Que la Dirección de Laboratorios y Control Técnico del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad
Agroalimentaria, se ha expedido favorablemente respecto a la validación de la Técnica de I-ELISA
en leche total del tambo.
Que la Dirección de Asuntos Jurídicos ha tomado la intervención que le compete, no encontrando

reparos de orden legal que formular.
Que el suscripto es competente para dictar el presente acto en virtud de las facultades conferidas
por el artículo 8°, inciso e) del Decreto N° 1585 de fecha 19 de diciembre de 1996, sustituido por
su similar N° 394 de fecha 1° de abril de 2001.
Por ello, el Presidente del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria resuelve:
Artículo 1° - Adoptar la Técnica de I-ELISA en Leche para el diagnóstico de Brucelosis Bovina en

establecimientos lecheros, aplicada sobre las muestras de leche extraídas de la leche total del
tambo, con los alcances propios de las Pruebas de Vigilancia Epidemiológica.
Artículo 2° - Dicha técnica podrá ser aplicada de manera conjunta con la Prueba de Anillo en Leche
(PAL) o como prueba única por los laboratorios de las usinas lácteas o terceros, que estén
habilitados por la Red de Laboratorios dependiente de la Dirección de Laboratorios y Control
Técnico del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria.
Artículo 3° - Los reactivos, materiales y métodos, personal e instalaciones requeridos para la

ejecución e información de los diagnósticos, deberán ajustarse a las condiciones establecidas por la
Dirección de Laboratorios y Control Técnico del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad
Agroalimentaria.
Artículo 4° - El régimen de aviso de ejecución de las pruebas y la comunicación de los resultados

por parte de las usinas lácteas al Programa de Brucelosis de la Dirección Nacional de Sanidad
Animal dependiente del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria, es el mismo que
rige para las Pruebas de Anillo en Leche (PAL), y queda sujeto a las modificaciones que establezca
dicho Programa.
Artículo 5° - Comuníquese, publíquese, dése a la Dirección Nacional del Registro Oficial y

archívese. Bernardo G. Cané.

Resolución 438/2006
Adóptase el Sistema de Diagnóstico Serológico para el Programa de Control y

Erradicación de la Brucelosis. Técnicas que lo conforman.
Bs. As., 2/8/2006
VISTO el Expediente Nº S01:0213280/2006 del Registro del MINISTERIO DE ECONOMIA Y

PRODUCCION, las Leyes Nros. 3959, 24.696, y
CONSIDERANDO:
Que es necesario perfeccionar los sistemas de prevención, control y erradicación de las

enfermedades animales, atento a lo expresado en el Artículo 1º de la Ley de Policía Sanitaria de los
Animales Nº 3959.
Que por el Artículo 1º de la Ley Nº 24.696, se declara de interés nacional el control y erradicación
de la enfermedad reconocida como Brucelosis (Brucella Abortus) en los bovinos y otras especies,
en todo el Territorio Nacional.
Que el Artículo 2º de la citada Ley Nº 24.696 establece que el SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD
Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, es la autoridad de aplicación de la misma.
Que la incorporación de nuevas técnicas de diagnóstico que se encuentran validadas

internacionalmente, probadas en su capacidad operativa y mejoradas en su sensibilidad y
especificidad, pueden contribuir al control y erradicación de la enfermedad y a facilitar la
armonización del diagnóstico así como favorecer el comercio con otros países.
Que la Comisión Nacional para el Control de la Brucelosis, la Dirección Nacional de Sanidad Animal
y la Dirección de Laboratorios y Control Técnico, se han expedido favorablemente sobre la
conveniencia de incorporar las nuevas técnicas de diagnóstico propuestas.
Que la Dirección de Asuntos Jurídicos ha tomado la intervención de su competencia.
Que el suscripto es competente para resolver en esta instancia conforme las facultades conferidas
por el Artículo 8º, inciso h) del Decreto Nº 1585 de fecha 19 de diciembre de 1996, sustituido por
su similar Nº 680 del 1º de septiembre de 2003.
Por ello,
EL PRESIDENTE DEL SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA
RESUELVE:
Artículo 1º — Adóptase el Sistema de Diagnóstico Serológico para el Programa de Control y

Erradicación de la Brucelosis en la REPUBLICA ARGENTINA, conformado por las siguientes técnicas
de diagnóstico: BPA (Buffered Plate Antigen) e I-ELISA (ELISA indirecto) como Pruebas Tamiz, y
como Pruebas confirmatorias, SAT (Seroaglutinación en Tubo) y 2-ME (2-Mercaptoetanol), FPA
(Polarización Fluorescente), C-ELISA (ELISA Competición) y Fijación del Complemento; para la
Vigilancia Epidemiológica en leche, las Pruebas PAL (Prueba de Anillo en Leche e I-ELISA (ELISA
Indirecto).

