Guia Lab

Laboratorio de Análisis
Instrumental Licenciatura en
Bioquímica
Dra. Marlen Gutiérrez Cutiño

2013
Universidad de Santiago de Chile
Facultad de Química y Biología
Análisis Instrumental
Licenciatura en Bioquímica
Evaluación
En el presente laboratorio se evaluará de la siguiente forma:
1. Reportes 40%
 Se deben entregar al inicio del próximo laboratorio.
 Los atrasos en la entrega implica descuentos de 1 punto por día de
atraso.
 La no entrega de algo de los informes es causa de reprobación del
curso.
2. Pruebas de Ciclo 60%
En cada sesión de laboratorio es OBLIGATORIO
1. Asistir con delantal blanco, gafas de seguridad y cuadernos de laboratorio.

2. Respetar el horario de entrada
3. Respetar las normas básicas de comportamiento y convivencia dentro de un
laboratorio(no comer, no beber, no fumar, no hacer bromas)
4. Evitar el uso de zapatos descubiertos, pantalones cortos, vestidos, faldas y
pelo suelto.
5. Justificar Inasistencia (Certificado)
2
Distribución de Grupos de Laboratorio Lunes Módulos 9-10-11-12
II
III
IV
Calendario de Actividades
Introducción 25/03/13
Laboratorio Laboratorio Laboratorio Laboratorio Laboratorio

Fecha
1 2 3 4 5
1 Abril I II III IV V
8 Abril V I II III IV
15 Abril IV V I II III
22 Abril III IV V I II
29 Abril II III IV V I
Recuperativos 6 de Mayo 2013
Prueba de Laboratorio 13 de Mayo de 2013 TODOS LOS GRUPOS
3
Distribución de Grupos de Laboratorio Martes Módulos 9-10-11-12
II
III
IV
Calendario de Actividades
Introducción 26/03/13
Laboratorio Laboratorio Laboratorio Laboratorio Laboratorio

Fecha
1 2 3 4 5
2 Abril I II III IV V
9 Abril V I II III IV
16 Abril IV V I II III
23 Abril III IV V I II
30 Abril II III IV V I
Recuperativos 7 de Mayo 2013
Prueba de Laboratorio 14 de Mayo de 2013 TODOS LOS GRUPOS
4
LABORATORIO Nº 1
POTENCIOMETRIA ACIDO-BASE
INTRODUCCIÓN
Los métodos potenciométricos de análisis se basan en las medidas del

potencial de las celdas electroquímicas en ausencia de corrientes apreciables. Para
ellos se necesita un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un
instrumento para la medida.
El potencial de un electrodo indicador adecuado se puede utilizar para

establecer el punto de equivalencia de una valoración (valoración potenciométrica).
El punto final potenciométrico es ampliamente aplicable y proporciona datos más
precisos que los métodos que utilizan indicadores. Este tipo de valoraciones es
muy útil en la valoración de soluciones coloreadas, turbias y para detectar la
presencia de especies insospechadas en solución.
La utilidad del pH como una medida de la acidez a basicidad de un medio

acuoso y la amplia disponibilidad de electrodos indicadores de pH (electrodos de
vidrio), han hecho que las medidas potenciométricas sean una de las medidas más
utilizadas en el análisis químico.
VALORACIONES POTENCIOMÉTRICAS
Dentro de los métodos potenciométricos de análisis nos encontramos con

las valoraciones potenciométricas, entendiendo por valoración potenciométrica, una
valoración basada en medidas de potenciales de un electrodo indicador adecuado
en función del volumen de agente valorante adicionado.
Una valoración potenciométrica implica dos tipos de reacciones:  Una

reacción química clásica, base de la valoración y que tiene lugar al reaccionar el
reactivo valorante añadido a la solución, o generado culombimétricamente, con la
sustancia a valorar.  Una o varias reacciones electroquímicas indicadoras de la
actividad, concentración, de la sustancia a valorar, del reactivo o de los productos
de reacción.
De esta forma, el valor del potencial medido por el electrodo indicador varía
a lo largo de la valoración, traduciéndose el punto de equivalencia por la aparición
de un punto singular en la curva: potencial en función de la cantidad de reactivo
añadido. La detección de este punto, punto final, puede establecerse de distintas
formas:
5
Método Directo
Consiste en graficar los datos de

potencial en función del volumen de reactivo.
El punto de inflexión en la parte ascendente
de la curva se estima visualmente y se toma
como punto final.
Método de la Primera Derivada

Implica calcular el cambio de potencial
por  unidad de volumen de  titulante (∆E/∆V).
El  grafico de estos datos  en función
del  volumen promedio V  produce una curva
con un máximo que corresponde al punto de
inflexión. Si la curva es simetría, el punto máximo
de la pendiente coincide con el de equivalencia.
Las curvas asimétricas dan un pequeño error de
titulación si el punto máximo se toma como el
final. Estas curvas son comunes cuando el
número de electrones transferidos es diferente
en las semireacciones del analito y titulante.
Método de la Segunda Derivada
En este caso se grafica ∆2E/∆2V de la figura

puede verse que la segunda derivada de los datos
cambia de signo en el punto de inflexión. Este
cambio de signo es tomado en algunos casos como
punto final. El punto final de la titulación se toma en
el punto de intersección de la segunda derivada con
cero. Este punto puede ser ubicado con mucha
precisión.
6
Método de Gran
Consiste en graficar ∆V/∆E en función del

volumen promedio de  titulante. Antes y
después  del punto de equivalencia  ∆V/∆E
varia linealmente con el volumen, las dos líneas
se interceptan y el punto de equivalencia es el
punto de intersección.
Este método no requiere datos muy cercanos al

punto de equivalencia es muy preciso. Este
procedimiento alternativo es más preciso ya la
ventaja de requerir menos puntos
experimentales que un gráfico convencional, y proporcionan puntos finales más
precisos en aquellos casos que la variación del potencial medido sea pequeña en
la región del punto equivalente.
En función del tipo de reacciones químicas que tiene lugar durante la

