presencia de pseudomona en compost de lechugas

la calera cundinamarca

Resumen:

Se realizó una visita a este barrio de la localidad para una toma de muestra de tierra o
compost del cultivo de la señora rosa de asisclo ubicado en la calera cundinamarca ​,
Bogotá, con el que se realizaron una secuencia de laboratorios para determinar la clase,
taxonomía, forma de los microorganismos que podrían existir en el mismo ( Hongos,
Bacterias ). Los diferentes laboratorios realizados se realizaron en un periodo de tiempo de
dos horas diarias cada miercoles en horas de la mañana( 10 am - 12 am ) teniendo como
lugar asignado el laboratorio de la universidad ECCI sede P y teniendo como tutor asignado
a la docente Tatiana Marcela Montes quien es especializada en microbiología.

Para nuestro grupo de trabajo se nos asignaron las bacterias (pseudomonas), esto se
determinó mediante los primeros laboratorios al realizar diferentes inoculación en diferentes
tipos de agares entre esos PDA, CT y MCK, los dos últimos mencionados eran utilizados
para el desarrollo y crecimiento de microorganismos como (hongos) debido a que no hubo
presencia en ninguno de estos dos agares durante la inoculación se determinó trabajar con
las bacterias anteriormente mencionadas, a las cuales se le realizaron diferentes pruebas
bioquímicas y se sometieron a condiciones extremas.

Abstract

​
A visit to the university was made for a compost or farmland sample of the campus of the
sowing mrs rosa de asisclo Located in calera cundinamarca , Bogotá, D.With which a
sequence of laboratories was carried out to determine the class, taxonomy, form of the
microorganisms that could exist in it (Fungi, Bacteria). The different laboratories carried out
were carried out in a period of time of two hours a day every wednesday morning hours
(10:00 am - 12:00 am), with the laboratory of the ECCI university located at the P site and
assigned as tutor to the teacher Tatiana. Marcela Montes who is specialized in microbiology.

For our work group we were assigned the bacteria (pseudomonas), this was determined by
the first laboratories to perform different inoculation in different types of agars between those
PDA, CT and MCK, the last two mentioned were used for the development and growth of
microorganisms such as (fungi) because there was no presence in any of these two agars
during inoculation was determined to work with the aforementioned bacteria, to which
different biochemical tests were carried out and subjected to extreme conditions.

PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
¿Existe presencia de pseudomonas en el compost o en la tierra de cultivo del mencionado
cultivo de lechuga?

OBJETIVOS

General​: Hallar, Observar y conocer la composición microbiológica a nivel bacteriana que

hay presente o se encuentra correlacionada con el proceso del compost para su cultivo en
todas sus etapas.

Específicos​:

1. Analizar la muestra de compost obtenida en el cultivo de lechuga en la calera

através de laboratorios empleando medios de cultivo de agar(entre otros), diluciones
seriadas y pruebas bioquímicas.

2. Determinar la existencia de bacillus o cocos mediante la tinción de gram, además de

utilizar la resiembra para determinar a través de pruebas bioquímicas el sustrato que
necesitan para desarrollarse las pseudomonas.

3. Determinar crecimiento de pseudomona en ambientes extremos (inoculación en

caldo bhi y tinción de gram)

Justificación​:

Este trabajo de investigación se realizó por un estudiante de la Universidad ECCI, ya que

es de vital importancia conocer las poblaciones microbianas existentes en la muestra,
debido a que hay una amplia diversidad de microorganismos mesófilos y termófilos (entre
otros) que conforman las poblaciones mixtas que degradan la materia orgánica, y para
poder conocer qué variedad de microorganismos hay presentes se lleva a cabo la
investigación con una muestra tomada en el campus de la Universidad ECCI. El trabajo de
los microorganismos tiene un papel importante y tiene ciertas dependencias como el tipo de
sustrato utilizado y la evolución de la temperatura, pH, humedad, cantidad de azúcar, fuente
de carbono, además de si cuenta con presencia de oxígeno o no.