Art. 2º — Las Pruebas serológicas mencionadas en el artículo 1º de la presente resolución, se

refieren sólo a aquellas técnicas validadas y cuyos componentes fueron presentados, controlados y
aprobados por la Dirección de Laboratorios y Control Técnico de este Servicio Nacional.
Art. 3º — Las Pruebas citadas precedentemente deberán ejecutarse e interpretarse conforme al

Manual de Procedimientos Técnicos de Diagnóstico de Brucelosis de la Dirección de Laboratorios y
Control Técnico.
Art. 4º — Ante resultados divergentes o contradictorios entre distintas pruebas, la de Fijación del
Complemento obrará como prueba de referencia, estableciendo el diagnóstico serológico definitivo.
Art. 5º — Los resultados del diagnóstico serológico conforme a lo establecido en el Manual de

Procedimientos Técnicos de Diagnóstico de Brucelosis de la Dirección de Laboratorios y Control
Técnico, son un insumo para el diagnóstico de la enfermedad en los animales, rodeos y/o
establecimientos, los cuales deberán interpretarse con criterio epidemiológico por los Veterinarios
Acreditados y de los Servicios Sanitarios Oficiales, para definir las discordancias que puedan
presentarse entre el diagnóstico serológico y la situación epidemiológica.
Art. 6º — Ante casos de discordancia entre la condición epidemiológica y los resultados

serológicos, el Veterinario Acreditado podrá solicitar ante la Oficina Local de la jurisdicción
correspondiente, la revisión del caso por el epidemiólogo asignado al área o al Programa de
Brucelosis del SENASA.
Art. 7º — Para que los diagnósticos puedan ser certificados oficialmente, los reactivos, materiales,
métodos, personal e instalaciones que se utilicen en la ejecución e información de los mismos,
deberán ajustarse a las condiciones establecidas por la Dirección de Laboratorios y Control Técnico
del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTAR1A.
Art. 8º — La Dirección Nacional de Sanidad Animal del mencionado Servicio Nacional podrá revisar
y modificar el Sistema de Diagnóstico aplicado al Programa de Control y Erradicación, conforme a
la evaluación que surja de su aplicación en la lucha sanitaria y a la evolución de la campaña,
manteniendo las condiciones prescriptas en el Artículo 3º de la presente resolución.
Art. 9º — Comuníquese, publíquese, dése a la Dirección Nacional del Registro Oficial y archívese.
— Jorge N. Amaya.

Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos
SANIDAD ANIMAL Y VEGETAL
Resolución 736/2006
Créase la Red Nacional de Laboratorios de Ensayo y Diagnóstico. Marco normativo para

la inscripción en el Registro de la mencionada Red. Excepciones.
Bs. As., 14/11/2006
VISTO el Expediente Nº 16.233/00 del Registro del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD
AGROALIMENTARIA, organismo descentralizado en la órbita de la ex-SECRETARIA DE
AGRICULTURA, GANADERIA, PESCA Y ALIMENTACION del entonces MINISTERIO DE ECONOMIA,
las Resoluciones Nros. 279 del 20 de diciembre de 1993, 301 del 8 de julio de 1994, 142 del 10 de
abril de 1995, todas del ex-INSTITUTO ARGENTINO DE SANIDAD Y CALIDAD VEGETAL, 217 del 7
de abril de 1995 del ex-SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL, ambos organismos
descentralizados en la órbita de la ex- SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA Y PESCA del
entonces MINISTERIO DE ECONOMIA Y OBRAS Y SERVICIOS PUBLICOS, y
CONSIDERANDO:
Que la Dirección de Laboratorios y Control Técnico del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y

CALIDAD AGROALIMENTARIA, organismo descentralizado en la órbita de la SECRETARIA DE
AGRICULTURA, GANADERIA, PESCA Y ALIMENTOS del MINISTERIO DE ECONOMIA Y
PRODUCCION, ha propiciado la revisión de las normas que se mencionan en el Visto de la presente
resolución, reguladoras de la gestión de los Laboratorios de Red, a fin de establecer un nuevo
marco normativo.
Que resulta necesario crear una Red de Laboratorios que integre las redes que actualmente
funcionan en las Coordinaciones Generales de los Laboratorios Animal y Vegetal, en el ámbito de la
Dirección de Laboratorios y Control Técnico del mencionado Servicio Nacional.
Que, asimismo, es imprescindible establecer un único marco normativo para la inscripción en el

Registro de la mencionada Red.
Que la Dirección de Laboratorios y Control Técnico, en su carácter de Laboratorio de Referencia

Nacional, Laboratorio de Referencia del MERCADO COMUN DEL SUR (MERCOSUR) y de la
ORGANIZACION MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL (OIE) para distintas enfermedades animales, y
miembro de la Red Interamericana de Laboratorios de Análisis de Alimentos (RILAA), debe cumplir
y hacer cumplir las Normas de Gestión de Calidad de Laboratorios de ensayo.
Que la aplicación de los principios de Buenas Prácticas de Laboratorio constituye la base de los
procesos de reconocimiento mutuo en los intercambios comerciales entre la REPUBLICA
ARGENTINA y otros países.
Que la Comisión del Codex Alimentarius o Código Alimentario creada en el año 1963 por la
ORGANIZACION DE LAS NACIONES UNIDAS PARA LA AGRICULTURA Y LA ALIMENTACION (FAO) y
la ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD (OMS) para desarrollar normas alimentarias,
reglamentos y otros textos relacionados, recomienda que los laboratorios responsables del control
de exportación e importación de alimentos cumplan con los requisitos de la Norma ISO
(Organización Internacional de Normalización) / IEC (Comisión Electrotécnica Internacional) Nº
17.025/1999 y sean eventualmente acreditados por un organismo competente.