valoración potenciométrica, podemos dividir en
 Acido –Base
 Precipitación
 Formación de Complejos
 Oxido – Reducción
El método potenciométrico se basa en las medidas de potencial de una

celda electroquímica en ausencia de corriente. Para ello se necesita un electrodo
de trabajo, un electrodo de referencia y un instrumento para la medida.
El potencial del electrodo de referencia es conocido, constante y debe ser

insensible a los cambios de composición de la disolución en estudio. Por otra parte,
debe ser reversible y obedecer a la ecuación de Nernst.
Como electrodo indicador se utiliza el electrodo de membrana de vidrio, el

cual es sensible a los cambios de pH de la disolución.
Electrodos de Membrana de Vidrio
El electrodo de pH pertenece al grupo de electrodos de membrana sólida,

siendo el mejor de los electrodos selectivos y es sensible a H+. La composición de
los electrodos de vidrio usados para la medida del pH corresponde a, silicatos con
modificadores iónicos. La naturaleza del vidrio usado para la construcción de los
electrodos es un factor muy importante, como veremos más adelante. Existen dos
grandes tipos:
7
Membrana T : Na2O – CaO - SiO2 (22:6:72)%
Membrana U : Li2O - Cs2O2 – BaO - La2O3 - SiO2 (28:2:4:3:63)%
Estos modificadores iónicos retardan la hidrólisis del silicato.
Cuando se sumerge el electrodo en agua, en la capa superficial existe un

proceso de intercambio iónico entre el H+ de la disolución externa y el Na+ ó Li+ de
la membrana.  La actividad del agua en la disolución juega un papel muy
importante en la respuesta del pH en la membrana de vidrio. Por ello, todos los
electrodos de vidrio deben ser acondicionados durante un tiempo en agua, tampón
diluido ó KCl, formándose un gel sobre la membrana. Con ésta capa sobre la
membrana disminuyen los errores cuando medimos el pH en disoluciones de
fuerza iónica extremadamente alta, ó cuando puedan estar presentes disolventes
no acuosos.  El electrodo de pH tiene un electrodo de referencia interna (Ag/ AgCl)
sumergido en un buffer de Cl- (pH=7), con una membrana de vidrio.
Figura 1.1 Esquema Electrodo de Vidrio
En los electrodos de vidrio sensibles a H+, la estabilidad química y la

resistencia eléctrica están siempre ligadas. La resistencia eléctrica de los
electrodos de pH, en función de la composición de la membrana, tamaño y forma,
puede variar entre 5 - 500 MW. Así los electrodos con buena estabilidad química a
elevadas temperaturas, tienen una resistencia eléctrica excesiva para bajas
temperaturas. Contrariamente, electrodos con buena respuesta a bajas
temperaturas degeneran rápidamente a altas temperaturas.
Debido a ésta contraposición, los electrodos son diseñados de forma

específica para ciertos rangos de temperatura y pH.
8
 Error Alcalino Positivo 

El error alcalino es debido al intercambio de otros cationes, distintos al H +,
presentes en las disoluciones de análisis. El error puede ser grande con muestras
que contienen cationes monovalentes comunes a los existentes en la membrana de
vidrio.
La influencia de estos iones interferentes en el potencial del electrodo es descrita
por la ecuación de Nikolsky. Esta ecuación es una extensión de la ecuación de
Nersnt:
E=Eo+S.log(ai +Skij ajz)(z=ni /nj) (1.1)
Para un electrodo ideal kij = 0, cuando responde únicamente a un ión. El

coeficiente de selectividad k H, Na es aproximadamente 10-13. Por ejemplo, el pH de
una muestra que tenga las siguientes concentraciones:
pH=12aH+ =10-12 mol / L (1.2)
aNa+ =1mol / L (1.3)
pH=-log(10-12 +1.10-13 )=11.96 (1.4)
Para muchos trabajos, el potencial medido fijándonos en la actividad, sería

erróneo un 10% de error: aH+ = 1.1*10-12 mol / L frente al real aH+ = 1*10-12 mol / L.
Para valores de pH inferiores a 11, el error alcalino es prácticamente despreciable:
pH=11aH+ =10-11 mol/L (1.5)
  aNa+ =1mol/L (1.6)
pH=-log(10-11 +1.10-13 )=10.996 (1.7)
Estaríamos leyendo aH+ = 1.01*10-11 molL-1 frente al real de aH+ = 10-11 molL-
1. Para cometer errores de un 10% para valores de pH = 11, tendríamos que tener
una aNa+ = 10 mol L-1.  Existen electrodos de pH que tienen una composición en la
membrana para que el error alcalino lo tengamos que tener en cuenta pero a
valores más altos, a partir de pH de 13. La membrana de estos electrodos se le
designa como Membrana del Tipo U, frente a la Membrana de Tipo T cuyo error
alcalino empieza a pH de 11.
9
Error Acido Negativo
En disoluciones fuertemente ácidas, ( H+) > 1 M, la actividad del agua en la

disolución se reduce afectando a la capa hidrata sobre la membrana, ya que se
disminuye la zona donde verdaderamente tiene lugar las reacciones de intercambio
iónico.
Previo a la medición del pH de una disolución acuosa, mediante un electrodo

de vidrio, es necesario calibrar el pH-metro mediante el uso de uno ó dos buffer.
En los equipos en los cuales se ajusta con 1 buffer, lo que se hace es

interceptar la pendiente de respuesta del electrodo ideal ó instrumento con la del
electrodo real en el pH del buffer. Por lo tanto mientras más alejado esté el pH de la
muestra con el pH del buffer mayor será el error. Para minimizar este error se
puede calcular la pendiente de respuesta, utilizando 2 buffer, con uno se ajusta y
con el otro se mide:
pH2 = 4.0 verdadero

