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PSTER TCNICO

Caracterizacin morfolgica y cultural

de Fusarium culmorum (WG.Smith) Sacc.

F. Sempere, F. Ga rca, M.P Sanlamarina (Departamento de Biologa Vegeta l. Escue la Tcnica Supe
rior del Medio Rural y Enologa. Universidad Politcnica de Valencia . mpsanlam @bvg.upv.es)

Aunque han aparecido nuevas tcnicas analti cas para la determ inacin de las especies fn
gicas, una herram ienta importante y tradic.on al oara el control micolgico es el uso de mto
dos smpies de identificacin especifica que se realiza en base al aspecto de las co lon ias y la
rnicrom orfoioga en varios medios de cultivo a disti ntas temperaturas de incubacin . El ob
jetivo de este estud io fue caracterizar morfolgicam ente y culturalmente al hong o Fusarum
cu/morum ai slado a partir de mu estras de arroz con un periodo de al macenamie nto de nu eve
meses. Para ello, se procedi a utilizar cuatro medios comun es : POA, MEA, Cz y PSA en
los qu e se se mbr la es pecie en uno y tres puntos respectivamente y se incub durante 5
das a 25C por ser esta la temperatura ptima descrita por variosautores. Para el estudio de
las ca ractersticas microscp icas se utiliz la tcnica del microcultivo .

INTRODUCCiN

De los genitivos plurales latinos tusus-i (huso , por la forma de las esporas) y cutmus-i (caa) Fusarium sp. comprende una gran diversidad de
hongos que estn distribuidos portodo el mundo como oportunistas , saprofitos de restos vegetales e importantes patgenos de una gran var
iedad de plantas de diversas condiciones medioambientales (DOOHAN y col., 2003; LOGRIECO y col., 2003).
Las clamidosporas son ovales o globosas, intercalares o terminales con paredes lisas o rugosas, formadas individualmente en cadenas o
en racimos.
Adems se caracteriza porsecretar una sustancia hidrfila en cultivos viejos de 2 3 semanas y por la germinacin de los macroconidios para
producir microconidios aberrantes en filides pequeas. Los macroconidios constituyen una importante fuente de inoculo y se convierten en
el suelo en clamidosporas donde pueden sobrevivirdurante muchos aos para posteriormente germinar infectando las races de las plantas
(SITION y col., 1981).
Es de todas las especies del gnero Fusarium el nico que compite bien con las especies de Aspergillus y Penicillium (LACEY, 1989).
Fusarium culmorum, es considerado como un hongo de campo ya que requiere un alto contenido de humedad en el substrato para su crec
imiento y la sntesis de micotoxinas (> 20 %) pero ocasionalmente se desarrolla en almacn cuando las condiciones le son favorables, es
decir, a bajas temperaturas y alta humedad o si el grano ha sido secado nsuficientemente y de forma rpida (LACEY y MAGAN, 1991 ; CARUSO y
cot., 1999; LOGRIECO y col., 2003; HOPE y col., 2003).
Con independencia de su origen geogrfico sus condiciones ptimas de crecimiento son: una temperatura de 25C, una actividad de agua de
0.99 o con un intervalo comprendido entra-s a -14 bars y un pH bajo..(COOK y CHRISTEN , 1976; LACEY y MAGAN , 1991 ; PARRY Y cot. , 1994; BREN

NAN Ycol., 2003). Porotra parte es una especie muy tolerante a las bajas tensiones de O2 y presenta una alta resistencia a la radiacin (MA

GAN YLACEY, 1984b; 'Nau Y col., 1991).

Fusarium culmorum es un importante patgeno de un amplia variedad de plantas, especialmente de cereales , reduciendo la germinacin de

las semillas, causando enfermedades en la plntulas, la podredumbre del pie y la razy la fusariosis o scab (HESTBERG y col., 2002; MIEDANER

Ycol., 2004).

La fusariosis fue considerada durante muchos aos como una enfermedad de importancia secundaria pero debido a su severidad , el aumen
to de su frecuencia de aparicin, el impacto que tiene sobre el rendimiento y la calidad del grano y la contaminacin de este por micotoxi
nas, actualmente es una de las ms importantes enfermedades fngicas (BAI y col., 1996; LIGGIIT Ycol.,1997; DOOHAN y col.,1999; VISCONTI y
col., 2000; VI Y cot., 2001). Es una enfermedad compleja y de infeccin floral llegando a ser asociada con ella hasta 17 especies fngicas.
Ha sido descrita en todo el mundo siendo F. culmorum predominante en las zonas fras del noroeste de Europa , Canad y norte de Estados

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Un idos (PARRYy col., 1995; PIRGOZllEV y col., 2003; TAN y col., 2003).

POSICiN TAXONMICA
Po r ot ra parte , algunos de los agentes de biocontrol descritos para este hongo han sido:

Glioeadium sp ., Clonostaehis rosea y Phythium sp. (TEPERI Ycol., 1998; DAVANLOU y col. , 1999;

Phylum: Ascomycota
JENS EN yeol.,2ooo).