Que la Decisión Nº 98/179/CE del 23 de febrero de 1998 de la COMUNIDAD EUROPEA establece

que a partir del mes de enero de 2002 los laboratorios de control oficial de los terceros países que
exportan alimentos a la UNION EUROPEA, deben estar acreditados con arreglo a la Norma ISO/IEC
Nº 17.025/1999.
Que los Laboratorios de Referencia de los países compradores, como los pertenecientes a la
UNION EUROPEA, ESTADOS UNIDOS DE AMERICA, CANADA y AUSTRALIA, se encuentran
acreditados por la Norma ISO/IEC Nº 17.025/1999 y exigen que el Laboratorio del SERVICIO
NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA y los Laboratorios de la Red del citado
Servicio Nacional también cumplan con dicho requisito para poder aceptar como válidos los
resultados analíticos que se emitan.
Que es necesario contar con una red de laboratorios con criterios de desempeño armonizados para
optimizar su funcionamiento.
Que el CONSEJO DE ADMINISTRACION del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD

AGROALIMENTARIA, organismo descentralizado en la órbita de la SECRETARIA DE AGRICULTURA,
GANADERIA, PESCA Y ALIMENTOS del MINISTERIO DE ECONOMIA Y PRODUCCION, ha tomado su
debida intervención.
Que la Dirección de Legales del Area de AGRICULTURA, GANADERIA, PESCA Y ALIMENTOS

dependiente de la Dirección General de Asuntos Jurídicos del MINISTERIO DE ECONOMIA Y
PRODUCCION, ha tomado la intervención que le compete.
Que el suscripto es competente para resolver en esta instancia atento lo dispuesto por el Artículo
8º, inciso j) del Decreto Nº 1585 del 19 de diciembre de 1996, modificado por su similar Nº 680
del 1 de septiembre de 2003 y conforme lo establecido en el Decreto Nº 25 del 27 de mayo de
2003, modificado por su similar Nº 1359 del 5 de octubre de 2004.
Por ello,
EL SECRETARIO DE AGRICULTURA, GANADERIA, PESCA Y ALIMENTOS
RESUELVE:
Artículo 1º — Créase la Red Nacional de Laboratorios de Ensayo y Diagnóstico dependiente de la

Dirección de Laboratorios y Control Técnico del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD
AGROALIMENTARIA, organismo descentralizado en la órbita de la SECRETARIA DE AGRICULTURA,
GANADERIA, PESCA Y ALIMENTOS del MINISTERIO DE ECONOMIA Y PRODUCCION, que estará
integrada por los Laboratorios que ingresaron a las Redes de Laboratorios en cumplimiento de las
Resoluciones Nros. 279 del 20 de diciembre de 1993, 142 del 10 de abril de 1995, ambas del ex-
INSTITUTO ARGENTINO DE SANIDAD Y CALIDAD VEGETAL, 217 del 7 de abril de 1995 del ex-
SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL, ambos organismos descentralizados en la órbita de la
ex-SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA Y PESCA del entonces MINISTERIO DE
ECONOMIA Y OBRAS Y SERVICIOS PUBLICOS, y por aquellos laboratorios que en el futuro
cumplimenten los requisitos de inscripción en el Registro que por la presente resolución se
establece.
Art. 2º — Los Laboratorios que soliciten la inscripción en el Registro mencionado por el Artículo 1º
de la presente resolución podrán optar por hacerlo en UNA (1) de las siguientes categorías:
"Autorizados" o "Reconocidos".
Art. 3º — En la categoría "Autorizados" se inscribirán los Laboratorios que, cumpliendo los

requisitos establecidos por los Artículos 8º, 9º, 14, 15, 16, 17, 18, 20 21,26, 28, 29 y 30 de la
presente resolución, entre otros emitan protocolos de ensayo basados en el análisis de muestras

oficiales que serán utilizados por el SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD

AGROALIMENTARIA para respaldar certificaciones destinadas a planes nacionales de luchas
sanitarias y para la comercialización de productos fiscalizados por el citado Servicio Nacional en el
mercado interno, la importación y la exportación, quedando expresamente excluidas las auto-
certificaciones.
Art. 4º — Se considerará "Muestra Oficial" a toda muestra tomada de acuerdo a los

procedimientos operativos vigentes para cada caso por personal del SERVICIO NACIONAL DE
SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA o por aquellos profesionales expresamente autorizados
por dicho Servicio Nacional para esa tarea.
Art. 5º — En la categoría "Reconocidos" se inscribirán los Laboratorios que cumpliendo los

requisitos establecidos por los Artículos 8º, 14, 19, 20, 21, 26, 29 y 30 de la presente resolución,
entre otros emitan protocolos de ensayo destinados al autocontrol, verificaciones realizadas por las
empresas en el marco de la comprobación de prerrequisitos y sistemas de Análisis de Peligros y
Puntos Críticos de Control (HACCP), antecedentes para el trámite de registro de productos
agroquímicos, fertilizantes y biológicos de uso agrícola ante el SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y
CALIDAD AGROALIMENTARIA y/o diagnósticos para saneamiento y bioterios que produzcan
animales para ensayo de laboratorio y cumplan con lo establecido por la Resolución Nº 617 del 18
de julio de 2002 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA,
organismo descentralizado en la órbita de la SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA, PESCA
Y ALIMENTOS del entonces MINISTERIO DE LA PRODUCCION.
Art. 6º — Los laboratorios "Autorizados" podrán solicitar incluir dentro de su alcance las
actividades descriptas por el Artículo 5º de la presente resolución.
Art. 7º — La inscripción en la Red de Laboratorios se efectuará en el Registro que a tal efecto