Estos son factores principales que condicionan la sucesión de microorganismos, su

desarrollo y crecimiento como también su fase final. Con esto podemos detectar el
funcionamiento viable del microorganismo y ver que poblaciones pueden utilizarse para
procesos industriales ( biorremediación) y educativos.
 MARCO TEÓRICO

Compostaje

Es una biotecnología basada en el uso de consorcios microbianos aeróbicos que utilizan la

materia orgánica disponible como sustrato para producción de un compost hecho de los
residuos de los metabolismos microbianos, es decir se forma un ecosistema entre el medio
el cual es casi sustrato en su totalidad y las diferentes poblaciones microbianas. (Moreno J.
& Mormeneo S., 2008)

Existen diferentes variables que afectan el proceso de compostaje, como la temperatura,

nivel de humedad, aireación, la presencia de organismos patógenos o indeseables, pH, la
calidad y cantidad de materia orgánica, el nitrógeno y la relación entre fuentes de nitrógeno
y carbono. (ResCoBa residuos: Conceptos básicos, 2017)

La diversidad microbiana encontrada en un compost es realmente variable, ya que esta

depende del tipo de sustrato y de condiciones ambientales, además los consorcios
microbianos dados en el compostaje pueden estar conformados por bacterias, arqueas,
hongos, actinomicetos y levaduras; además esta suele variar con los cambios de
temperatura, es decir con las etapas del compostaje ya que para cada una tanto
condiciones del ambiente como el tipo de sustrato es diferente. Los géneros bacterianos
más comúnmente encontrados son ​Bacillus y Pseudomonas. (​ Moreno J. & Mormeneo S.,
2008).

El proceso de compostaje se basa en la reacción en cadena de los distintos procesos

metabólicos de los microorganismos encontrados en el para la biotransformación de la
materia orgánica en moléculas tanto orgánicas como inorgánicas más sencillas mediante
reacciones oxido-reductoras, de aquí que el proceso se lleve bajo condiciones aeróbicas
este es el proceso de mineralización. Las moléculas sencillas resultantes del proceso de
mineralización son las utilizadas en el proceso de humificación, en la cual se crean nuevas
macromoléculas orgánicas, las cuales son la parte fundamental del producto final humus
para su uso como abono. (Escobar N., ​et al.​, 2012)

En diferentes estudios se ha logrado aislar cepas bacterianas pertenecientes al género

Pseudomona ​de compost, tanto así que la ​Pseudomona aeruginosa es una de las especies
más comunes dentro de los ecosistemas del compostaje.En Colombia en 2012 ​Escobar
Natalia et al​., lograron el aislamiento de varias cepas pertenecientes al género
Pseudomonas de un compost compuesto por residuos de fincas cafeteras en Colombia,
donde se usaron 4 particulares como sustrato en diferentes cajas, un compost de residuos
de banano, otro de bovinaza, otro de pulpa de café y finalmente uno de gallinaza. En este
estudio lograron aislar 4 especies del género Pseudomonas, ​P. aureginosa, P. paucimobilis,
P. putis y P. vesicularis, ​todas proliferaron con los diferentes sustratos, a excepción de la ​P.
putis​ con los residuos de banano como sustrato. (Escobar N., ​et al​., 2012)
El compostaje también se puede aplicar para la aceleración del proceso en la valorización
de residuos sólidos urbanos, tal como hicieron ​Cariello Maria et al., los cuales inocularon
cepas específicas entre ellas ​Pseudomonas fluorescens en pilas de residuos buscando su
descomposición fuera más rápida, todo esto con resultados positivos, donde la materia fue
llevada a compost estabilizado 4 semanas antes que las pilas sin inóculo de
microorganismos. (Cariello M., ​et al.,​ 2007)

Otros estudios han utilizado la bioaumentación de bacterias del género Pseudomonas para
tratar desechos de producción agrícola, como los de la cereza que presentan un problema
ambiental ya que contaminan fuentes hídricas, mediante el aprovechamiento en compostaje
de los residuos. (Vázquez M., 2010)

