Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Lajop 25 1 5 1 Ahej519796 PDF
Lajop 25 1 5 1 Ahej519796 PDF
Universidad Nacional de Rosario, Av. Francia y Santa Fe, 2000 Rosario, Argentina
RESUMEN. Hay una gran cantidad de sustancias, naturales o sintéticas, con posible capacidad mutagéni-
ca. Entre ellas se cuentan los compuestos N-nitroso, los que pueden formarse por reacción de nitritos con
compuestos nitrogenados, como aminas o amidas en medio ácido. Esta reacción de nitrosación puede darse
también dentro del organismo con productos nitrogenados de la dieta, incluso antibióticos. El test de Ames
es un método sencillo y eficaz de detección de este tipo de mutágenos, ya sea como compuestos puros o for-
mando parte de mezclas complejas. El objetivo del presente trabajo es realizar una somera revisión acerca
de la detección de mutagenicidad de compuestos N-nitroso mediante el test de Ames.
SUMMARY. “Detection of Mutagenicity in N-Nitroso Compounds with the Ames Test”. There are a lot of natu-
ral or synthetic products with possible mutagenic capacity. Among these, N-nitroso compounds, that are formed
by nitrosation reactions between nitrite and amines or amides in acidic medium, can also be formed into the or-
ganism. The Ames test is an efficient tool for detecting these mutagenic compounds, as pure ones or as part of
mixtures. In this paper we try to do a brief review about the detection of mutagenicity of N-nitrosocompounds by
mean of the Ames test.
PALABRAS CLAVE: Agentes mutagénicos, Compuestos N-nitroso, Nitrosación, Sulfatiazol, Test de Ames.
KEY WORDS: Ames test, Mutagenic agents, Nitrosation, N-nitroso compounds, Sulfathiazole.
* Autor a quien dirigir la correspondencia. E-mail: mrizzot@agatha.unr.edu.ar; mrizzott@fbioyf.unr.edu.ar
dos mecanismos, la actividad mutagénica juega, Dada la gran cantidad de sustancias mutagé-
sin lugar a dudas, un papel importante en mu- nicas existentes, tanto exógenas como endóge-
chos de ellos 2. nas, es muy importante disponer de un método
El cáncer es una enfermedad en la cual desa- sencillo para analizar sustancias potencialmente
parecen las reglas del comportamiento celular- peligrosas (la estructura molecular del compues-
normal 3,4. El crecimiento de las células norma- to puede ser un indicio cierto de su posible acti-
les es regulado cuidadosamente para satisfacer vidad), en especial aquellas que, debido a sus
todas las necesidades del organismo. En cam- características, podrían llegar a ser medicamen-
bio, las células cancerosas se dividen continua- tos. Aunque la relación mutágenos-carcinogéni-
mente y en forma autónoma, invadiendo e in- cos es menor que la estimada en un principio
terfiriendo la función de los tejidos normales. La 12, la detección de mutágenos es importante en
140
acta farmacéutica bonaerense - vol. 25 n° 1 - año 2006
rium LT2 y requieren histidina (o sea, son His–). dad; y factores que tienen que ver con la absor-
Adicionalmente a la mutación para histidina, ca- ción: peso molecular, solubilidad, estado físico,
da cepa presenta otras mutaciones, que hacen etc. La geometría molecular es otro punto a te-
incrementar su sensibilidad para determinados ner en cuenta: muchos carcinógenos son molé-
mutágenos. Las cepas actualmente recomenda- culas planares (ej.: policíclicos aromáticos), con
das para las pruebas generales de mutagenici- algún grupo funcional electrofílico y tamaño
dad son las siguientes: TA97, TA98, TA100 y adecuado, de modo de poder intercalarse en la
TA102. Otras cepas tales como TA110, TA89, molécula del ADN. Otro factor crítico es el me-
TA1538, etc., se han dejado de usar con fre- tabolismo, convirtiendo en mutágenos sustan-
cuencia por diversos motivos (por ejemplo, de- cias que originalmente no lo eran 19. Respecto a
tección de pocos mutágenos, reemplazo por aminas aromáticas, que representan una de las
otras más sensibles, etc.). más importantes clases de químicos industriales
y ambientales, muchas de ellas tienen reconoci-
Control de las cepas da actividad cancerígena. La exposición a ami-
Se debe confirmar el genotipo de las cepas nas aromáticas ocurre en diferentes actividades
(requerimiento de histidina, carácter rugoso, y ámbitos (industria, agricultura, humo del ciga-
sensibilidad a UV, factor R (resistencia a la am- rrillo, etc.). Los estudios teóricos de relación es-
picilina). La cepa TA102 también debe ser teste- tructura-actividad de estas sustancias han corre-
ada para requerimiento de tetraciclina. No es lacionado bien con el test de Ames en la parte
necesario comprobar el requerimiento de bioti- experimental 20.