lleve la Dirección de Laboratorios y Control Técnico del citado Servicio Nacional.
Art. 8º — Los laboratorios que integren la Red podrán ser de propiedad de personas físicas o
jurídicas debidamente inscriptas en la INSPECCION GENERAL DE JUSTICIA del MINISTERIO DE
JUSTICIA o su equivalente jurisdiccional, así como de entes centralizados o descentralizados del
ESTADO NACIONAL, Provincial o Municipal y de Universidades Estatales o Privadas.
Art. 9º — Los laboratorios "Autorizados" deberán abstenerse de efectuar análisis sobre material
proveniente de cualquier empresa con la cual mantengan algún tipo de vinculación o dependencia
que pueda afectar su independencia de juicio.
Art. 10. — Quedan expresamente exceptuados del cumplimiento del Artículo 9º de la presente
resolución los Laboratorios de establecimientos que realizan el diagnóstico de enfermedades
animales "in situ" en el proceso de faena bajo la supervisión de la Inspección Veterinaria en
establecimientos habilitados por el SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD
AGROALIMENTARIA.
Art. 11. — La Dirección de Laboratorios y Control Técnico definirá en base a la información

acercada por las distintas áreas de ese Organismo los rubros para los cuales se podrán inscribir los
laboratorios que ingresen a la Red de Laboratorios del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y
CALIDAD AGROALIMENTARIA, que podrán ser modificados cuando así lo exijan las necesidades de
servicio.
Art. 12. — Cuando un laboratorio desarrolle actividades simultáneas en el campo de la Sanidad

Animal, la Sanidad Vegetal y el Control de Alimentos, que puedan producir contaminación cruzada
e interferencia en los materiales de análisis, deberán realizarse en instalaciones independientes.

Art. 13. — Los Laboratorios integrantes de la Red de Laboratorios del SERVICIO NACIONAL DE
SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA deberán implementar y mantener vigentes los
procedimientos operativos que aseguren la confidencialidad de la información respecto al origen de
la muestra y a los resultados obtenidos; debiendo estar dicha información a disposición del
SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA.
Art. 14. — Los laboratorios deberán conocer y dar cumplimiento a la normativa vigente en el lugar
de su radicación respecto a las condiciones edilicias, medioambientales y de seguridad e higiene.
Art. 15. — Los laboratorios "Autorizados" que a la fecha de vigencia de la presente resolución
pertenezcan a la Red de Laboratorios del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD
AGROALIMENTARIA deberán acreditar ensayos según la Norma ISO (Organización Internacional de
Normalización) / IEC (Comisión Electrotécnica Internacional) Nº 17.025/1999 / IRAM (INSTITUTO
ARGENTINO DE NORMALIZACION Y CERTIFICACION) Nº 301:2000 o su última versión vigente,
con un alcance mínimo durante la primera etapa de la acreditación que cumpla con las siguientes
premisas:
a) UN (1) ensayo como mínimo por cada tipo de metodología analítica.
b) El VEINTE POR CIENTO (20%) de los rubros analíticos autorizados incluidos en el alcance.
Art. 16. — El plazo para dar cumplimiento a lo estipulado en el Artículo 15 de la presente

resolución para los laboratorios "Autorizados" que realicen Análisis de Alimentos y Residuos será de
DIECIOCHO (18) meses a partir de la fecha de publicación de la presente resolución en el Boletín
Oficial.
(Nota Infoleg: por art. 1º de la Resolución Nº 58/2009 de la Secretaría de Agricultura, Ganadería,

Pesca y Alimentos B.O. 9/2/2009 se prorroga el plazo establecido en el presente artículo hasta el
31 de diciembre del año 2009)
Art. 17. — El plazo para dar cumplimiento a lo estipulado en el Artículo 15 de la presente

resolución para los laboratorios "Autorizados" que realicen Análisis de Diagnóstico Veterinario y que
a la fecha de vigencia de la presente resolución formen parte de la Red de Laboratorios del
SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA será de TREINTA Y SEIS (36)
meses a partir de la fecha de publicación de la presente resolución en el Boletín Oficial.

Art. 18. — Sólo se reconocerán acreditaciones realizadas por el ORGANISMO ARGENTINO DE

ACREDITACION (OAA) u otros Organismos de Acreditación firmantes de los Acuerdos de
Reconocimiento Multilateral (MLA) de la Cooperación Internacional de Acreditación de Laboratorios
(ILAC).
Art. 19. — Los laboratorios "Reconocidos" deberán cumplir con los requisitos de Buenas Prácticas
de Laboratorio (BPL) en un plazo de VEINTICUATRO (24) meses.

Art. 20. — Los laboratorios "Autorizados" y "Reconocidos" que realicen análisis de diagnóstico
veterinario, fitosanitario y/o alimentos tendrán un plazo de DOCE (12) meses a partir de la fecha

de publicación de la presente resolución en el Boletín Oficial para dar cumplimiento a los requisitos
de Bioseguridad que la Dirección de Laboratorios y Control Técnico del SERVICIO NACIONAL DE
SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA establezca.
Art. 21. — Todo Laboratorio que solicite el ingreso a la Red de Laboratorios del SERVICIO
NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA o que incorpore nuevos rubros con
posterioridad a la fecha de vigencia de la presente resolución, deberá dar cumplimiento a los
requisitos establecidos para la categoría por él requerida, no pudiendo superar el proceso de
implementación los plazos límites indicados conforme a su categoría por los Artículos 16, 17, 18 y
20 de la presente resolución.
Art. 22. — El personal de la Dirección de Laboratorios y Control Técnico evaluará la pericia técnica
del personal responsable de ejecutar el análisis correspondiente al rubro solicitado.
Art. 23. — La Dirección de Laboratorios y Control Técnico auditará y/o inspeccionará los
laboratorios dejando constancia de lo actuado a través del labrado de la correspondiente acta.
Art. 24. — Los responsables de los Laboratorios Inscriptos en la Red de Laboratorios del
SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA deberán permitir el ingreso del
personal de ese Organismo a todas sus dependencias.
Art. 25. — La Dirección de Laboratorios y Control Técnico determinará las acciones a seguir en
aquellos casos en que se suscitaren controversias sobre los resultados de ensayos emitidos por los
establecimientos que conforman la Red de Laboratorios del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y
CALIDAD AGROALIMENTARIA.
Art. 26. — Los laboratorios que integren la mencionada Red de Laboratorios podrán derivar
muestras para su ensayo únicamente a otro laboratorio inscripto en dicha Red con las siguientes
limitaciones:
a) Un laboratorio "Autorizado" podrá derivarla exclusivamente a otro laboratorio "Autorizado" para

