Biotransformación de resveratrol: Nuevo trans-resveratrol prenilado sintetizado por

Aspergillus sp. SCSIOW2

hongo profundo derivado del mar, Aspergillus sp. SCSIOW2

Resumen:

Arahypin-16 (1), un nuevo resveratrol prenilado con un único anillo de dihidrobenzofurano,

ha sido aislado como metabolito microbiano del resveratrol (2) a partir de la fermentación
de células enteras de Aspergillus sp. SCSIOW2. La estereoquímica de 1 se determinó
mediante cálculos de ECD. 1 mostró aproximadamente la mitad del efecto de eliminación de
radicales extracelulares (IC50 = 161,4 \ mu M) en comparación con resveratrol (IC50 = 80,5 \
mu M), mientras que en biomembranas exhibió el mismo intervalo de efectos de protección
contra radicales libres generados a partir de AAPH (IC _ M y 87,9 \ mu M).

Palabras llave: resveratrol; prenilación; Aspergillus sp. SCSIOW2; ECD; actividad de

protección de eritrocitos; Actividad de eliminación de DPPH

1. Introducción

Resveratrol es bien conocido por los posibles efectos sobre la enfermedad coronaria
observada entre los bebedores de vino [1]. Hoy en día el resveratrol, que posee una amplia
gama de actividades biológicas, como antioxidantes, antiinflamatorios, antivirales,
antimicrobianos, anticancerosos, protección cardiovascular, quimioprotección,
neuroprotección e inmunomodulación es uno de los productos naturales mejor estudiados [
2]. Los datos anteriores han proporcionado interesantes conocimientos sobre los efectos de
este compuesto en la vida útil de diferentes organismos y podría convertirse en un potencial
agente anti-envejecimiento en las enfermedades humanas degenerativas [3]. Sin embargo,
cualquier aplicación medicinal adicional de resveratrol es limitada debido a su baja
biodisponibilidad y solubilidad. Los investigadores han encontrado que la adición de
isoprenoides sustitutivos en varios esqueletos de polifenoles aumentó significativamente la
bioactividad en comparación con compuestos similares que no están prenilados [4]. Por
ejemplo, la introducción de un grupo 8-prenilo induce actividad estrogénica en la
naringenina. Además, la 8-prenilnaringenina se absorbe rápidamente después de la
administración oral, en comparación con la generalmente baja biodisponibilidad oral de los
flavonoides [5]. Por lo tanto, se han desarrollado diferentes estrategias para la síntesis de
dichos compuestos. Las estrategias sintéticas orgánicas más utilizadas son activadas por
bases fuertes o por reacciones de acoplamiento catalizadas por sales metálicas. Ambas
reacciones se llevan a cabo normalmente en condiciones extremas y se necesitan medidas
adicionales de protección y desprotección. La quimioselectividad, regioquímica y el número
de prenyls son también difíciles de controlar [6]. Recientemente, se utilizaron también
síntesis enzimáticas de quimio usando enzimas o células enteras para la síntesis de
componentes aromáticos prenilados. Las reacciones de este tipo son habitualmente
regioselectivas, estereoselectivas y se producen en condiciones suaves, por lo que la
introducción de grupos prenilo en compuestos diana mediante el uso de microorganismos
representa una alternativa atractiva a los resveratrols prenilados que no se han informado
previamente de los cacahuetes, semillas desafiadas por diferentes hongos. Se consideró que
estos nuevos compuestos desempeñaban un papel defensivo contra los hongos invasores.
Sin embargo, las bioactividades y el origen real de estos componentes no fueron discutidos
plenamente [9, 11].

Estamos interesados en utilizar cultivos microbianos como biocatalizadores para preparar

análogos nuevos y potencialmente activos de compuestos polifenólicos. En este estudio,
Aspergillus sp. SCSIOW2 mostró una alta actividad para la prenilación regiospecífica de
resveratrol. Aquí se describe la biotranformación, aislamiento y estructura elucidación de la
arahypin-16 (1), un nuevo resveratrol prenilado con un único anillo de dihidrobenzofurano,
como metabolito microbiano de resveratrol (2) de la fermentación de células enteras de
Aspergillus sp. SCSIOW2 (Figura 1).