na, ya que se trata de una mutación no reversi-
ble. Compuestos N-nitroso
Los compuestos o derivados N-nitroso se for-
Amplitud o espectro de detección del test de man por reacción de nitritos con aminas o ami-
Ames das en medio ácido 21. Todos ellos, y en espe-
Se cuentan por miles la cantidad de sustan- cial las nitrosaminas, constituyen una importante
cias que han sido ensayadas con el test de Ames clase de carcinógenos con características únicas
14, desde compuestos metálicos (complejos de en cuanto son activos en todas las especies y
hierro, rutenio y osmio con bipiridinas sustitui- poseen un amplio espectro de células blanco.
das, ensayadas con TA98 y TA100 15 o de plati- Uno de los principales aportes de nitrosaminas
no, también con las mismas cepas TA98 y al organismo humano lo constituye el humo del
TA100 16 hasta mezclas complejas como aguas cigarrillo, aunque también hay fuentes endóge-
residuales hospitalarias, también empleando las nas. De unos 300 compuestos ensayados, más
mencionadas cepas 17, o incluso para la detec- del 90% mostraron capacidad carcinogénica 22,23.
ción de antimutágenos, como la actividad pro-
tectora de flavonoides, con la cepa TA102 18. Detección de mutagenicidad de compuestos
N-nitroso mediante el test de Ames
Relación estructura-actividad Dada la importancia de los derivados N-ni-
El uso de modelos y programas teóricos que troso, tanto exógenos como endógenos, men-
estudian la relación estructura-actividad de sus- cionaremos algunos ejemplos de la determina-
tancias permiten hacer predicciones sobre su ción de su mutagenicidad, tanto como com-
potencial peligrosidad, que luego debe ser con- puestos puros o bien formando parte de mez-
firmada por estudios biológicos, entre los cuales clas.
tienen relevancia los tests bacterianos. La mayoría de la población está expuesta a
Desde el punto de vista de su mecanismo de mezclas complejas de sustancias nocivas, ya sea
acción, los carcinógenos pueden ser clasificados desde el residuo proveniente de la combustión
como: a) genotóxicos, los cuales causan daño en motores de automóviles hasta el ya mencio-
directo al ADN. Muchos mutágenos están en es- nado humo del cigarrillo de personas fumado-
ta categoría, y frecuentemente la mutación es el ras. Los primeros estudios de genotoxicidad en
primer paso en el desarrollo del cáncer. b) car- mezclas complejas provienen de la década de
cinógenos que no se ligan directamente al ADN, 1950 e involucraron mayormente la evaluación
y que en general dan negativas las pruebas de de cultivos celulares expuestos al humo del ci-
mutagenicidad (carcinógenos epigenéticos). garrillo. Sin embargo, el estudio de la genotoxi-
Aunque los mecanismos de acción son variados, cidad de mezclas complejas se puede decir que
hay factores a tener en cuenta, ya sea para la realmente comenzó en 1974, con el informe de
misma sustancia o sus metabolitos: electrofilici- Kier et al. 24 sobre la mutagenicidad de un con-
141
TROSSERO C., CAFFARENA G., HURE E.& RIZZOTTO M.
densado de humo de cigarrillo mediante el test por acción de microorganismos. Además, los ni-
de Ames. Previamente, estos autores habían tratos de la dieta, formando parte de muchos
evaluado la mutagenicidad de las fracciones ais- vegetales (como espinaca y apio), son reducidos
ladas, lo que dió información sobre cuáles com- a nitritos en la saliva, y, con la acidez estomacal,
puestos eran los responsables de la mutagenici- pueden generar intermediarios nitrogenados,
dad de la mezcla completa. De las cepas de S. entre los cuales están las potencialmente carci-
typhimurium, empleadas en el test de Ames, las nogénicas N-nitrosaminas.