tal rubro.
b) Un laboratorio "Reconocido" podrá derivarla a otro laboratorio "Reconocido" para ese rubro, o
bien un laboratorio "Reconocido" podrá derivarla exclusivamente a otro laboratorio "Autorizado"
para ese rubro.
Art. 27. — En toda oportunidad en que un laboratorio tenga la necesidad de efectuar una
derivación de muestras deberá asegurar que en el proceso total se cumplan los plazos analíticos
establecidos y las condiciones especificadas por la Dirección de Laboratorios y Control Técnico
acompañando la muestra con la documentación correspondiente, que estará a disposición de las
autoridades.
El informe del resultado será emitido por el laboratorio que realiza el análisis quedando
expresamente prohibida la transcripción de resultados.
Art. 28. — Los protocolos analíticos emitidos por los laboratorios "Autorizados" serán impresos en
formularios prenumerados que a tal efecto ha desarrollado el SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y
CALIDAD AGROALIMENTARIA y podrán ser adquiridos en la sede de la Dirección de Laboratorios y
Control Técnico de ese Organismo. Se deberán confeccionar por triplicado, no alterando su
correlatividad en el uso, debiendo utilizar tantos formularios prenumerados como hojas requiera el
informe de resultados correspondiente a cada solicitud de análisis ingresada.

Las copias de los informes de resultados así como los formularios anulados y/o descartados
deberán ser archivados correlativamente y conservados por un término no inferior a SEIS (6) años.
Art. 29. — Todo establecimiento de la Red de Laboratorios del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD
Y CALIDAD AGROALIMENTARIA que detecte sustancias prohibidas o cuya concentración supere los
límites legales y tengan efecto nocivo o que obtenga resultados de diagnósticos que indiquen la
presencia de enfermedades denunciables según la reglamentación vigente y/o agentes que afecten
la sanidad animal o vegetal y/o la salud pública, deberá comunicarlo inmediatamente, de forma
fehaciente, no pudiendo superar el plazo de la comunicación del hallazgo las VEINTICUATRO (24)
horas a partir de la detección, a la Dirección de Laboratorios y Control Técnico y a las Direcciones
Nacionales mencionadas a continuación, según corresponda, con copia a sus áreas dependientes
con responsabilidad en el tema:
a) A la Dirección Nacional de Fiscalización Agroalimentaria.
b) A la Dirección Nacional de Sanidad Animal.
c) A la Dirección Nacional de Protección Vegetal.
Art. 30. — Los Laboratorios que conforman la Red deberán remitir a la Dirección de Laboratorios y
Control Técnico en forma trimestral la siguiente información:
a) La estadística de los análisis realizados con los formatos establecidos por la Dirección de
Laboratorios y Control Técnico.
b) La estadística de contaminantes en alimentos según el formato del Programa Operativo para

Laboratorios Analíticos (OPAL 1) correspondiente al Programa de Vigilancia y Evaluación de la
Contaminación de los Alimentos de la ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD (OMS) o su última
versión.
Art. 31. — La Dirección de Laboratorios y Control Técnico publicará, a través del sitio oficial en
Internet de ese Organismo, la información actualizada de altas o bajas producidas en el Registro
de la Red de Laboratorios del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA.
Art. 32. — Para los rubros que se establezcan conforme a la previsión contemplada en el Artículo
11 de la presente resolución, el personal del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD
AGROALIMENTARIA sólo podrá aceptar los resultados de análisis provenientes de los laboratorios
de la Dirección de Laboratorios y Control Técnico de ese Organismo o bien de los laboratorios
pertenecientes a la Red de Laboratorios del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD
AGROALIMENTARIA.
Art. 33. — El personal del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA

aceptará excepcionalmente los informes de resultados originados en laboratorios que no
pertenecen a la Red de Laboratorios de ese Organismo, que correspondan a denuncias de
hallazgos que afecten la salud animal, vegetal y/o pública o que son fundamento para la denuncia
del incumplimiento de la legislación vigente o de una situación emergente.
Es potestad del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA confirmar

dichos resultados en su Dirección de Laboratorios y Control Técnico o en un Laboratorio de la Red
de Laboratorios del mismo.
Art. 34. — Los laboratorios de la Red de Laboratorios del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y
CALIDAD AGROALIMENTARIA serán identificados con un número de registro constituido por
CUATRO (4) dígitos, al cual se le antepondrá las letras: Laboratorio Autorizado "LA" y Laboratorio

