Práctica N°8: Bombeo de protones en Levaduras

Objetivos:

a) Estudiar el Bombeo de Protones, parte del proceso de Fosforilación Oxidativa en

Levaduras a través del cambio del pH del medio.
b) Estudiar el desacoplamiento de la Bomba de Protones utilizando 2,4 Dinitrofenol.

En las levaduras (Saccharomyces cerevisiae), las bombas de protones se localizan en

la pared celular y en la membrana mitocondrial.

Las levaduras poseen una membrana plasmática en la que los flujos de iones están
constituidos principalmente por los movimientos de protones y potasio. El ciclo para estos
iones en la membrana plasmática se inicia con la salida de protones proveniente de la
hidrólisis del ATP y la generación del potencial electroquímico, producido por la H+-
ATPasa. El ciclo para estos iones en la membrana plasmática se inicia con la salida de
protones proveniente de la hidrólisis del ATP y la generación del potencial electroquímico,
producido por la H+- ATPasa.

El gradiente de protones producido por la ATPasa puede llegar a ser mayor de 3

unidades de pH y constituye la mayor parte de la energía que la célula requiere para impulsar
el transporte de iones; además, la acidificación del medio impide el crecimiento de otros
microorganismos. Las levaduras también poseen una bomba de protones en la membrana
mitocondrial interna que se encarga de permitir la síntesis de ATP en la cadena
transportadora de electrones o cadena respiratoria (a partir de productos metabolizados de
glucosa), la cual está constituida por un grupo de enzimas acopladas que catalizan la
oxidación y reducción como la pérdida o ganancia de electrones en un proceso denominado
fosforilación oxidativa. El 2,4 dinitrofenol es un agente desacoplante e impide la fosforilación
de ADP a ATP.

Figura 1 Representación esquemática de los principales flujos de protones (H+) y iones [M+ (K+, Na+)] y
posible mecanismo (Ramírez y Peña, 2000)

En la presente práctica se medirá el pH extracelular a través del tiempo y además

comprobar el desacoplamiento por el 2,4 dinitrofenol.

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Materiales y Reactivos:

1. Suspensión de levaduras 4%
2. 2,4 dinitrofenol
3. Potenciómetro
4. Glucosa al 12 %
5. Tubos de ensayo

Procedimiento:

1. Preparación del Control

• Preparar dos diluciones de 5 ml de la levadura con 10 ml de agua destilada en tubos de

ensayo A y B.
• Al tubo B adicionar 4 mL de glucosa al 10% agitando y midiendo el pH
• Determinar el pH de la solución en intervalos de 3 minutos.
• Luego determinar el pH de la solución en intervalos de 5 minutos por 20 minutos y luego
en intervalos de 10 minutos por 20 minutos más hasta 45 minutos aproximadamente

2. Preparación del Desacoplamiento

• Preparar un tubo C con 5 ml de la levadura con 10 ml de agua destilada y por

decantación se adicionó a la solución 0.2 ml de dinitrofenol 40 mM.
• Medir pH de la solución a intervalos de 2 minutos luego cada 5 minutos.
• Luego adicionar 4 ml de glucosa al 10% agitando y midiendo el pH en tubos de ensayo A
y B.
• Luego determinar el pH de la solución en intervalos de 5 minutos por 15 minutos.
• Anotar los cambios de pH obtenidos en el tiempo y elaborar una gráfica Tiempo vs pH
para cada tubo.

Tiempo pH-A pH-B pH-C

Cuestionario:

1. Describa lo observado en cada tubo y discuta sus resultados.

2. Explique el acoplamiento fosforilación oxidativa y transporte de electrones

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3. Mencione las características del Bombeo de Protones hasta la formación de ATP.

4. Explique los complejos del sistema de transporte de electrones que participan en la síntesis
de ATP.

Bibliografía:

1. Ramírez J y Peña A( (2000) Intercambiadores catión/protón en levaduras. Revista

Latinoamericana de Microbiología. Vol 42: 181-187.
2. NELSON, D.L. & COX, M.M. 2006. Lehninger principios de bioquímica. Cuarta
edición.Editorial Omega
3. http://www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2000/mi004h.pdf

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