Figura 1. Vías del metabolismo central en E. coli.

Se muestra la derivación de esqueletos de carbono

para la biosíntesis de compuestos aromáticos. La ruta aromática común o shikimate está indicada
por el cuadrado punteado. Se muestran algunos metabolitos derivados del corismato por
biosíntesis normal en E. coli. También se muestran otros compuestos que se han producido en E.
coli por la acción de enzimas heterólogas (cuadrados abiertos). El aspartamo se ha producido
mediante un proceso de acoplamiento químico, utilizando Phe producido por fermentación.

Para reducir el costo de la producción biosintética industrial de compuestos aromáticos y otros

derivados, es deseable aumentar el flujo de los esqueletos de carbono hacia y a través de la vía
aromática común. Un análisis teórico de las vías involucradas en la producción de compuestos
aromáticos en E. coli indica que el rendimiento de estos metabolitos está limitado por la
disponibilidad de fosfoenolpiruvato (PEP). Este compuesto es uno de los principales bloques de
construcción en varias vías biosintéticas, y es el donante de fosfato utilizado por el sistema de
fosfotransferasa (PTS) en la internalización de glucosa.Se producen 2 moles de PEP a partir de un
mol de glucosa a través de la vía glucolítica. Sin embargo, el PTS utiliza posteriormente un mol de
PEP durante el transporte de glucosa dejando solo un mol de PEP por mol de glucosa consumido
que está disponible para otras reacciones metabólicas.

Algunos de los enfoques utilizados para resolver la limitación de PEP han sido el uso de fuentes de
carbono no PTS, el reciclaje de piruvato a PEP por la sobreproducción de PEP sintasa y la inactivación
de la piruvato quinasa. Otro enfoque es la selección de mutantes capaces de transportar glucosa
por un mecanismo que no es PTS, es decir, sin consumo de PEP. Por ejemplo, se han informado
mutantes de Salmonella typhimurium que pueden transportar glucosa por difusión facilitada a
través de la galactosa permeasa (GalP). En estos mutantes, la glucosa es fosforilada por glucoquinasa
usando ATP como donante de fosfato. Sin embargo, estos mutantes crecen muy lentamente y no se
han utilizado ampliamente.

En este informe, describimos la selección de cepas de E. coli que tienen un PTS inactivado, que utiliza
GalP, glucoquinasa y ATP para internalizar y fosforilar la glucosa. Estos mutantes difieren de otras
cepas de glucosa PTS en que fueron seleccionados por su capacidad de alcanzar tasas de crecimiento
rápidas (de tipo salvaje). Usando estos mutantes, pudimos redirigir más carbono derivado de
glucosa a la ruta aromática.

Resultados y discusión

Selección y caracterización de cepas de glucosa+ PTS-. Se ha informado del aislamiento de

revertantes espontáneos de glucosa que surgieron de cepas de E. coli que carecen de los genes pts.
Usando un enfoque similar, hemos descubierto que cuando las cepas de E. coli desprovistas de los
genes ptsH, ptsl y crr se cultivan en un fermentador en medio mínimo con glucosa como la única
fuente de carbono, se puede generar una población heterogénea de glucosa PTS detectado después
de aproximadamente dos días (resultados no publicados). De esta población heterogénea, usando
cultivo continuo, pudimos seleccionar varias variantes de glucosa PTS que pueden crecer con
diferentes tasas de crecimiento máximo en medio mínimo con glucosa como la única fuente de
carbono.

Dos cepas que mostraron un fenotipo de glucosa PTS estable se caracterizaron aún más. Cabe
mencionar que la mutación delta ptsHlcrr afecta no solo el transporte de carbohidratos PTS, sino
que también bloquea la utilización de otras fuentes de carbono como los intermedios del ciclo de
Krebs y ciertos aminoácidos. En la Tabla 1, presentamos la caracterización fenotípica de dos
derivados de glucosa JM101 PTS (cepas PB12 y PB13), así como el progenitor de glucosa PTS (cepa
PB11). Los revertantes conservaron varios de los fenotipos asociados con el genotipo pts, pero
recuperaron la capacidad de oxidar la glucosa y otras fuentes de carbono. Es importante destacar
que, en todos los reveladores de glucosa PTS probados, la interrupción del gen galP con un
transposón Tn10 eliminó el fenotipo de glucosa (datos no mostrados). Las dos cepas de glucosa PTS
PB12 y PB13 difieren en su tiempo de duplicación en medio mínimo con glucosa como la única
fuente de carbono (1.64 y 1.01 h respectivamente; datos no mostrados).
Redirigir el flujo de carbono hacia la ruta aromática. Con base en estos datos, es probable que las
cepas de glucosa PTS transporten glucosa a través de GalP, y una vez en el citoplasma, este
carbohidrato es fosforilado por glucoquinasa (usando ATP). Este esquema debería dejar las dos
moléculas de PEP generadas por la vía glucolítica disponibles para otras rutas metabólicas. Sin
embargo, considerando que en E. coli, la PEP es un regulador alostérico de varias enzimas,
especialmente la fosfofructoquinasa, la acumulación de PEP sería limitada.