 
pH1 = 2.5 verdadero 
pH1' = 2.3 lo que marca el instrumento.
Sx pendiente ideal = pendiente real
𝐸1 − 𝐸2 𝐸1 −𝐸2
𝑆𝑋 = = (1.8)
𝑝𝐻1 −𝑝𝐻2 𝑝𝐻1 ´−𝑝𝐻2
𝑝𝐻1 −𝑝𝐻2
𝑆= (1.9)
𝑝𝐻1 ´−𝑝𝐻2
Al reemplazar
2.5−4.0
𝑆= = 0.882 (1.10)
2.3−4.0
10
Figura 1.2 Ajuste buffer para electrodos
Los equipos que se ajustan con 2 buffer son más exactos. En éstos se ajusta
la pendiente y luego se hace coincidir exactamente con la respuesta del
instrumento. La pendiente del electrodo se ve afectada por la temperatura de
trabajo y por el factor de sensibilidad (S) ó respuesta del electrodo. A medida que
un electrodo tiene mayor uso, su respuesta va disminuyendo, su pendiente es
menor.
Las etapas a seguir en un medidor de pH son las siguientes :
 Control de Temperatura
La respuesta de un electrodo de vidrio ideal queda descrita por la ecuación:
𝐸 = 𝑘 − 𝑝𝐻 (1.11)
que representa una recta de pendiente negativa cuyo valor depende de la

temperatura.   De aquí que sea necesario hacer coincidir la recta de respuesta del
electrodo, E vs pH, con la recta de respuesta del instrumento, variando la
inclinación de esta última mediante el control de temperatura.
 Control de Sensibilidad
En la práctica un electrodo de vidrio real se comporta según la ecuación:
 𝐸 = 𝑘 − 𝑆 𝑝𝐻 (1. 12)

en que S corresponde al cuociente entre la pendiente real y la pendiente ideal:
11
Sx Pendiente ideal= Pendiente real
normalmente se lo expresa en tanto por uno (es menor que uno). De aquí la
necesidad de un nuevo ajuste de pendiente en la recta de respuesta del
instrumento hasta hacerla coincidir perfectamente con la recta de respuesta del
electrodo en cuestión. Esta variación en la inclinación se logra mediante el control
de sensibilidad.
Ambos parámetros influyen en la pendiente del electrodo
Figura 1.3 Comportamiento de sensibilidad de electrodos
Sucede que el giro de la recta de respuesta del instrumento que se logra con
el control de sensibilidad (también se logra con el control de temperatura) se
produce en torno al punto pHiso del instrumento. De aquí que si el primer buffer
utilizado tiene un pH diferente al pHiso del instrumento, al accionar el control de
sensibilidad, se perderá la calibración del primer punto. Para superar esta dificultad
es necesario conocer el punto pHiso del instrumento. Este es precisamente aquel
valor de pH de la escala, ajustado mediante el control de estandarización, en que la
acción de los dos controles:
 Control de estandarización
 Control de sensibilidad  son independientes entre sí; en el instrumento
utilizado pHiso es 7.00.
 Control de Cero o Estandarización (E)
Una vez ajustada la pendiente de la recta de respuesta del instrumento,

debe hacérsela coincidir con la recta de respuesta del electrodo. Esto implica un
desplazamiento de la recta del instrumento mediante la suma algebraica de una
tensión variable, a la que entrega la cadena de electrodos. Esto se logra con el
control de cero.
12
Figura 1.4. Comportamiento de estandarización de electrodo
OBJETIVOS
 Calibrar un medidor de pH y aprender el uso y cuidado de un electrodo

 Valorar potenciométricamente una solución de:
1. Mezcla de HCI - H3PO4 con NaOH valorado.
2. Determinar el contenido de H3PO4 en Coca Cola.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
I. Calibración de pH
1.- Calibre el medidor de pH con soluciones buffer estándares (pH 4 y pH 7). Siga
cuidadosamente las instrucciones señaladas en el manual.
II. Valoración potenciométrica de mezcla de HCI - H3PO4
 Tome una alícuota de 10 mL de mezcla de HCI - H3PO4 y transfiera a un

vaso de 250 mL. Introduzca una barra magnética e instale el vaso sobre un
agitador, agite suavemente.
 Sumerja el electrodo en el vaso y agregue agua destilada suficiente como

para cubrirlo.
 Realice una primera valoración estimativa para ubicar los puntos de

equivalencia, agregando incrementos de 0.5 mL de NaOH de concentración
13
conocida (0.1 M) y registre el valor del pH después de cada adición de

titulante.
Repita el procedimiento agregando esta vez, en las zonas cercanas al punto de

equivalencia, incrementos de 0.2 mL de titulante.
TRATAMIENTO DE DATOS
1.- Informe tablas que contengan
a) pH medido v/s Volumen

b)  pH / V v/s Volumen (primera derivada)
c) 2pH / 2V v/s Volumen (segunda derivada)
d) Método de Gran
Grafique los datos de cada tabla
2.- Calcule el volumen final (punto de equivalencia) para cada muestra
3.- Calcule las concentraciones Molares de HCl y del H3PO4 en la mezcla y H3PO4
en la bebida valorada que contienen las muestras valoradas, además calcule la
masa de H3PO4 en la bebida.
CUESTIONARIO
1.- Indique que características debe cumplir un electrodo para ser utilizados como
electrodo indicador.
2.- Cuales son las características de un electrodo de referencia ideal y de ejemplos.
3. Describa y explique la función de un electrodo de vidrio y electrodo de

calomelano saturado . E indique cual es la diferencia entre un electrodo de
vidrio simple y uno combinado.
4. Establezca los equilibrios involucrados y las constantes respectivas para el