Las Pseudomonas son un género de bacterias Gram negativas aerobias y pertenecen a las
proteobacterias. Crecen en casi cualquier ambiente, ya que pueden usar una gran variedad
de moléculas como sustratos. (Soberon G., 2012)

Todas las cepas pertenecientes a este género son patógenas para los seres humanos.
Fisionómicamente presentan características de bacilos rectos o curvos, Gram negativos,
presentan tamaños entre 0,5-1,0 x 1,0x5,4µ​m,​ con flagelos dispuestos de forma polar, no
poseen mecanismo de esporas. Su metabolismo funciona por respiración, la mayoría de
especies son quimiorganotrofos y solo metabolizan monómeros orgánicos de bajo peso
molecular; y en menor cantidad algunas especies son quimiolitotrofas y utilizan hidrógeno
(H​2​) o monóxido de carbono (CO) como fuente de energía. (Ghenesisz Morales, 2015)
Respecto a las pruebas bioquímicas las bacterias del género Pseudomona, son positivas a
las pruebas de Oxidasa, Catalasa, motilidad y Ornitina, y por el contrario son negativas a
pruebas de Indol y Sulfuro. (Callico A. 2004) (9)
METODOLOGÍA

La cantidad que se tomó para el primer laboratorio fue ​de 10 g que es la suficiente para
hacer este tipo de análisis Bacteriano. En el momento de realizar la siembra cada grupo de
la clase obtuvo un MO’s distinto; con esto se espera lograr distintos resultados dados por
las condiciones de cada analisis y los reactivos utilizados.

Lo primero que se llevó a cabo es la mezcla de la muestra (compost) con caldo nutritivo y
se comenzó a realizar diluciones seriadas para luego depositar la muestra en una caja con
agar nutritivo PDA, CT, y MCK. al obtener las diluciones se adiciona las siguientes
diluciones:

● Agar nutritivo PDA 10−4 en (100 μL) .

● Agar CT 10−3 en (100 μL ).
● Agar MCK 10−3 en (100 μL ).

Con siembra por estría o gota, en el transcurso de unos días se observa el crecimiento de
bacterias en el agar, para luego realizar el conteo de colonias que han crecido y realizar una
descripción macroscopica y microscopica. en lo cual se evidenció que hubo crecimiento solo
en el agar nutritivo PDA lo que indica que hay presencia de bacterias con las siguientes
características ya que ni en agar MCK y CT no se evidenció crecimiento de hongos:

● Forma: filamentosa.
● Color: verde y beige poco traslúcido.
● Elevación: elevada.
● Margen: Filamentosa.

DESCRIPCIÓN DE COLONIAS

● 32 colonias.
● Colonias: especulado y redondeado.
● Forma: rizoide y circular.
● Evaluación: convexa y circular.
● Margen: entero y ondulado.

Después de realizar una descripción de las colonias halladas en los cultivos se procedió a la
caracterización microbiana, el cual es el proceso mediante el cual se utilizan diferentes
reactivos como:

● Fijar muestras (frotis).

● Cristal violeta (1 minuto y lavar).
● Lugol (1 minuto y lavar).
● Alcohol (15 segundos y lavar).
● Fucsina (1 minuto y lavar).
● Observación en el microscopio (4X,10X,40X y 100X).
Los cuales se utilizan para la determinación de bacterias GRAM POSITIVAS Y GRAM
NEGATIVAS. al realizar el proceso los resultados obtenidos fueron los siguientes:

● Gram positivas

Se procedió a realizar las pruebas bioquímicas y para esto se utilizaron:

● Gradilla
● 6 tubos de ensayo
● Indol
● Rojo de metilo (líquidos, asa redonda)
● VP voges proskauer (líquidos, asa redonda)
● Citrato
● SIM (sulfide índole Motility)
● TSI (triple sugar iron)

para utilizar cada uno de los reactivos y materiales correctamente se procedió a utilizar cada
uno por aparte como se mostrará a continuación:

I​ndol​: tome un tubo con caldo triptona, inocule con ayuda de un asa redonda. Incube a
35°C durante 24 a 48 horas. Luego de este periodo, agregue 5 gotas del reactivo de
Kovacs. Anote los cambios. La aparición de un anillo rojo-púrpura
es indicio de una prueba indol positiva.