Para probar la hipótesis de que los mutantes de glucosa PTS pueden consumir PEP adicional
disponible al dirigirlo a la ruta aromática, repetimos el esquema de aislamiento descrito
anteriormente para obtener derivados de glucosa PTS de la cepa de E. coli PB103, que se ha utilizado
para sobreproducir triptófano (resultados no publicados). Se seleccionó un derivado de glucosa PTS
estable de PB103 para experimentos adicionales (cepa NF9). En esta cepa, se confirmaron los
fenotipos de resistencia a la fosfomicina (véase el protocolo experimental) y la dependencia de galP
para el transporte de glucosa (datos no mostrados). En medio mínimo con glucosa como la única
fuente de carbono, crecieron PB103 y NF9 con un tiempo de duplicación de 1.25 h.

Las cepas PB103 y NF9 se transformaron cada una con el plásmido PRW5 o pRW5tkt. El plásmido
PRW5 (véase la Fig. 2A) contiene el gen aroG clonado que codifica una enzima sintasa de 3-desoxi-
D-arabino-heptulosonato 7-fosfato (DAHP) insensible alostéricamente, que cataliza la condensación
de PEP y E4P para producir DAHP. El plásmido pRW5tkt (Fig. 2B) es idéntico al PRW5, pero también
contiene la transcetolasa codificada por E. coli tktA clonada, que es una enzima de la ruta de la
pentosa fosfato que cataliza dos reacciones separadas, cada una de las cuales produce E4P. Por lo
tanto, la amplificación del gen tktA aumenta la concentración intracelular de E4P.

Las cepas de E. coli que sobreproducen la DAHP sintasa excretan DAHP en el medio extracelular
(observación no publicada). Esto refleja la incapacidad de la 3-hidroquinato sintasa (la segunda
enzima en el aromático ruta que normalmente consume DAHP), para mantenerse al día con la tasa
de producción de DAHP. En el presente trabajo explotamos esta excreción de DAHP como un
indicador de compromiso de carbono con la ruta aromática en las combinaciones de cepas /
plásmidos descritos anteriormente.
La Figura 3 muestra que la cepa de glucosa PTS NF9 que lleva el plásmido PRW5 produjo 2,9 veces
más DAHP que la cepa PTS parental PB103 que lleva el mismo plásmido. Además, cuando los genes
aroGy tktA se sobreexpresaron simultáneamente (pRW5tkt), la cepa NF9 produjo 2.4 veces más
DAHP que PB103 que contenía los mismos genes clonados, y 2.4 veces más DAHP que NF9 que
transportaba solo el aroG amplificado (pRW5, ver Fig. 3). Cada punto de datos en la Figura 3
representa el promedio de matraces duplicados. Además, se han llevado a cabo varias variaciones
del experimento y, en todos los casos, los resultados fueron esencialmente idénticos (G. Gosset y
).La posibilidad de que las diferencias en la excreción de DAHP entre los hospedadores pB103 y NF9
reflejen una diferencia en el nivel de 3-deshidroquinato sintasa (codificada por aroB) es poco
probable porque más experimentos mostraron que al amplificar (en un plásmido multicopia) los
genes aroACBLES que codifican cinco de los seis pasos de la ruta aromática común, el aumento en
la producción de DAHP (es decir, el flujo de carbono), se tradujo en una síntesis incrementada de
tirosina y fenilalanina (resultados no publicados de A. Berry) .

Figura 3.Produccion de DHA en cepas PB103 y NF9

que llevan diferentes plasmidos.La cepa NF9 es un
derivado de glucosa Pts de PB103(ver protocolo
experimental).Ambas cepas de glucosa (PB103 y
NF9)tienen el el mismo tiempo de generación(1.25
h). ,PB103/pRWw5; PB,103/Prw5tkt;
,NF9/Prw5; y ,NF9/Prw5tkt
Estos datos indican que esta cepa de glucosa PTS en realidad dirige más PEP a la formación de DAHP.
Además, los resultados obtenidos con las cepas que sobreexpresan tktA corroboran que la
formación de DAHP puede estar limitada por la disponibilidad de E4P.

En resumen, estos datos indican que los mutantes de glucosa PTS, seleccionados por su capacidad
para lograr tasas de crecimiento rápidas, pueden usarse para aumentar la disponibilidad de PEP y,
por lo tanto, el compromiso de carbono, con la ruta aromática. Creemos que esta estrategia tiene
una ventaja sobre el enfoque de sobreproducción de la PEP sintasa reportada por otros. En el último
caso, la amplificación de la PEP sintasa obliga a las células a "ir hacia atrás", contra el PTS y las dos
isoenzimas de piřuvate quinasa presentes en E. coli. Además, la necesidad de sobreexpresar otro
gen clonado (ppsA) representa una carga metabólica adicional para las células. Por otro lado, la
eliminación de PTS elimina la vía principal del consumo de PEP en E. coli ", y también reduce la
presión metabólica hacia la formación de piruvato causada por la presencia simultánea de PTS y
piruvato quinasas.