más usadas para la detección de mutagenicidad Para reducir el riesgo de la formación de ni-
en mezclas complejas han sido la TA98 y la trosaminas, una de las vías sería la reducción en
TA1538 25. Esta última, sin embargo, actualmen- el uso de nitritos como aditivos en los alimen-
te no es tan empleada, ya que sus resultados se tos. Es necesario en este caso analizar la rela-
superponían en gran medida con los de la TA98 ción riesgo/beneficio, ya que los nitritos evitan
(que es más usada) 12. el botulismo, provocando la inhibición del Clos-
En 1995 se observó acción mutagénica de la tridium botulinum, bacteria que produce la
mezcla de tiamina con nitrito con la cepa mortal toxina botulínica 31. Dado su poder mi-
TA100, sin activación metabólica 26. En 1997, la crobicida, los nitritos serían una barrera natural
genotoxicidad de nitrobencenos y nitroanilinas contra gérmenes patógenos intestinales; por
fue determinada con las cepas TA 98 y TA100, otro lado, la reacción de nitrosación que puede
hallándose 10 compuestos mutagénicos sobre darse en el estómago con algunos compuestos
14 ensayados (71%) 27. Por otra parte, en 1997 nitrogenados (aminas y amidas), los acerca a la
fue revisada la mutagenicidad de más de 80 peligrosidad por la formación de derivados N-
aminas aromáticas. Muchas mostraron actividad nitroso, potencialmente cancerígenos y mutagé-
mutagénica con las cepas TA98 y TA100, con nicos 32. No obstante, se debe tener en cuenta
adición de S9 en varios casos 28. Más reciente- que la eliminación de los nitritos como aditivos
mente, la genotoxicidad de nitrosopiperidinas y no los excluye, ni mucho menos, del organis-
seis de sus alquil derivados fue estudiada me- mo. Mientras que con los alimentos se ingieren
diante el test de Ames empleando las cepas menos de 3 mg/día, se segregan en la saliva en
TA100 y TA1535. Todos los compuestos fueron el orden de 12 mg/día, a la par que las bacterias
mutagénicos con la adición de “S9” (homoge- intestinales producen unos 70 mg/día 31.
neizado de hígado de rata) 29.
Reacciones de nitrosación endógenas
Riesgos del metabolismo Como decíamos antes, muchos de estos
El ADN puede ser dañado no sólo por sus- compuestos N-nitroso están ampliamente distri-
tancias externas, sino por sustancias provenien- buidos en el medio ambiente, pero también mu-
tes del propio metabolismo, entre ellas, especies chos de ellos son formados en el interior del or-
reactivas de nitrógeno 30. ganismo mediante reacciones de nitrosación, so-
bre todo en el medio ácido del estómago 33-36.
La doble acción de nitritos y nitratos La formación de derivados N-nitroso en alimen-
El uso de nitritos y nitratos como aditivos en tos tratados con nitritos como aditivo y preser-
los alimentos trae aparejado ciertos riesgos. El vante es un hecho conocido desde hace más de
primero es el de toxicidad aguda: el nitrito es 40 años. La acción de nitritos y óxidos de nitró-
tóxico (una dosis de 2 g puede causar la muerte geno con compuestos nitrogenados secundarios
de una persona), más aún para los niños, que y terciarios en alimentos (carnes curadas -jamón
son más sensibles, por formación de metahemo- en especial-, conservas de pescado, etc.) tam-
globina, la cual es incapaz de transportar oxíge- bién lleva a la formación de compuestos N-ni-
no. Otro riesgo del uso de nitritos es la forma- troso 37. La nitrosación para dar derivados N-ni-
ción de nitrosaminas, sustancias que son agen- troso no sólo es posible en relación a alimentos:
tes cancerígenos. Las nitrosaminas se pueden también sustancias usadas como herbicidas pue-
formar tanto en el alimento como en el organis- den sufrir la reacción en el jugo gástrico 38.