Figura 1. La conversión de trans-resveratrol en 1 es catalizada por Aspergillus sp. SCSIOW2.

(A): Estructuras de trans-resveratrol (2) y arahypin-16 (1); (B): Cromatograma UV de HPLC a
309 nm de extractos de EtOAc de caldo de fermentación tratado sin tratamiento (a) y
resveratrol (b).
El espectro de ECD de 1 fue registrado y comparado con los calculados para cada
enantiómero utilizando el método de la teoría funcional de la densidad dependiente del
tiempo (TDDFT) [12 - 17]. Después del análisis del espacio de conformación, se encontraron
22 conformadores para 1 (la Tabla S1 muestra las poblaciones en equilibrio de 22
conformaciones estables en metanol al nivel B3LYP / aug-cc-pVDZ). Por consiguiente, el
espectro de ECD calculado para el enantiómero 16R encaja con el gráfico experimental de 1,
que exhibió dos efectos negativos y dos positivos de algodón a 315, 245, 263 y 221 nm,
respectivamente. Sin embargo, el espectro ECD calculado del enantiómero 16- (S) era
opuesto a los datos ECD experimentales (MFoilgecuurlees 320). 16H, 2e1n, 8c8e3, se
determinó que la estereoquímica de 1 era 16- (R).
Figura 3. Comparación del ECED de R-tChaelceuxlpaetrioimnental con 1 (redS-)
Cwalicthulathtioosne calculado para los enantiómeros 16- (R) (azul) y 16- (S) (verde).
(Corrección UV = 0 nm, ancho de banda \ theta = 0,16 eV).

Los daños oxidativos de las membranas celulares están estrechamente relacionados con
varias enfermedades de radicales libres, como la artritis reumatoide, la aterosclerosis, el
cáncer, etc. [18]. La hemólisis de eritrocitos es un modelo relativamente simple para
estudiar el daño oxidativo a biomembranas debido a su composición enucleada [19]. La
actividad antioxidante de nuestros compuestos se evaluó a través de la protección
biomembrana contra la hemólisis inducida por 2,21-azobis (2-metilpropionamidina)
dihidrocloruro (AAPH), con valores de IC50 de 78,6 \ mu M de 1 y 87,9 \ mu M de 2,
respectivamente (Figura 4 ). La actividad de eliminación de DPPH también se ensayó para
aclarar su capacidad para eliminar radicales libres extracelulares, proporcionando valores de
IC50 de 161,4 \ mu M de 1 y 80,5 \ mu M de 2, respectivamente (Figura 5). Al comparar los
dos experimentos, el compuesto prenilado arahypin-16 (1) mostró aproximadamente la
mitad de la extracción de radicales extracelulares de resveratrol, mientras que exhibió el
mismo rango de efecto de protección biomembrana contra radicales libres producidos por
AAPH. Los componentes prenilados están ampliamente distribuidos en productos naturales
y exhiben una amplia gama de actividades biológicas. Sin embargo, en la mayoría de los
casos no está claro si el grupo prenilo tiene un papel específico en la bioactividad. La escasez
de estudios sistemáticos sobre componentes prenilados se debe principalmente a su
limitada disponibilidad. Recientemente, se ha demostrado un número impresionante de
bioactividades para los flavonoides prenilados, especialmente para la quimioterapia contra
el cáncer, lo que ha inspirado a los investigadores a generar nuevos componentes
prenilados mediante el uso de diferentes estrategias [20]. Las síntesis quimio-enzimáticas
han llamado la atención de los científicos, porque son en su mayoría regioselectivos y
estereoselectivos y se producen en condiciones suaves. Las preniltransferasas se han
utilizado con éxito para la producción de más de 250 derivados prenilados, tales como
tirosina prenilada, xantona, hidroxinaftalenos, flavonoides, indolocarbazoles y
acilfloroglucinoles [6]. En este estudio, Aspergillus sp. SCSIOW2 mostró alta actividad de
prenilación regiospecífica con resveratrol, generando arahypin-16 (1), un nuevo
componente con un único anillo de dihidrobenzofurano. Este es el primer informe sobre la
prenilación de resveratrol por biotransformación fúngica, que nos proporcionó un
resveratrol prenylated, arahypin-16 (1), para la comparación de bioactividad más.