H3PO4
5. Explique por que las Bebidas Cola deben desgasarse antes de titular.
14
LABORATORIO Nº 2
CONDUCTOMETRIA:
VALORACIÓN DE UNA MEZCLA DE ACIDO FUERTE Y DEBIL
INTRODUCCIÓN
Las mediciones conductimétricas ofrecen un medio adecuado para la

determinación de puntos finales en titulaciones. Para establecer un punto final
conductimétrico, se necesitan suficientes mediciones experimentales para definir la
curva de titulación. Luego de corregir el cambio de volumen, se grafican los datos
de conductancia en función del volumen de reactivo titulante. Posteriormente se
extrapolan las dos porciones lineales y se obtiene el punto de equivalencia en la
intersección de ambas.
Debido a que las reacciones no son absolutamente completas, las curvas de

titulación conductimétrica muestran invariablemente desviaciones con relación a la
linealidad rigurosa en la región del punto de equivalencia. Las regiones curvas se
vuelven más pronunciadas cuando la reacción en cuestión se hace menos
favorable y cuando la solución resulta más diluida. Las porciones lineales de la
curva se definen mejor a través de mediciones suficientemente alejadas del punto
de equivalencia para que el efecto de los iones comunes impulse la reacción más
cerca de completarse; las mediciones en la proximidad del punto de equivalencia, a
diferencia de los métodos potenciométricos, no tienen ningún significado.
Ciertamente, debido a la hidrólisis, disociación, o solubilidad del producto de
reacción, los valores de la conductividad medida en las cercanías del punto de
equivalencia no tienen sentido en la construcción del gráfico, dado que la curva
será redondeada en una o ambas ramas. En contraste con los métodos
potenciométricos o con indicador, que dependen de observaciones en condiciones
en las que la reacción es menos completa, el análisis conductimétrico puede
emplearse con éxito para titulaciones basadas en equilibrios relativamente
desfavorables. En estos casos, la técnica conductimétrica es la más ventajosa.
El punto final conductimétrico es completamente inespecífico. Aunque el

método es potencialmente adaptable a todos los tipos de reacciones volumétricas,
el número de aplicaciones útiles a sistemas de oxidación-reducción es limitado; el
exceso sustancial de ion hidronio típicamente necesario para tales reacciones
tiende a enmascarar los cambios de conductividad asociados con la reacción
volumétrica.
15
Titulaciones Ácido-Base
Las titulaciones de neutralización se adaptan particularmente bien al punto

final conductimétrico, debido a la conductancia muy alta de los iones H 3O+ y OH-
comparada con la conductancia de los productos de reacción.
Tipos de Curvas de Titulación Conductométricas
Figura 2.1. Curva de titulación conductimétrica de HCl 10-3 M con NaOH.
La conductancia primero disminuye, debido al reemplazo del ion hidronio por

un número equivalente de iones sodio de menor movilidad y luego del punto de
equivalencia, aumenta rápidamente con el agregado de base fuerte debido al
aumento de las concentraciones de iones sodio y oxhidrilo (este último de alta
conductividad). En la práctica, con excepción de la región inmediata al punto de
equivalencia, hay una excelente linealidad entre conductancia y volumen; por lo
tanto, sólo se necesitan dos o tres mediciones a cada lado del punto de
equivalencia para trazar las rectas en cuya intersección se encuentra el punto final.
Esta titulación es de interés práctico cuando las soluciones son oscuras o muy
coloreadas.
La Figura 2.2 muestra la titulación de un ácido fuerte HCl con una base
débil, NH4OH. La primera rama del gráfico refleja la desaparición de los iones
hidrógeno durante la neutralización pero luego del punto final, el gráfico se vuelve
casi horizontal, dado que el exceso de amoníaco no se ioniza en presencia de NH3.
16
Figura 2.2. Curva de titulación conductimétrica de HCl 10-3 M con NH4OH.
Las Figuras 2.3 y 2.4 son típicas de la titulación de una mezcla de dos
ácidos que difieren en el grado de disociación. La titulación conductimétrica de
tales mezclas es frecuentemente más precisa que con un método potenciométrico.
En la Figura 2.3 se muestra la titulación empleando NaOH, mientras que en la
Figura 2.4, es utilizado NH4OH.
Figura 2.3 Curva de titulación conductimétrica de una mezcla de HCl (10-3 M)

HAc (10-3 M) con NaOH.
17
Figura 2.4 Curva de titulación conductimétrica de una mezcla de HCl (10-3 M)

HAc (10-3 M) con NH4OH.
OBJETIVOS
 Determinar conductométricamente el punto final en la valoración de una

mezcla de un ácido fuerte y un ácido débil.
1.- Mida exactamente 10.0 mL de solución problema, vierta en vaso de 150 mL y

agregue 90 mL de agua. Anote el volumen final.
2.- Instale el vaso sobre el agitador magnético. Coloque la celda de conductividad

de modo que quede totalmente sumergida. Ajuste la velocidad de la agitación de
forma tal que no produzca turbulencias.
3.- Encienda el equipo y espere a que se estabilice. Con ayuda de su profesor

seleccione la escala apropiada.
4.- Tabule volumen en mL vs Conductancia Corregida. Anote la lectura inicial.

Valore adicionando alícuotas de 0.5 mL de valorante, hasta completar 10-12 mL
agregados.
5.- Retire la celda y lave los electrodos. Valore una nueva alícuota con incrementos
de 0.1 mL de valorante.
18
Tome en cuenta la dilución y corrija los valores de conductancia obtenidos

multiplicando cada valor leído por su correspondiente factor de corrección:
V  v 
V (2.1)
V: Volumen inicial (volumen muestra problema + volumen de agua)

v : Volumen de solución de NaCl adicionado
1.- Tabule: Volumen, Conductancia leída, Conductancia corregida.