mo. En el alimento se producen en aquellos Varios autores han estudiado la cinética y
productos que deben ser calentados para su ela- mecanismo de nitrosación de aminoácidos por
boración (ej.: tocino), o que son ricos en aminas acción del nitrito en condiciones de acidez que
nitrosables (ej.: pescado y productos fermenta- semejen las del estómago, hallando que las es-
dos). En este segundo caso, la formación de ni- pecies alquilantes dañinas para el ADN, luego
trosaminas se puede producir en el estómago. de la nitrosación, son las correspondientes lac-
Los nitratos se pueden transformar en nitritos tonas 39, y que la reactividad en aminoácidos
142
acta farmacéutica bonaerense - vol. 25 n° 1 - año 2006
con un grupo amino fue la siguiente: α-aminoá- vista la cantidad de mutágenos que nos rodea,
cidos > β-aminoácidos > γ-aminoácidos 40. muchos de los cuales no podemos evitar puesto
que se generan dentro de nuestro propio orga-
Mutagenicidad de la mezcla sulfatiazol- nismo, o son parte necesaria del cuidado de
nitrito cultivos. Tampoco sería bueno llegar al extremo
En nuestro grupo, en la Universidad Nacio- de eliminar todo pesticida sin tener en cuenta
nal de Rosario, decidimos investigar la posible peligros mayores, como ser la proliferación de
mutagenicidad del sulfatiazol sódico, NaST, (un hongos productores de toxinas mucho más da-
antibiótico de uso común 41, el cual posee tanto ñinas (la aflatoxina, por ejemplo, uno de los
una función amina primaria como una función carcinógenos naturales más potente que se co-
amida monosustituida en su molécula) en pre- noce) 43. Por fortuna, hay sustancias con propie-
sencia de nitritos. Se determinó la mutagenici- dades antimutagénicas (en frutas por ejemplo)
dad de NaST en presencia de nitrito de sodio en 43, y otras que reaccionan con nitritos, disminu-
medio ácido, empleando las cepas de S. typhi- yendo así su peligrosidad, como polifenoles
murium TA 98 y TA100, hallándose comporta- presentes en el té verde 44.
miento mutagénico 42. Estudios comparativos
con compuestos relacionados (ftalilsulfatiazol, Agradecimientos. Los autores agradecen a la UNR y
sulfanilamida, ácido sulfanílico) permiten sugerir a su Consejo de Investigaciones, CIUNR, por la ayuda
que, en la formación del derivado N-nitroso, es- recibida; a Graciela N. González y Vilma E. Bidut,
taría involucrada la función amida. personal de la cátedra de Microbiología de la Facul-
tad de Ciencias Médicas, UNR, por la colaboración
técnica en el trabajo experimental; al Dr. Juan Moret-
Una reflexión final a modo de conclusión ton por el fundamental apoyo brindado en las prime-
Podría resultar desalentador el panorama, ras etapas de este proyecto.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. World Health Organization (1985) Environ. ka, S. Zakeeruddin, M. Grätzel & D. Fraser
Health Criteria 51: 3-208. (1995) BioMetals 8: 257-62.
2. Bishop, J. B., K. Witt & R. Sloane (1997) Mu- 16. Gümüs, F., Í. Pamuk, T. Ösden, S. Yildiz, N.
tat. Res. 396: 9-46. Diril, E. Öksüzoglu, S. Gür & A. Öskul (2003)
3. Bishop, J.M. (1987) Science 235: 305-11. J. Inorg. Biochem. 94: 255-62.
4. Clurman, B.E. & J. M. Roberts (1995) J. Natl. 17. Paz, M., H. Muzio, V. Gemini, A. Magdaleno,
Cancer Inst. 87: 1499-501. S. Rossi, S. Korol & J. Moretton (2004) Hig. Sa-
5. Sherr, C.J. (1996) Science 274: 1672-7. nid. Ambient. 4: 83-8.
6. Fialkow, P.J. (1979) Annu. Rev. Med. 30: 135- 18. Edenhauer, R. & D. Grünhage (2003) Mutat.
43. Res. 540: 1-18.
7. Vogelstein, B. & K. W. Kinzler (1988) “The Ge- 19. Benigni, R. (2005) Chem. Rev. 105: 1767-800.
netics Basis of Human Cancer” Mc Graw Hill. 20. Benigni, R. & L. Passerini (2002) Mutat. Res.