Rojo de metilo​:tome un tubo con caldo MRVP, inocule con ayuda de un asa redonda.
Incube a 35°C durante 24 a 48 horas. Luego de este periodo, agregue 5 gotas de rojo de
metilo. No lo agite. Anote los cambios. Un cambio a
color rojo es indicio de una prueba positiva.

Prueba de Voges Proskauer​: tome un tubo con caldo MRVP, inocule con ayuda de un asa
redonda. Incube a 35°C durante 24 a 48 horas. Luego de este periodo, agregue 0,6ml del
Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etílico absoluto) y 0,2ml del Reactivo de
Voges-Proskauer (KOH 40%). Agite fuertemente. La aparición de un color rosado-violáceo
es
indicio de una prueba positiva.

Prueba de citrato​: tome un tubo con agar citrato de simmons. Realice una inoculación con
una estría simple en la superficie del medio. Incube a 35°C durante 24 a 48 horas. Un viraje
de color hacia el azul es indicio de una prueba positiva.

Pruebas TSI (Triple Sugar Iron)

Tome un tubo de agar TSI. Proceda a realizar una inoculación por punción con un asa de
punta. Extraiga el asa y realice una estría simple en la superficie del medio. Incube a 35°C
durante 24 a 48 horas.
Días posteriores se realizó la inoculación en el caldo BHI (general) para eso se utilizaron
varios tubos de ensayo con diferentes condiciones:

● Ph4
● Ph7
● Ph10
● NaCl 5%
● Glucosa 5%
● 4°C
● 48°C
● aerobiosis
● Anaerobiosis

-Nuevamente se procede a realizar tinción de gram para determinar las formas existentes
(cocos o bacillus) y si son positivas o negativas
RESULTADOS

28 - agosto -2019
● Se realiza perfectamente el caldo
nutritivo que dependiendo a esto se
permite hacer las diluciones
seriadas, se realizan 7 diluciones la
cual se escoge la #7 de dilución
para realizar la respectiva siembra
en el agar nutritivo.

28 - agosto- 2019 Al realizar la siembra por estrías pasa 7

días después, la cual se comienza a
observar una coloración verde claro,
amarillento y un poco translúcido con
colonias grandes, con forma de
ramificaciones las cuales de identificar
bacterias llamadas ​Pseudomonas
(​Pseudomonas​ es un género de bacilos
rectos o ligeramente curvados, Gram
negativos, oxidasa positivos, aeróbicos
estrictos aunque en algunos casos pueden
utilizar el nitrato como aceptor de
electrones.) luego se identifica formas
filamentosas, poliforme y fusiforme las
cuales son incontables de elevación
convexa.
 Se hace la caracterización microbiana de
Bacteria Tinción De Gram con un debido
procedimiento el cual se realiza la fijación
de muestra, se observa en el microscopio
a:
● 4x
● 10x
● 40x
Da como resultado Gram Positivas ya que
torna un color morado.

11 - septiembre - 2019

Observación de 100x en el microscopio

utilizando el aceite de inmersión

011 - septiembre - 2019

18 -septiembre - 2019 prueba bioquímica que permite determinar

las características metabólicas de las
bacterias de objeto de identificación.
En las pruebas tenemos el:

● Indol: se introduce la colonia en

forma circular (color transparente
líquido)
● Rojo de Metilo: Introducción colonia
en forma circular (color amarillo
líquido)
● Citrato(sólido, inclinado): punción
hasta la mitad del tubo y estria al
inicio del cultivo.(color verde)
● VP: Introducción colonia en forma
circular (color amarillo claro líquido)
● SIM (Sólido, inclinado) punción
hasta la mitad del tubo y estria al
inicio del cultivo. (color )
● TSI: Punción hasta la mitad del tubo
24-septiembre-2019 Se Hace reconocer el fundamento
bioquímico de cada una de las pruebas,
utilización y correcta interpretación.