Reconocido "LR". La numeración será correlativa, comenzando desde el número UNO (1). Cuando
el número sea de UN (1) dígito se le agregarán TRES (3) ceros a la izquierda. La letra "L" y los
números identificatorios se escribirán sin dejar espacios ni agregar guiones. Todo laboratorio que
posea más de una autorización mantendrá UN (1) único número de registro, que tendrá validez
para desarrollar la totalidad de las actividades autorizadas y/o reconocidas.
Art. 35. — Exceptúanse del alcance de la presente resolución a los laboratorios involucrados en la
Resolución Nº 988 del 1 de septiembre de 1994 del ex-SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL,
organismo descentralizado en la órbita de la ex-SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA Y
PESCA del entonces MINISTERIO DE ECONOMIA Y OBRAS Y SERVICIOS PUBLICOS.
Art. 36. — Los infractores a la presente resolución, previo procedimiento que asegure el derecho
de defensa del imputado, serán pasibles de las sanciones previstas en el Artículo 18 del Decreto Nº
1585 del 19 de diciembre de 1996.
Art. 37. — Deróganse las Resoluciones Nros. 279 del 20 de diciembre de 1993, 301 del 8 de julio
de 1994, 142 del 10 de abril de 1995, todas del ex- INSTITUTO ARGENTINO DE SANIDAD Y
CALIDAD VEGETAL y 217 del 7 de abril de 1995 del ex- SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD
ANIMAL, ambos organismos descentralizados en la órbita de la ex-SECRETARIA DE AGRICULTURA,
GANADERIA Y PESCA del entonces MINISTERIO DE ECONOMIA Y OBRAS Y SERVICIOS PUBLICOS.
Art. 38. — Facúltase al SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA a

dictar las normas complementarias y/o reglamentarias de la presente resolución.
Art. 39. — La presente resolución entrará en vigencia a partir de su publicación en el Boletín

Oficial.
Art. 40. — Comuníquese, publíquese, dése a la Dirección Nacional del Registro Oficial y archívese.
— Miguel S. Campos.

Informe de la Subcomisión Técnica de la Comisión Nacional de Brucelosis
Integrantes: Dr. Eduardo Bagnat, SENASA; Dr. Eduardo Moras, Fac. Vet UBA; Dra.
Marcela Martínez Vibot, Fac. Vet UBA; Dr. Luis Samartino, INTA; Dra. Susana T. de
Echaide, INTA; Dra. Irene Walsh, AAVLD; Dr. Guillermo López, DIPRODESA; Dra. Cecilia
Di Lorenzo, Coleg. Med. Vet, Bs. As; Dra. Ana M. Nicola, SENASA.
CAMBIO DEL PUNTO DE CORTE DE LA PRUEBA 2- MERCAPTOETANOL
Se decidió cambiar la interpretación oficial del resultado de la Prueba de aglutinación, del 2-

Mercaptoetanol para los bovinos.
Será considerado Reactor Serológico Positivo a todo animal que en la Prueba de aglutinación
del 2-Mercaptoetanol, presente reacción de aglutinación en la dilución 1/50 (sea esta reacción
completa o incompleta) o mayor siendo esta realizada conforme al Manual de Brucelosis de la
DILACOT-SENASA.
Todo animal cuya reacción de aglutinación en la Prueba del 2-Mercaptoetanol se presente
únicamente en la dilución 1/25, sea esta completa o incompleta, será considerado seroreactor
Negativo.
Datos analizados
INTA Castelar
Proporcionó a la subcomisión Técnica de Brucelosis el resultado del diagnóstico serológico sobre un
total de 1672 sueros de diversos establecimientos que fueran remitidos a esa unidad de
diagnóstico y a los cuales se le realizara las Pruebas de Fijación de Complemento, SAT y 2-ME.
Siendo que se observaba, por parte de especialistas y profesionales de campo, reacciones que no
superaban la dilución 1/25 en la Prueba del 2-Mercaptoetanol y muchas de las cuales no
reaccionaban en la dilución 1/50 en la Prueba del SAT y que además ocurrían en animales de
establecimientos cuya epidemiología no manifestaba indicios de presencia de la enfermedad, se
consideró la necesidad de analizar el error de diagnóstico que se producía en este estrato reactor
serológico tomando como referencia la Prueba de Fijación de Complemento (estándar de oro).
Del total de 1672 sueros, 170 sueros (10%) reaccionaron sólo en la dilución 1/25 al 2-ME
y fueron a su vez Negativos a la FC` y no superaron la dilución 1/50 al SAT. Por otra
parte hubo 6 sueros (0,3%) con ese nivel de reacción al 2-ME y al SAT, que resultaron
Positivos a la Fijación de Complemento.
170 sueros resultaron falsos positivos (FP), esto es reactores 1/25 al 2-ME y Negativos a la FC` y,
6 sueros resultaron Verdaderos Positivos (VP) (+ 1/25 al 2-ME y Positivos a la FC`).

La relación FP/ VP fue de 35/1
EE INTA RAFAELA
Sobre un total de 801 sueros 51 (6,3%) se encontraban en ese estrato reactor (FC` Negativo,
SAT 1/50 o menos y 2-ME 1/25). Hubo 2 sueros (0,2%) FC` Positivo, SAT 1/50 o menos y 2-
ME 1/25
51 sueros resultaron FP y 2 sueros resultaron VP
La relación FP/VP fue 51/2= 25/1
Conclusión:
La cantidad de Falsos Positivos que cuesta detectar (1) uno verdadero positivo, en
el estrato de reactor estudiado, fue de 35 y 25 en cada estudio. Ello significa un
costo muy elevado.
Al cambiar el nivel de corte del 2-ME de la dilución 1/25 al de la dilución 1/50 (sea
esta reacción completa o incompleta), el Verdadero Positivo pasará a ser un Falso
Negativo.
Por otro lado se observa que en el nuevo punto de corte, reactor en la dilución
1/50 (sea esta reacción completa o incompleta), hay predominio de los verdaderos
positivos (FC` Positivos) respecto de los Falsos Positivos (FC` Negativos). Esta
relación costo /beneficio justifica la modificación.
Debe considerarse que esta modificación se refiere a la interpretación estándar