2.- Grafique Conductancia corregida vs volumen de NaOH. Defina los puntos de
equivalencia de forma gráfica.
3.- Calcule la concentración de la especie en la solución valorada en Molaridad.
CUESTIONARIO
1.- ¿En qué casos es conveniente la utilización de este método?
2.- ¿Qué factores influyen en la conductividad de una solución?
3.- ¿Por qué razón es necesario realizar la corrección por efectos de dilución?
4.- ¿Qué es la Conductancia Equivalente?
19
LABORATORIO Nº 3
ESPECTROFOTOMETRÍA VISIBLE.
APLICACIÓN DE LA LEY DE BEER
INTRODUCCIÓN
La espectrofotometría, especialmente en la región visible se utiliza a menudo

como método de análisis. Muchas sustancias pueden convertirse en derivados
coloreados y, por lo tanto, pueden ser analizados en la región visible del espectro
electromagnético.
La radiación electromagnética se puede considerar como una forma de

energía radiante que se propaga como onda transversal con un movimiento
ondulatorio. La distancia entre las ondas se describe en términos de longitud de
onda (). La región visible es una parte muy pequeña del espectro
electromagnético y se extiende desde el ultravioleta cercano, 380 nm hasta
aproximadamente 780 nm.
La cantidad de radiación absorbida por una especie química se puede

relacionar con la concentración de la sustancia que se analiza, mediante la Ley de
Beer.
A= k b C (3.1)
Donde:
A = absorbancia
C = concentración del analito
b = el paso óptico
k = la constante de proporcionalidad.
La constante de proporcionalidad k se denomina absortividad (a) si la

concentración de la sustancia a analizar se expresa en gramos/litro y absortividad
molar (  ) si la concentración del analito se expresa en moles/litro.
Es posible realizar cálculos cuantitativos cuando dos especies absorbentes

de la solución tienen espectros que se superponen. De acuerdo con la ley de Beer,
la absorbancia total de una mezcla a determinada longitud de onda, será igual a la
suma de las absorbancias individuales de las especies que absorben.
20
Figura 3.1. Espectro de adsorción de dos componentes y mezcla de ambos
Cuando se trata de dos componentes, M y N, cuyos espectros de absorción

están superpuestos a todas las longitudes de onda, la forma de proceder es medir
las absorbancias A1 y A2 a las longitudes de onda λ1 y λ2 respectivamente, y
planteando las ecuaciones siguientes:
A1 =εM1 bCM +εN1 bCN (aλ1) (3.2)
A2 =εM2 bCM +εN2 bCN (aλ2) (3.3)
Esto es posible porque la ley de Beer establece que la absorbancia es una

propiedad aditiva, de forma que la absorbancia total de una disolución a una
longitud de onda dada es igual a la suma de las absorbancias de los componentes
individuales presentes.
En las ecuaciones anteriores, b representa el camino óptico y εM1, εM2, εN1

y εN2 las absortividades molares de M y N a las longitudes de onda λ 1 y λ2, que
deben ser determinadas previamente a partir de disoluciones patrón, o mejor, a
partir de las pendientes de sus representaciones de la ley de Beer.
21
OBJETIVOS
 Estudiar los principios de la espectofotometría visible

 Conocer las características de operación de un espectrofotómetro.
 Determinar la concentración de Co (II) y Ni (II) en una mezcla.
Espectro de Absorción
1.- A partir de una solución estándar y mediante dilución apropiada prepare una
solución de Co (II) 0.075 M y una solución de Ni (II) 0.100 M en matraces
volumétricos de 50 mL.
2.- Prepare una solución mezcla de concentración 0,100 M en Co (II) y 0.050 M en

Ni (II) en un volumen final de 50 mL.
3.- Utilizando un espectrofotometro, seleccione el rango de barrido en (nm) que

Ud. desea analizar (370 nm a 550 nm, con un intervalo de 2 nm).
4.- Mida la absorbancia de las soluciones de Co (II), Ni (II) y de una mezcla de

ambos, que Ud. ha preparado en el punto 1.- y 2.-.
5.- El equipo le entregará un gráfico de Absorbancia en función de la longitud de

onda para Co (II), Ni (II) y de la solución mezcla de ambos. Los gráficos de
absorbancia vs concentración se conocen como gráficos de la ley de Beer. A partir
de este espectro determine los valores de longitud de onda para cada solución y la
mezcla.
Curva de calibración
1.- Mediante diluciones apropiadas de la solución estándar, prepare 5 soluciones

de Co (II) y 5 soluciones de Ni (II) de concentraciones comprendidas entre 0.15 y
0.02 M para un volumen final de 25 mL. Debe disponer además, de una solución
mezcla problema que se le proporcionará.
Tabla 1.- Preparación de soluciones de Co y Ni (mol L-1)
N° solución Concentración (mol L-1) Volumen (mL)

1 0.15
2 0.10
3 0.08
4 0.04
5 0.02
22
2.- Del espectro de absorción de Co y del espectro de Ni seleccione 2 longitudes

de onda de tal forma que:
a.- Absorbancia máxima para Co, absorbancia mínima para Ni

(Razón ACo/ANi= máxima)
b.- Absorbancia máxima para Ni, absorbancia mínima para Co

(Razón ANi/ACo= máxima)
3.- Grafique absorbancia en función de la concentración para cada solución a cada

una de las longitudes de onda utilizadas.
4.-De los gráficos de la ley de Beer, calcule el valor de la pendiente y el coeficiente

de absortividad molar ()
5.- Calcule la concentración de cada componente en la solución problema,

aplicando la Ley de Beer y la propiedad de aditividad de la absorbancia en una
mezcla. Exprese sus resultados en g L-1, M y mgL-1.
23
LABORATORIO Nº4
CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