3. Materiales y Métodos

3.1. Procedimientos generales Las rotaciones ópticas se determinaron en un polarímetro P-

1020 (Jasco, Tokio, Japón). Los datos UV se registraron en un espectrómetro Lambda 25 UV
/ V (Perkin Elmer, Boston, MA, EE.UU.). Los datos de IR se registraron utilizando un
espectrómetro Nicolet Avatar 330 FT-IR (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). Los
espectros de RMN se adquirieron en un sistema de imanes NMR Bruker ASCEND 600 MHz
(Bruker, Ettlingen, Alemania) usando TMS como patrón interno. HPLC ESIMS se realizó
utilizando un sistema 6120 Single Quad LC / MS (Agilent Technologies, Santa Clara, CA,
EE.UU.). HR-ESIMS se realizó utilizando un Bruker maXis). Los espectros CD se registraron en
un espectrómetro Jasco J-815 CD. La cromatografía en columna se realizó usando gel de
sílice (100-200 mesh, Qingdao Marine Chemical Factory, Qingdao, China) y Sephadex LH-20
(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EE.UU.). La TLC se realizó en placas de
Merck TLC (gel de sílice 60 RP-18 F254S y gel de sílice 60 F254, Merck Millipore Corporation,
Darmstadt, Alemania), con los compuestos visualizados por pulverización con H2SO4 al 10%
(v / v) en EtOH y luego calentando sobre un plato caliente. La HPLC se realizó en una bomba
Shimadzu LC-20AT (Shimadzu Corporation, Tokio, Japón) equipada con un detector SPD-20A
UV-Vis y una serie Agilent Technologies 1260 Infinity con un detector 1260 DAD. Se utilizó
una columna analítica Agilent Technologies ZORBAX RX - C18 (4.6 \ sim 150 mm, 5 \ beta)
para el análisis y fines semi - preparativos. Resveratrol se adquirió de Sinopharm Chemical
Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). El conejo experimental de Nueva Zelanda se compró de
Guangdong Medical Laboratory Animal Center (licencia animal: SCXK (provincia de
Guangdong) 2014-0035) y se alimentó a 22? 2 \ cdot C con humedad relativa al 50%. La
medición de la absorbancia en el ensayo de protección de eritrocitos y el ensayo de
eliminación de DPPH se realizó con Varios-Kan Flash

(Thermo Fisher Scientific).

3.2. Tensión

El hongo SCSIOW2 se aisló a partir de una muestra de sedimentos marinos profundos

recogida en el Mar de China Meridional (112 - 30.203E, 18 - 1.654N) a una profundidad de
2439 m. Este hongo se caracterizó como Aspergillus sp. Basado en el análisis de la secuencia
de la región ITS con Genebank S1. Este hongo fue depositado en el Laboratorio de Microbios
Marinos, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Shenzhen (Shenzhen, China).