8. Fearon, E.R. & B. Vogelstein (1990) Cell 61: 511: 191-206.
759-67. 21. Noller, C. (1968) “Química de los compuestos
9. Nowell, P.C. (1989) Cancer Cells 1: 29-30. orgánicos” II ed., Editorial Médico-Quirúrgica,
10. Inami, K. & M. Mochizuki (2002) Mutat. Res. Buenos Aires, págs. 337-338, 348-349, 670.
519: 133-40. 22. Bartsch, H., H. Oshima, B. Pignatelli, C. Mala-
11. Lojo, M. (1982) “Determinación de poder mu- vielle & M. Friesen (1991) “Nitrite-reactive phe-
tagénico de distintas sustancias” Facultad de nols present in smoked foods and amino-su-
Ciencias Exactas, UNLP. gars formed in the Maillard reaction as precur-
12. Maron, D. & B. Ames (1983) Mutat. Res. 113: sors of genotoxic arenediazonium ions or ni-
173-215. troso compounds” en “Mutagens in food: de-
13. Mc Cann, J., N. Springarn, J. Kobori & B. Ames tection and prevention” (H. Hayatsu, ed.) CRC
(1975) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 72: 979-83. Press, Boca Raton, Ann Arbor/Boston, pp. 87-
14. Trossero, C. (2000) “Tecnogenología, mutáge- 100.
nos y vida” UNR editora, Rosario, Argentina, 23. Loeppky, R. & C. Michejda (1994) ACS Sympo-
págs. 89-132. sium Series Nº 553, Am. Chem. Soc. Washing-
15. Gasiorowsky, K., K. Szyba, M. Cieslak-Golon- ton DC.
143
TROSSERO C., CAFFARENA G., HURE E.& RIZZOTTO M.
24. Kier, L., E. Yamasaki & B. Ames (1974) Proc. 35. Duarte, M., A. Laires, J. Gaspar, J. Oliveira & J.
Natl. Sci. USA 71: 4159-63. Rueff. (2000) Teratog. Carcinog. Mutagen. 20:
25. DeMarini, D. (1994) Environ. Health Perspect. 241-9.
102: 127-30. 36. Bartsch, H.; H. Oshima & B. Pignatelli (1988)
26. Hiramoto, K., H. Ni-Iyama, T. Kato & K. Kiku- Mutat. Res. 202: 307-24.
gawa (1995) Jpn. J. Toxicol. Environ. Health 41: 37. Lijisky, W. (1999) N-nitroso compounds in the
447-51. diet, Mutat. Res. 443: 1-2: 129-38.
27. Aßman, N., M. Emmirch, G. Kampf & M. Kai- 38. Cova, D., C. Nebuloni, A. Arnoldi, A. Bassoli,
ser (1997) Mutat. Res. 395: 139-144. M. Trevisan & A. Del Re (1996) J. Agric. Food
28. Chung, K-T., L. Kirkovsky, A. Kirkovsky & W. Chem. 44: 2852-5.
Purcell (1997) Mutat. Res. 387: 1-16. 39. García-Santos, M., E. Calle & J. Casado (2001)
29. González-Mancebo, S., J. Gaspar, E. Calle, S. J. Am. Chem. Soc. 123: 7506-10.
Pereira, A. Mariano, J. Rueff & J. Casado (2004) 40. García-Santos, M., S. González-Mancebo, J.
Mutat. Res. 558: 45-51. Hernández-Benito, E. Calle & J. Casado (2002)
30. Burchman, P. (1999) Mutat. Res. 443: 11-36. J. Am. Chem. Soc. 124: 2177-82.
31. Reyes, A., Rodríguez, P., C. Torres Álvarez, D. 41. Mandell, G. & M. Sande (1981) “Agentes anti-
Torres González, J. Vázquez Rodríguez & A. microbiano (continuación). Sulfonamidas, tri-
Zavala Chávez (2004) Revista de la Fac. de Sa- metoprima-sulfametoxazol y antisépticos de las
lud Pública y Nutrición 1: 49, Universidad Au- vías urinarias” en “Las bases farmacológicas
tónoma de Nuevo León, México. de la terapéutica” (Goodman, A. & L. Gilman,
32. Dykhizen, R.S., R. Fraze, C. Duncan, C. Smith, eds.) 6th ed., Ed. Médica Panamericana, Bue-
M. Golden, N. Benjamin & C. Leifert (1996) nos Aires, págs. 1087-105.
Antimicrob. Agents Ch. 40: 1422-5. 42. Trossero, C., E. Hure, M. Trapé, C. Drogo, L.
33. Laires, A., J. Gaspar, H. Borba, M. Proença, M. Monti, N. Mosconi, G. Caffarena & M. Rizzotto
Monteiro & J. Rueff (1993) Fd. Chem. Toxicol. (2005) Biocell 29: 117.
31: 989-94. 43. Forman, D. (1991) Brit. Med. J. 303: 428-9.
34. Gaspar, J.; A. Laires, S. Va, S. Pereira, A. Maria- 44. Panzella, L., P. Manini, A. Napolitano & M.
no, M. Quina & J. Rueff (1996) Teratog. Carci- d’Ischia (2005) Chem. Res. Toxicol. 18: 722-9.
nog. Mutagen. 16: 275-86.
144