(HPLC)
INTRODUCCIÓN
Características de la Técnica
Aplicaciones Principales: Técnica de separación para los

materiales menos volátiles e iónicos; análisis cuantitativo de multicomponentes.
  Fenómeno Molecular: Reparto entre una solución líquida y un

substrato.
  Ventajas en el Análisis Cualitativo: Separa materiales para su

examen por medio de otras técnicas.
Ventajas en el análisis cuantitativo: Aplicación amplia a los

materiales menos volátiles, análisis de multicomponentes. 
Muestra promedio deseable: 10 mg 
Limitaciones del método: Se tarda en desarrollar el método
Limitaciones para la muestra: Ninguna
Los cuatro tipos básicos de cromatografía en los que la fase móvil es un

líquido: Cromatografía de Reparto; Cromatografía de Adsorción, o líquido-sólido;
Cromatografía Iónica; y Cromatografía de Exclusión por Tamaños, o en Geles.
Sin embargo, no fue sino hasta finales de los años sesenta cuando se
desarrolló la tecnología adecuada para producir y utilizar rellenos de tamaño de
partícula del orden de los 3 o 10 μm. Esta tecnología requiere una instrumentación
sofisticada, que contrasta con las simples columnas de vidrio de la cromatografía
de líquidos clásica. Para distinguir estos procedimientos más nuevos de los
métodos básicos, que todavía se utilizan con fines preparativos, se emplea la
denominación de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).
24
Es incuestionable que la cromatografía de líquidos de alta resolución es la

técnica de separación más ampliamente utilizada, Las razones de la popularidad
de esta técnica son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones
cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o
termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de
primordial interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la
sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los
aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas,
terpenoides, plaguicidas, antibióticos esteroides, especies organometálicas y una
cierta variedad de sustancias inorgánicas.
La Figura 4.1 pone de manifiesto que los distintos procedimientos que

utilizan la cromatografía de líquidos tienden a ser complementarios por lo que a
sus campos de aplicación se refiere.
Figura 4.1 Aplicaciones de la cromatografía de líquidos
25
A continuación se ilustra el importante efecto del tamaño de partícula del relleno y

se describen otras dos causas del ensanchamiento de zona, que a veces son de
notable importancia en cromatografia de líquidos.
Efectos del tamaño de partícula del relleno. El coeficiente de transferencia de

masa de la fase móvil es función inversa del cuadrado del diámetro de las
partículas que constituyen el relleno. Como consecuencia de ello, la eficacia de
una columna de HPLC debería mejorar espectacularmente cuando disminuye el
tamaño de partícula. Por ejemplo una reducción del tamaño de partícula de 45 a 6
μm origina una disminución de diez o más veces de la altura de plato.
Ensanchamiento de banda extracolumna en cromatografía de líquidos. En

cromatografia de líquidos, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda
significativo fuera del relleno de la columna. Este ensanchamiento, denominado
ensanchamiento de banda extracolumna, tiene lugar cuando se transporta el
soluto a través de tubos como los que se utilizan en los sistemas de inyección, en
los detectores y en los tubos que conectan los distintos componentes del sistema.
El ensanchamiento proviene de la diferente velocidad de flujo que hay entre las
capas de líquido adyacentes a las paredes del tubo y las del centro. Como
consecuencia, la parte central de una banda de soluto se mueve con más rapidez
que la periferia. En cromatografia de gases la difusión compensa la dispersión
extracolumna. Sin embargo, la difusión en los líquidos es significativamente
menor, y con frecuencia este tipo de ensanchamiento de banda se hace evidente.
Cuando se utilizan columnas de pequeño diámetro, el ensanchamiento
extracolumna puede hacerse bastante importante. En este caso, todos los
esfuerzos han de orientarse a la reducción del radio de los tubos del sistema
externos a la columna.
Efecto del tamaño de muestra en la eficacia de la columna. La cantidad de

muestra (μg de muestra/g de relleno) también afecta a la eficacia de la columna.
Para las aplicaciones con columnas de reparto y adsorción, la eficacia decrece
notablemente con la cantidad de muestra. En columnas de fase inversa el
decrecimiento en eficacia es mucho mas pequeño.
La Figura 4.2 muestra un esquema de los componentes fundamentales de un

cromatógrafo de líquidos de alta resolución típico. Cada uno de los componentes
se trata en los párrafos que siguen a continuación.
26
Figura 4.2 Esquema de un aparato de HPLC
Un equipo de HPLC consta con uno o más recipientes de vidrio o de acero

inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente. Los
recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos
-en general oxígeno y nitrógeno- que interfieren formando burbujas en los
sistemas de detección. Un desgasificador puede consistir en un sistema de
bombeo por vacío, un sistema de destilación, dispositivos para calentar y agitar los
disolventes o, como se muestra en la Figura 4.2, sistemas de difusión que
permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solución mediante finas burbujas
de un gas inerte de baja solubilidad. Con frecuencia estos sistemas también
contienen un dispositivo para la filtración del polvo y de las partículas sólidas en
suspensión de los disolventes. No es necesario que los desgasificadores y los
filtros sean partes integrantes de los sistemas de HPLC como se muestra en la
Figura 4.2. Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de
introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vacío a través de un
filtro de poro muy pequeño. Este tratamiento elimina los gases además de la
materia en suspensión.
27
Una separación que utiliza un solo disolvente de composición constante se

denomina una elución isocrática. Con frecuencia, la eficiencia de la separación se
aumenta notablemente por una elución con gradiente. En este caso se utilizan dos
(y a veces más) disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez
comienza la elución, se varía la relación de los disolventes de forma programada,
a veces continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. Los
instrumentos en la moderna HPLC a menudo están equipados con unos
dispositivos que permiten introducir los disolventes desde dos o más recipientes
en una cámara de mezcla a una velocidad que varía continuamente y la relación
de volumen de los disolventes se puede modificar lineal o exponencialmente con
el tiempo.
La Figura 4.3 ilustra la ventaja de una elución con gradiente en la separación de

una mezcla de clorobencenos. La curva (b) corresponde a la elución isocrática con
metanol/agua 50:50 (v/v). La curva (a) muestra la elución con gradiente, que se
inicia con una mezcla 40:60 de los dos disolventes y se va aumentando la
concentración de metanol un 8%/min. Obsérvese que la elución con gradiente
acorta notablemente el tiempo de separación sin sacrificar la resolución de los
primeros peaks. Nótese también que la elución con gradiente produce unos
efectos similares a los producidos por la programación de temperatura en
cromatografía de gases.
Figura 4.3. Mejora de la eficiencia de la