3.3. Fermentación, extracción y aislamiento

Medio de siembra (10,0% de glucosa, 2,0% de harina de soja, 0,5% de peptona, 0,2% de
NaCl, 0,05% de KH _ {2} PO _ {4}, 0,024% de MgSO _ {4}. Medio de producción (7,6% de
sacarosa, 2,6% de harina de soja, 1,0% de NaOAc, 1,0% de ácido cítrico, 0,6% de CaCO3,
0,5% de glicerina, 0,01% de MgSO4, ajustándose el pH a 7,0). Aspergillus sp. Se cultivó
SCSIOW2 en matraces de Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de medio de siembra.
Después de crecer a 28 ◦ C, 220 rpm durante 3 dıas, el material celular se colocó en un tubo
Falcon estéril y se mezcló agitando vorticialmente durante varios minutos para crear una
suspensión de hongos / esporas uniforme de hongos. Se inocularon alícuotas (1 ml) de
cultivos de siembra en 70 ml de medio de producción en matraces Erlenmeyer de 250 ml. En
el momento de la inoculación, se añadió alícuota de 0,5 ml de resveratrol disuelto en EtOH
(16,0 mg), dando como resultado concentraciones finales en el medio líquido que contenía
resveratrol 1 mM. Se añadió el grupo de control con la misma cantidad de EtOH. Los cultivos
resultantes se fermentaron a 28 ◦ C en condiciones estáticas durante 7 dıas. El caldo
fermentado se filtró para obtener sobrenadante y micelio. El caldo sobrenadante se extrajo
tres veces con 70 ml de EtOAc. Los extractos de EtOAc de cada condición se analizaron por
HPLC de fase inversa sobre una columna analítica ZORBAX RX-C18 (4,6 \ leq 150 mm, 5 \
beta) eluida con MeOH - H _ {2} O (0: 100-100: 0 durante 30 min, min). Para la escala
preparativa, se cultivó Aspergillus terreus utilizando 45 matraces Erlenmeyer de 250 ml que
contenían 70 ml de medio de producción en presencia de resveratrol 1 mM. El extracto
combinado de EtOAc después de la evaporación (580,0 mg) se aplicó a un cromatógrafo de
columna Sephadex LH-20 (CC) con CHCl3-MeOH (1: 1) para proporcionar siete fracciones
(Fr.1-Fr.7). El P.4 (28,6 mg) se purificó adicionalmente mediante HPLC con una columna
ZORBAX RX - C18 eluida con MeOH - H _ {2} O (0: 100 - 100ºC durante 30 min, 1,0 ml / min)
para dar el compuesto 1 (9,8 mg, tR 19,8 min).

Arahypin-16 (1): white powder; r

s 27 D +125 (c 1.0, MeOH); UV (MeOH) max (log ") 308 (3.99) nm, 320 (3.98), 218 (3.97), 201
(4.09) nm; IR (film) max: 3251, 2976, 1594, 1491, 862.7, 833.1 cm1; HRESIMS m/z 391.0556
[M + Br] (Calcd. for C19H20BrO4, 391.0550); 1H- and 13C-NMR see Table 1.

3.4. Quantum Chemical ECD Calculations

In this study, we used the ECD calculation protocol proposed by Nugroho and Morita [13].
The initial 3D structures of the molecules were prepared using Chem3D and minimized with
the MMFF94S force field implemented in Chem3D. After the initial structure was further
optimized with XedMin in default mode, the conformation space was sampled using XedeX
with an energy window of 5
kcal

mol1 above the ground state and RMSD 0.8 to remove duplicated conformers [14]. Then,
each conformer was optimized and verified as true minima of the potential energy surface
using Gaussian 09 with the DFT method at the B3LYP/aug-cc-pVDZ level [15]. The polarizable
continuum model (IEFPCM) was used to take the solvent effects of methanol into account.
The optimized conformers were further used to perform a TDDFT calculation at the
B3LYP/aug cc-pVDZ level with the polarizable-conductor calculation model (IEFPCM,
methanol as the solvent). In each TDDFT calculation, the 100 lowest electronic transitions
were calculated for each conformer. The ECD spectra and overall ECD spectra (weighted by
Boltzmann statistics) and comparison of the experimental and calculated spectra were
performed using the software SpecDis [16,17].

3.5. Preparation of Erythrocytes

Packed erythrocytes were obtained by centrifuging whole rabbit blood with 3.2% citrate at
700 g for 10 min at 4 C. Cells were washed three times with 0.9% NaCl solution and finally
suspended in the buffer solution to obtain a citrated blood, stored at 4 C and were used
within 48 h.