● TSI: Cambia a color amarillo y da

reaccion acido/ acido /gas(-)
● Citrato: Única fuente de carbono Da
negativo ya que queda color verde
● Indol: productos de degradación
torna a negativa ya que sigue el
tono amarillento
● Rojo de Metilo: caracterización
taxonómica que se utiliza para
identificar diferentes géneros de
Enterobacterias ​torna a ser negativo
● ​ M​: c​ apacidad de producir la
​R
fermentación de la glucosa torna a
negativo.

24- septiembre-2019 Se realiza la Inoculación en caldo BHI en

tubos.

1 Paquete + pH 7
1. PH4
2. PH10
3. NaCI 5%
4. gLUCOSA
Se marca individual
1. 4ºC
2. 48ºC
3. Aerobios- pH 7
4. Anaerobios
 pH4:​ Si hay crecimiento, filamentos,
algodonoso de bacterias.
● masa sola suspendida
● Filamentoso
pH10: ​obtiene crecimiento muy bajo
pH7:​ crece y se esparce, hay mayor
crecimiento
Comparación:​ ya que en el ph 4 hay
células amontonadas no tiene mayor
crecimiento, en el ph 10 hay un crecimiento
muy bajo pero el mayor crecimiento que se
obtiene el en ph 7 ya que se encontraron
más los microorganismos y dispersión en
todo el medio

02-octubre-2019

02-octubre- 2019 Individuales:

4ºC: ​es de bajo crecimiento, se puede
concluir que no crece en temperaturas
bajas
48ºC: ​Creció bastante, posee alta turbiedad
es extremófilo ya que tiende a crecer en
temperaturas altas,
Anaerobio​: hubo muy poco crecimiento
aunque hay agrupaciones de celular pero
de igual manera fue muy bajo

02 -octubre-2019 Se observa en el microscopio y se hace el

reconocimiento ya que se obtuvo Gram
positivas y Gram Negativas con las misma
cantidad.
DISCUSIÓN

Como resultado se obtuvo presencia pseudomonas en la muestra tomada de compost del

cultivo de lechuga ; esto se definió con la ayuda de reactivos tales como el indol, rojo de
metilo y vp, además, a través de pruebas bioquímicas como Citrato, SIM, TSI.
Te tuvieron limitaciones dadas por falta de tiempo, inoculaciones mal elaboradas y
contaminación de cajas Petri a la hora de realizar la siembra. Esto generó retrasos al
momento de obtener los resultados; o que los mismos no fueran los esperados. Se debe
tener en cuenta los tiempos de incubación, de este modo el desenlace de la prueba va a ser
más claro y tendrá en sí los datos reales que queremos obtener para el registro.
Después de realizar las pruebas bioquímicas tal modo que estos datos indican que
realmente si se lograron aislar pseudomonas, no se pudo definir qué género realmente era
el que se estaba trabajando; pero nos permitimos diferir que las pseudomonas que
posiblemente se trabajaron pertenecen a:

● Pseudomonas aeruginosa
● Pseudomonas paucimobilis
● Pseudomonas putis
● Pseudomonas vesicularis

(FRANCO-CORREA, 1999; TOKALA)

Ya que estos cuatro géneros son comunes; nos permitimos suponer que entre nuestra
muestra de compost había algún tipo de los microorganismos mencionados anteriormente.

CONCLUSIONES

1. Se concluye que existen diferentes tipos de microorganismos en el compost del

cultivo de lechuga entre estos las pseudomona, esto debido a su fácil crecimiento en
ambientes naturales.
2. Las pseudomonas crecieron con mayor facilidad en el tubo de ensayo preparado
previamente con un pH 7, no usa citrato como fuente de carbono.
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