separación mediante la elución con
gradiente. Columna de 1 m x 2.1 mm d.i.
de acero inoxidable, relleno 1%
Permaphase ODS. Muestra: 5 μL de
bencenos clorados en isopropanol.
Detector: fotómetro de UV (254 nm).
Condiciones: temperatura 60oC, presión
80 kg/cm2.
(a) Elución con gradiente: metanol:

agua (40:60) e incremento de la
proporción de metanol a una velocidad
de un 8% min-1.
(b) Elución isocrática con metanol:

agua (50:50).
28
Detectores
A diferencia de la cromatografia de gases, en la cromatografía de líquidos no hay

detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de
ionización de llama y de conductividad térmica. Uno de los mayores retos en el
desarrollo de la cromatografía de líquidos ha sido el perfeccionamiento de los
detectores.
Un detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer todas las

propiedades listadas en relación con la cromatografía de gases, con la excepción
de que un detector para cromatografía de líquidos no es necesario que sea
sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Además, un detector de
HPLC debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir el ensanchamiento
de banda. Los detectores en cromatografia de líquidos son de dos tipos básicos.
Los detectores basados en una propiedad de la disolución responden a una
propiedad de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante dieléctrica,
o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los
detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las
propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de
difusión, que no son propias de la fase móvil. En la Tabla 4.1 se indican los
detectores más comunes empleados en HPLC y algunas de sus propiedades más
importantes.
Tabla 4.1. Características de los detectores de HPLC
29
OBJETIVOS
 Conocer y manejar un equipo HPLC

 Determinar el contenido de cafeína en una muestra problema
1.-De un estándar de 1000 mg/L de cafeína, utilizando agua grado HPLC como
disolvente prepare un sets de 5 soluciones con concentraciones entre 10 y 500
mg/L.
2.- En un vaso precipitado que se encuentran en desecadora (utilizando pinzas)

determine su masa y vierta el contenido de una bolsa de te, llévelo a estufa por 2
horas a 105oC, luego determine la humedad de la muestras.
3.- Prepare una taza de te (Anotar marca comercial) en 100 mL de agua grado
HPLC , filtre el té mediante un micro filtro de 0,45 m. Para la muestra de té
prepare una solución diluida 2 veces.
4.- Seleccione las condiciones del equipo; fase móvil CH3CN/Agua 15:85; flujo 1,0
ml/min.; detector UV a 270 nm, columna Lichrosfer RP-100 C18. Justifique y
explique la elección de éstas condiciones.
5.- Inyecte CH3CN para chequear la línea base
6.- Inyecte las soluciones preparadas y su muestra problema.
7.- Confeccione una curva de calibración absoluta
8.- Determine la concentración de cafeína en su muestra
9.- Determine los mg de cafeína en una taza de té (200 mL).
CUESTIONARIO
1.- Calcule los platos teóricos de su columna, utilizando el estándar más

concentrado
2.- ¿Qué condiciones debe cumplir una fase móvil?
3.- ¿Por qué se debe filtrar y desgasar las muestras y la fase móvil?
4.- Mencione las partes de un cromatógrafo líquido y la función de cada una de
ellas
Nota: Recuerde que todos lo cromatogramas deben ser incluidos en el
Informe en forma ordenada y clara en la sección de resultados.
30
LABORATORIO Nº 5
ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA

INTRODUCCIÓN
La característica especial de la Espectroscopia de Absorción Atómica,

(EAA) es que la muestra debe atomizarse. Esto se hace normalmente con una
llama, horno calentado eléctricamente o un plasma de radiofrecuencia. La
sensibilidad y los efectos de interferencia que se observan en la espectroscopia de
Absorción Atómica dependen de los detalles del método de calentamiento.
En la atomización de la muestra mediante una llama la combinación más

común de combustible y oxidante es la de acetileno/aire. Cuando se requiere de
mayor temperatura puede utilizarse una combinación de acetileno/óxido nitroso.
Los hornos calentados eléctricamente, (hornos de grafito) presentan una mayor
sensibilidad y necesitan un menor volumen de muestra.
La medición de Absorbancia en espectroscopia de Absorción Atómica se

rige por la Ley de Beer. Aunque en la práctica, a menudo se encuentran
desviaciones de la linealidad, esto no constituye un obstáculo para trabajar con
curvas de calibración empíricas.
Cuando no es posible eliminar las interferencias de matriz es posible utilizar

el método de adición estándar, técnica que permite trabajar en presencia de un
interferente, realizando una determinación correcta del analito. Con esta técnica es
posible determinar más de 60 elementos.
El contenido de hierro en los vinos suele oscilar entre 4 y 20 mg por litro,

con contenidos medios de 6 a 12 mg/L. Su origen puede ser diverso. Una cantidad
que apenas sobrepase los 3 ò 4 mg por litro constituye el hierro normal o hierro
biológico absorbido por las raíces de la viña. Otra parte procede de los suelos que
puedan manchar la superficie de las uvas. Además, ciertas cantidades pueden
proceder de las herramientas metálicas utilizadas en su elaboración (trituradoras
de uvas, prensas de acero, herramientas de vendimia, etc.) o en su
almacenamiento (tornillos de las compuertas de los barriles, etc.)
Las sales de hierro se encuentran en el vino en los estados de oxidación (II)

y (III). Las sales ferrosas son totalmente solubles, mientras que ciertas sales
férricas (que pueden originarse por oxidación de las sales ferrosas por el oxígeno
atmosférico) son insolubles o coloreadas. Este es el caso del fosfato férrico, sal
blanquecina origen de la "quiebra blanca". Por otra parte, las combinaciones del
hierro (III) con los poli-fenoles, coloreados de azul oscuro, son la causa de la
"quiebra azul". Los vinos blancos están más sujetos a la primera, y, por el
31
contrario, los vinos tintos, ricos en taninos, dejan un poso azulado o ennegrecido:
"quiebra negra". Una concentración total de hierro del orden de los 10 mg/litro
indica riesgo de quiebras férricas, si bien, este valor límite varía mucho en función
de la composición del vino.
OBJETIVOS
 Conocer el funcionamiento de un equipo de absorción atómica