3.6. Medición de la protección de membrana de hemólisis y eritrocitos

Para el ensayo de hemólisis, un método ligeramente modificado del de Niki, Etsuo, et al. fue
seguido [12, 13, 21]. Brevemente, 6 \ 108 ml \ Delta 1 de los eritrocitos lavados se
precalentaron a 37ºC y se mezclaron con los compuestos ensayados disueltos en DMSO y se
diluyeron con solución de NaCl al 0,9% para producir las concentraciones finales tal como se
describe en la Figura 4. Después de la incubación a 37ºC durante 30 min, se añadieron 250 \
mu L de solución de AAPH a 100 mM para inducir hemólisis durante 60 min a 37ºC. La
mezcla de reacción se centrifugó a 700 g durante 2 min y se midió la absorbancia del
sobrenadante a 545 nm. La hemólisis relativa se calculó en comparación con la hemólisis en
agua dd, que se tomó como 100%. Cada conjunto de experimentos se realizó por triplicado.

3.7. Actividad de limpieza radical DPPH

DPPH scavenging ensayo se realizó como se describe anteriormente [22]. Los compuestos
ensayados se disolvieron en DMSO y se diluyeron con una mezcla de etanol y tampón HOAc
/ NaOAc 0,4 M (3: 1) hasta concentraciones de trabajo, seguido de la adición de solución de
etanol DPPH al 20% (m / v) y luego se incubaron en oscuridad durante 30 min. Se midió la
absorbancia a 517 nm. La actividad de eliminación de DPPH de las muestras se calculó en
comparación con la absorbancia en etanol y tampón HOAc / NaOAc, que se tomó como
100%. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

3.8. Análisis estadístico

Todos los resultados se expresaron como media? DAKOTA DEL SUR. La significación
estadística (valores p) de los resultados se calculó mediante la prueba t de Student usando
el paquete de software GraphPad Prism 5 (San Diego, CA, EE.UU.). Los resultados se
consideraron significativos cuando p <0,05.

4. Conclusiones
En resumen, hemos informado de la conversión de trans-resveratrol a arahypin-16 (1)
catalizada por Aspergillus sp. SCSIOW2. Este es el primer derivado de trans-resveratrol que
contiene un anillo de dihidrobenzofurano y el primer informe referente a la prenilación del
resveratrol por biotransformación fúngica directa. Arahypin-16 (1) mostró
aproximadamente la mitad de la extracción de radicales extracelulares de resveratrol,
mientras que exhibió el mismo rango de efecto protector sobre biomembranas contra los
radicales libres producidos por AAPH. Este es también el primer informe sobre las
actividades de protección de la biomembrana del resveratrol y sus derivados. Materiales
Suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en http://www.mdpi.com/1420-
3049/21/7/883/s1, Tabla S1: Distribución de Conformer de 1 en modelos solvatados
(metanol) en el B3LYP / aug -cc-PVDZ, Figuras S1-S6: Espectros de RMN para el compuesto
1. Figura S1: Espectro 1H-RMN de 1 en DMSO-d6, Figura S2: Espectro de RMN 13C y DEPT de
1 en DMSO-d6, Figura S3: 1H -1H espectro de COZY de 1 en DMSO-d6, Figura S4: Espectro
de HSQC de 1 en DMSO-d6, Figura S5: Espectro de HMBC de 1 en DMSO-d6, Figura S6:
espectro de NOESY de 1 en DMSO d6. Agradecimientos: Este trabajo fue apoyado por la
Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) con el número de subvención
41276136; el Proyecto de Ciencia y Tecnología de la ciudad de Shenzhen, Shenzhen Oficina
de Ciencia, Tecnología e Información en virtud de Grant JCYJ20150827101359276; y por el
Proyecto de Equipo de Innovación Interdisciplinaria de la Universidad de Shenzhen. El Sr.
Gaokeng Xiao de Guangzhou Molcalx Information & Technology Ltd. apoyó los cálculos de
ECD. Contribuciones de los autores: LiyanWang, YanhuaWu y Yongtao Chen realizaron
experimentos. Jiaxin Zou llevó a cabo parte de la fermentación y el aislamiento. Liyan Wang
analizó los datos espectroscópicos y elucidó las estructuras. LiyanWang escribió el
manuscrito; Xiaofan Li condujo la protección de la membrana de los eritrocitos y el
activador del radical DPPH. LiyanWang y Xiaofan Li supervisaron el trabajo de investigación.
Conflictos de Interés: Los autores declaran no haber conflicto de intereses.