oficial de la serología que se incorpora al Manual de Procedimientos de la
Brucelosis de la DILACOT-SENASA. Ello debe distinguirse de la práctica particular
de saneamiento donde el profesional sanitarista puede y debe interpretar los
resultados serológicos con un CRITERIO EPIDEMIOLÓGICO adecuado al caso
particular de aplicación.
Asimismo debe tenerse presente para los procedimientos de certificación, que en

aquellos casos en que el profesional encuentre discordancia de los resultados con la
condición epidemiológica, podrá solicitar que sean consideradas sus discrepancias
con la interpretación oficial para su caso, Res. SENASA 438/06.
Ver tabla a continuación

A partir de Diciembre 2006
TABLA DE DECISIÓN
(Hembras vacunadas mayores de 18 meses)
BPA WRIGHT 2-ME INTERPRETACIÓN
- NSH NSH NEGATIVO
+ ≤ 50 UI - NEGATIVO
+ I 100UI - SOSPECHOSO
+ 100 UI - SOSPECHOSO
+ I 200 UI - SOSPECHOSO
+ 200UI - POSITIVO
+ I 50UI ≥ I 50 UI POSITIVO
Referencias
I = Incompleto
NSH = No se hace
UI = Unidades Internacionales
+ = Positivo
- = Negativo

REFERENCIAS
1) ALTON G.G., JONES L.M., ANGUS R.D. & VERGER J.M. (1988). Techniques for the Brucellosis
Laboratory. Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, France.
2) ANGUS R.D. & BARTON C.E. (1984). The production and e valuation of a buffered plate
antigen for use in a presumptive test for brucellosis. Dev. Biol. Stand., 56, 349–356.
3) Centro Panamericano de Zoonosis – Nota Técnica Nº 2.
4) GALL D., NIELSEN K., FORBES L., COOK W., LECLAIR D., BALSEVICIUS S., KELLY L., SMITH P. &
MALLORY M. (2001). Evaluation of the fluorescence polarization assay and comparison to
other serological assays for detection of brucellosis in cervids. J. Wildl. Dis., 37, 110–118.
5) GALL D., NIELSEN K., FORBES L., DAVIS D., ELZER P., OLSEN S., BALSEVICIUS S., KELLY L., SMITH P.,
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to other serological tests for detection of serum antibody to Brucella abortus in bison. J.
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the diagnosis of bovine brucellosis. Vet. Rec., 117, 444–445.
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y del Molise “G. Caporale” Teramo, Italia
12) Manual de Procedimientos Técnicas para el Diagnóstico de Brucelosis Humana 2008. Servicio de
Brucelosis Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”, Centro
Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para América del Sur
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18) NIELSEN K., GALL D., JOLLEY M., LEISHMAN G., BALSEVICIUS S., SMITH P., NICOLETTI P. & THOMAS F. (1996). A
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20) NIELSEN K., KELLY L., GALL D., NICOLETTI P. & KELLY W. (1995). Improved competitive enzyme
immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis. Vet. Immunol. Immunopathol., 46, 285–291.
21) NIELSEN K., SAMAGH B.S., SPECKMANN G. & STEMSHORN B. (1979). The bovine immune response to
Brucella abortus. II. Elimination of some sporadic serological reactions by chelation of divalent
cations. Can. J. Comp. Med., 43, 420–425.
22) Norma IRAM 301
23) Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). “Manual of standards for diagnostic test &
vaccines”, edición 2008.
24) OIE Quality standard and guidelines for veterinary laboratory: Infectious diseases. 2008
25) SENASA. Manual de procedimientos de técnicas diagnósticas en Brucelosis. 1998.
26) SENASA. Resolución 1484/93
27) SENASA. Resolución 150/02
28) SENASA Resolución 79/03
31) SENASA SAGyP Resolución 736/06
32) Silva Paulo, P.; Vigliocco, A.M., Ramondino, R., Marticorena, D., Bici, E., Briones, G.,
Gorchs, C., Gall, D., Nielsen, K. 2000. Evaluation of primary binding assays for
presumptive serodiagnosis of swine brucellosis in Argentina. Clin. Diag. Lab. Immunol.
7:828-831.
33) Szyfres, B. 1983. El Diagnóstico de la Brucelosis Bovina en el Contexto de un Programa de

lucha. Boletín Técnico Nº2. IICA/SENASA
34) Vanzini, V., Aguirre, N., Lugaresi, C.I., de Echaide, S., de Canavesio, V.G., Guglielmone,
A., Marchesino, M., Nielsen, K. 1998. Evaluation of a Indirect ELISA for the diagnosis of
bovine brucellosis in milk and serum samples in dairy cattle in Argentina. Preventive Vet.
Med. 36:211-217.
35) Vanzini, V., Echaide, S., 1998. Brucelosis Enzimoinmunoensayo Indirecto para detectar
anticuerpos anti-Brucella abortus en bovinos. Versión traducida y actualizada con datos
obtenidos en la EEA Rafaela.
36) STACK J.A., PERRETT L.L., BREW S.D., MACMILLAN A.P. (1999). C-ELISA for bovine brucellosis suitable for
testing poor quality samples. Vet. Record, 145, 735–736.
37) WEYNANTS V., GILSON D., CLOECKAERT A., TIBOR A., DENOEL P.A., GODFROID F., LIMET J.N. & LETESSON J.J.
(1997). Characterization of smooth-lipopolysaccharide and O polysaccharides of Brucella species by
competition binding assays with monoclonal antibodies. Infect. Immun., 65, 1939–1943.