 Determinar la concentración de Fe en una muestra
 Analizar los métodos de curva de calibración y de adición estándar
 Comprobar la influencia de un solvente orgánico en la determinación
I.- Curva de calibración
1.- A partir de la solución estándar de 1000 ppm prepare una solución de 100 ppm
de Fe.
3.- Prepare un sets de 5 soluciones de Fe de: 0; 1; 2; 3 y 4 (mg/L), agregar 5 mL

de una solución 0.01 M de Ca y enrasar a 25 mL con agua destilada .
4. Filtre la muestra problema mediante un micro filtro de 0,45 m.
5.- Lea la Absorbancia de las soluciones
6.- Mida la Absorbancia de una solución de:
a) 3 mg/L de Fe disuelta en acido nítrico (5 % p/v)

b) 3 mg/L de Fe disuelto en metanol.
7.- Determine el contenido de Fe en una muestra problema.
8.- Grafique A vs C y determine el rango lineal
II.- Adición de Estándar
En 5 matraces aforados de 50 mL se coloca 10 mL de muestra problema.

Añadir a continuación a cada uno de ellos 0, 5, 10, 15 y 20 mL de una solución de
Fe de 10 mg/L. Seguidamente añadir 5 mL de una solución 0.01 M de Ca, se
enrasan con agua destilada y se mide absorbancia.
32
Grafique para la adición estándar y determine la concentración de la cobre en

agua potable de acuerdo a esta técnica. Considere el factor de dilución. Aplique la
forma gráfica y el cálculo con la formula 1 utilizada para la absorción atómica.
Cx A
 x 1
C x  C st Ast  x
Donde
Cx : concentración de la muestra problema
Cst: concentración del estándar
Ax : Absorbancia de la muestra problema
Ax+st : Absorbancia de la muestra problema + estándar
CUESTIONARIO
1.- Defina: Sensibilidad y límite de detección
2.- Comente los resultados obtenidos en las soluciones analizadas
3.- Comente el efecto, del disolvente orgánico en la lectura de Absorbancia.
33

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Laboratorio de Análisis

Dra. Marlen Gutiérrez Cutiño

En el presente laboratorio se evaluará de la siguiente forma:

2. Pruebas de Ciclo 60%

En cada sesión de laboratorio es OBLIGATORIO

1. Asistir con delantal blanco, gafas de seguridad y cuadernos de laboratorio.

Distribución de Grupos de Laboratorio Lunes Módulos 9-10-11-12

Laboratorio Laboratorio Laboratorio Laboratorio Laboratorio

Recuperativos 6 de Mayo 2013

Prueba de Laboratorio 13 de Mayo de 2013 TODOS LOS GRUPOS

Distribución de Grupos de Laboratorio Martes Módulos 9-10-11-12

Laboratorio Laboratorio Laboratorio Laboratorio Laboratorio

Recuperativos 7 de Mayo 2013

Prueba de Laboratorio 14 de Mayo de 2013 TODOS LOS GRUPOS

Los métodos potenciométricos de análisis se basan en las medidas del

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Método de la Primera Derivada

Método de la Segunda Derivada

En este caso se grafica ∆2E/∆2V de la figura

Consiste en graficar ∆V/∆E en función del

Este método no requiere datos muy cercanos al

En función del tipo de reacciones químicas que tiene lugar durante la

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El potencial del electrodo de referencia es conocido, constante y debe ser

Como electrodo indicador se utiliza el electrodo de membrana de vidrio, el

Electrodos de Membrana de Vidrio

El electrodo de pH pertenece al grupo de electrodos de membrana sólida,

Membrana T : Na2O – CaO - SiO2 (22:6:72)%

Membrana U : Li2O - Cs2O2 – BaO - La2O3 - SiO2 (28:2:4:3:63)%

Estos modificadores iónicos retardan la hidrólisis del silicato.

Cuando se sumerge el electrodo en agua, en la capa superficial existe un

Figura 1.1 Esquema Electrodo de Vidrio

En los electrodos de vidrio sensibles a H+, la estabilidad química y la

Debido a ésta contraposición, los electrodos son diseñados de forma

Error Alcalino Positivo

E=Eo+S.log(ai +Skij ajz)(z=ni /nj) (1.1)

Para un electrodo ideal kij = 0, cuando responde únicamente a un ión. El

pH=12aH+ =10-12 mol / L (1.2)

aNa+ =1mol / L (1.3)

pH=-log(10-12 +1.10-13 )=11.96 (1.4)

Para muchos trabajos, el potencial medido fijándonos en la actividad, sería

pH=11aH+ =10-11 mol/L (1.5)

aNa+ =1mol/L (1.6)

pH=-log(10-11 +1.10-13 )=10.996 (1.7)

Error Acido Negativo

En disoluciones fuertemente ácidas, ( H+) > 1 M, la actividad del agua en la

Previo a la medición del pH de una disolución acuosa, mediante un electrodo

En los equipos en los cuales se ajusta con 1 buffer, lo que se hace es

pH2 = 4.0 verdadero

pH1' = 2.3 lo que marca el instrumento.

Sx pendiente ideal = pendiente real

Figura 1.2 Ajuste buffer para electrodos

Las etapas a seguir en un medidor de pH son las siguientes :

La respuesta de un electrodo de vidrio ideal queda descrita por la ecuación:

que representa una recta de pendiente negativa cuyo valor depende de la

En la práctica un electrodo de vidrio real se comporta según la ecuación:

en que S corresponde al cuociente entre la pendiente real y la pendiente ideal:

Sx Pendiente ideal= Pendiente real

Ambos parámetros influyen en la pendiente del electrodo

Una valoración potenciométrica implica dos tipos de reacciones:  Una

 Error Alcalino Positivo 

  aNa+ =1mol/L (1.6)

  Fenómeno Molecular: Reparto entre una solución líquida y un

  Ventajas en el Análisis Cualitativo: Separa materiales para su