Protocolo experimental

Cepas bacterianas y plásmidos. Las cepas de E. coli utilizadas en este trabajo fueron JM101 (supE,
thi, (Alac-proAB) F ', (traD36, lacl', lacZAM15, proAB) "PB103 (F AlacU169 trpR, tnaA2), un derivado
de la cepa Trp ' C534 y TP2811 (F, xilo, argH1, lacX74, aroB, ilvA, A (ptsH, ptsl, crr) :: Km. El plásmido
PRW5 es un derivado de PACYC184 que contiene el gen aroG de E. coli clonado bajo el control del
promotor lac en tándem ( Fig. 2A). Un fragmento de ADN BamHI que porta el gen tktA de E. coli se
clonó en el sitio único BamH1 de PRW5 para generar el plásmido pRW5tkt (Fig. 2B).

Selección de mutantes. Los derivados de Pts "de JM101 y PB103 (cepas PB11 DAHP), trabajo y NF6,
respectivamente), se obtuvieron mediante transducción de fagos P1 vir usando TPB2811 como
donante, según lo descrito por Silhavy et al. Se confirmaron varias de las características fenotípicas
de la mutación Pts usando placas con base de agar MacConkey suplementadas con diferentes
carbohidratos. Además, la resistencia al antibiótico fosfomicina se usó como otro indicador del
fenotipo PTS. Las cepas PB11 o NF6 se usaron para inocular un quimiostato 1L que contenía medio
M9 (sin casaminoácidos) "suplementado con 0.2% de glucosa. La temperatura de incubación fue
de 37 ° C. El oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 20% controlando la velocidad del impulsor,
y el pH del medio se mantuvo a 7,0 por adición de base. Después de que el cultivo alcanzó una DO
de aproximadamente 2,5, se inició el lavado del fermeritor alimentando medio M9 fresco a una
velocidad de 0,52 l / h. Este índice de flujo debería eliminar todas las células que crecen con un
índice de crecimiento específico de menos de 0,4 h (en las mismas condiciones, el índice de
crecimiento específico de la cepa parental Pts fue de 0,8 h) Después de al menos 3 tiempos de
residencia, el índice de flujo de alimentación fue aumentó para eliminar las células con una tasa de
crecimiento inferior a 0,5 h. Este procedimiento se repitió utilizando incrementos incrementales en
la velocidad de flujo (0.1 L / h), hasta que se seleccionaron las cepas que tenían una tasa de
crecimiento específica de al menos 0.8 h. Antes de cada incremento incremental en la velocidad de
flujo de alimentación, se tomaron muestras del quimiostato, se diluyeron y se colocaron en placas
sobre placas de glucosa MacConkey. El medio MacConkey tiene un colorante dependiente del pH
que cambia de color en respuesta a los subproductos ácidos del metabolismo del azúcar. Después
de incubar las placas 24 ha 37 ° C, se examinaron.

Caracterización fenotípica de mutantes de glucosa PTS. La capacidad de las cepas de E. coli para
oxidar diferentes fuentes de carbono se examinó utilizando Biolog ES MicroPlates como se describió
anteriormente0. Este tipo de ensayo en placa se basa en la reducción de colorantes de cloruro de
tetrazolio (TTC) como indicador de la utilización de una única fuente de carbono. Las cepas capaces
de catabolizar el sustrato de prueba reducen el TTC y producen un color rojo intenso, mientras que
las colonias que no logran catalizar el sustrato permanecen sin color. Además, el grado de color rojo
representa variaciones en la tasa y / o grado de catabolismo2. Después de 24 h de incubación, se
examinaron las placas ES y las tasas relativas de fuente de carbono de oxidación se registraron.
Después de realizar varios experimentos con este sistema, encontramos que los valores
cuantitativos variaban. Sin embargo, la capacidad o incapacidad de oxidar una fuente de carbono
particular era reproducible.

Medición de la producción de DAHP. Las cepas se cultivaron con agitación en matraces de 30 ml, a
35 ° C. El medio utilizado fue YE, que contiene 15 g / L de extracto de levadura, 14 g / L K2 HPO4,
16 g / L KH2PO4, 5 g / L (NH4)2SO4 , 15 g / L de glucosa, 1 g / L MgSO y 1 gota de antiespumante P-
2000 (Dow Chemical, MI). Los cultivos se inocularon con células de cultivos de semillas durante la
noche. El OD (600)inicial de los cultivos fue de 0.2. Para inducir la expresión del gen aroG presente
en los plásmidos PRW5 y pRW5tkt, se agregó IPTG (isopropil-B-D-thiogalactopyranoside) a los
cultivos cuando alcanzaron un OD0 de 2.0. El pH de los cultivos se mantuvo a 6,5 a través del
experimento mediante adiciones periódicas de 45% de KOH. Se tomaron muestras a intervalos de
tiempo específicos, las células se eliminaron por centrifugación y los sobrenadantes se analizaron
para DAHP usando el ensayo estándar de ácido tiobarbitúrico.