38) WORLD HEALTH ORGANIZATION (1993). WHO Laboratory Biosafety Manual, Second Edition. WHO,
Geneva, Switzerland.
39) WORLD HEALTH ORGANIZATION (2005). WHO Laboratory Biosafety Manual, Second Edition. WHO,
Geneva, Switzerland.
40) WRIGHT P.F., NILSSON E., VAN ROOIJ E.M.A., LELENTA M. & JEGGO M.H. (1993). Standardisation and
validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in
infectious disease diagnosis. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 12, 435–450.
41) WRIGHT P.F., TOUNKARA K., LELENTA M. & JEGGO M.H. (1997). International reference Standards:
antibody standards for the indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Rev. Sci. Tech., 3, 824–
832.

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SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA

Manual de Diagnóstico serológico de Brucelosis Bovina Página 1 de 95

Dr. Jorge Amaya

Ing. Agr. Carlos Paz

Ing. Agr. Diana Guillén

Lic. Verónica Torres Leedham

Dr. Jorge Rodríguez Toledo

Manual de Diagnóstico serológico de Brucelosis Bovina Página 2 de 95

Las mencionadas técnicas son las internacionalmente reconocidas y recomendadas por la

Versión 3.0/2009 Elaborado por:

Aprobado por: Dr. Jorge Rodríguez Toledo

Manual de Diagnóstico serológico de Brucelosis Bovina Página 3 de 95

Introducción Brucelosis Bovina 6

Medidas Generales de Bioseguridad y Seguridad 9

Pruebas de screening con antígenos 14

Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo 17

Pruebas de anillo en leche 23

Guía de problemas y soluciones 38

ELISA por competición 40

Ensayo de Polarización Fluorescente 46

Informe de la Subcomisión Técnica de la 90

Manual de Diagnóstico serológico de Brucelosis Bovina Página 4 de 95

Manual de Diagnóstico serológico de Brucelosis Bovina Página 5 de 95

La brucelosis se ha descrito también en el camello de una joroba (Camelus dromedarius) y en el de

El manual de bioseguridad para laboratorios elaborado por la Organización Mundial de la Salud

Manual de Diagnóstico serológico de Brucelosis Bovina Página 6 de 95

reconocidas. Hay investigaciones en curso para establecer su posición correcta en la taxonomía

Identificación del agente: La evidencia preliminar de Brucella la suministra la observación de la

Manual de Diagnóstico serológico de Brucelosis Bovina Página 7 de 95

Manual de Diagnóstico serológico de Brucelosis Bovina Página 8 de 95

MEDIDAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD Y SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Cada laboratorio está obligado a desarrollar o adoptar un manual de operaciones o de

El acceso al laboratorio debe ser limitado o restringido

Cada laboratorio debe contener una pileta para el lavado de manos.

El laboratorio deber ser diseñado para que su limpieza sea sencilla.

Se deben usar ambos, delantales, batas o uniformes de laboratorio de protección adecuados

Manual de Diagnóstico serológico de Brucelosis Bovina Página 9 de 95

Se debe aplicar políticas para el manejo seguro de objetos cortantes o punzantes.

Agente: Brucella (B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. suis)

El género Brucella es clasificado por el “Manual de Bioseguridad en el Laboratorio de la OMS”, en el

La brucelosis sigue siendo la infección bacteriana de laboratorio más comúnmente informada.

Riesgos de laboratorio: El agente puede estar en sangre, en el fluido cerebroespinal, en el semen

Manual de Diagnóstico serológico de Brucelosis Bovina Página 10 de 95

Aseguramiento de calidad en el Laboratorio

Se deberá cumplimentar la reglamentación vigente de acuerdo a las BPL (SENASA), Norma

Control de calidad de insumos

El agua empleada en el laboratorio de diagnóstico de brucelosis debe ajustarse a las

En la preparación de soluciones para pruebas serológicas, soluciones tamponadas, medios de

Para preparar reactivos y soluciones de referencia, realizar pruebas de ELISA y reconstituir

Manual de Diagnóstico serológico de Brucelosis Bovina Página 11 de 95

REGISTRO DE ENTRADA DE MUESTRAS

mínimo la siguiente información:

 Fecha de recepción de muestras

 Fecha de extracción de muestras

 Procedencia: establecimiento, número de RENSPA

 Localidad: departamento, partido, provincia

 Remitente: veterinario acreditado, nombre y número de

 Motivo del envío: saneamiento, traslado, importación, exportación y otros

 Fecha de emisión de los resultados.

CARACTERISTICAS Y CONDICIONES DE LAS MUESTRAS

Condiciones de "recepción" de las muestras:

 Sangre entera o suero refrigerados.

Condiciones de "rechazo" o demora del procesamiento de las muestras:

Fecha de recepción de muestras

Fecha de extracción de muestras

Procedencia: establecimiento, número de RENSPA

Localidad: departamento, partido, provincia

Remitente: veterinario acreditado, nombre y número de

Motivo del envío: saneamiento, traslado, importación, exportación y otros

Fecha de emisión de los resultados.

Sangre entera o suero refrigerados.

Falta de planillas protocolo o planillas incompletas.

Sangre entera congelada.

Sangre entera o suero, contaminados.

La existencia de hemólisis excluye el empleo del método de tubo y placa.

La presencia de hemólisis en las muestras de suero interfiere en la prueba de aglutinación