Clase: Euascoycetes
Fusarium eulmorum exhibe una gran diversidad molecular y fenotpica. Agresividad , perfiles

Orden: Hypocereales
y concentrac iones de micotoxinas varan entre aislados (MIEoANER y col. , 1996a; GANG y cot. ,

Familia: Hypocreaceae
1998; MUTHoMi y col. , 2000).

Gnero: Fusarium
La principales micotoxinas que produce son: learalenona (lEA), Deoxinivalenol (DON), Ni
Especie: F. eulmorum
valenol (NIV), Fusarenona-X (FUS), zearalenol (a y a isomeros) (loH) y monoaceli ldeoxini

valenol (3-AcDON , 15-AcDON) (ac-DON) (LOGRIECO y col. , 2003) (Figura 1).

La lea ra lenona tamb in llamada toxina F-2, es una lactona derivada del cido resorclico. Es un contaminante natural de la mayoria de ce

reales como trigo , maz, cebada , sorgo , etc., ya sea en campo o en almacn . Pero tambin se ha encontrado en otros alimentos (CHEKOWSKI y

col. , 1983; TANAKA Ycol.,1985; UENO ,1985; GONZLEZ y cot., 1999; SILVA Y cot.. 2001) . Se caracteriza por ser dbilmente fitotxica y producir hiper

estrogenismo y problemas reproductivos en el ganado y animales de experimentacin (DESJARDlNSy col. , 2001). El nivel mximo admisible os

cila entre 30 y 1000 Ilg/Kg de cereales , legumbres y nueces segn los pases (SANCHIS y col.,2000).

OON , NIV y FUS son tricotecenos de tipo Bque poseen una funcin carbonilo en el carbono 8. Los tricotecenos son steres de alcoholes sesquiter

pnicos que contienen un sistema caracterstico de anillo triccl ico junto con el grupo 12,13-epxido. DON produce diarrea , nauseas, vmitos ,

cefalalgia , dolor abdominal , anorexia, escalofros , convulsiones , vrtigo ; y tiene efectos sobre el sistema inmunitario de los humanos, y en

an imales produce rechazo del alimento , vmitos e inmunosupresin (TERAo y col. , 1991 ; BULLERMAN, 1997).

Materiales y mtodos
CH

't--+--R,
Aislam iento de la especie
Laespec ie que sehautilizado eneste trabajo, fue aislada en el laboratori o
de Bi ologaVegeta l delaEscuela Tcnica Superior del Medio Rural y Enologa
de muestrasde granosdearroz con unperiodo de almacenamiento de 9meses.
La empresa suministradorafueCOPSEMAR.
Paraello se prepar Agar Patata Dextrosa al que se aadi clorafenicol a
razn de0,5 gIl paraevitar el crecimiento delevaduras y bacterias.
En unagasa previamente esterilizadasecolocaron50 granosque fueron sumergi
dosenunasolucin de hipoclorito sdico al 2%durante 3minutosydespus se
hicieron dos enjuagues sucesivosde la misma duracin con agua destiladaestril.
Posteriormente, secolocaronaspticamente 5granos po r placa yse incub
durante5dasa25C en oscuridad (Figura 2).
Finalmente, seprocediaseparar las diferentes coloniasde las especies
fngicas.
Crecim iento in vi/ro de la especie
Seobservaron los mohos crecidos encuatromedios comu nes: Agar Pata
taDextrosa (PDA), Agar ExlraclodeMalla (MEA), Agar Czapek-Dox(Cz) yAgar
de DextrosaSabouraud (ADS)
Lasiembrase hizo en uno y tres puntos eq uidistantes conplaca invert ida,
yseincubarona25'Cduran te cinco das.
Paralacarac terizacinmicroscpicaydeb ido aquelamanera deformarse
lasesporas y lascaractersticas dela clula conidigena sonfundamentales para
laidentificacin de los fusarios, fue necesario emplear la tcn ica del microcul
tivo(STEIFERT, 2000). Paraellose deposit un cuadrado de 1cm de lado delos
disti ntosmedi osempleados so breunportaobjetos. Se sembr el hongoen los
bordes y se co loc el cubreobjetos El conj unto se apoy sobre una vari lla de
vidrio dentro de unaplacaPetri en cuyo fondo se haba depositado papel de
filtroembebido enagua. Todo el material utilizado fue esterilizadopreviamente
y el montajeserealizen condiciones aspticas.

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1
JI<

tu.

CH,

R,

l,

Radicales de tricotecenos tipo B

DON
NIV
FUS

OH H
OH
OH OH
OH
OH OCOCH3 OH

OH
OH
OH

Estructura tricotecenos tipo B

Zearalenona

15acetil-deoxinivalenol

Figura 1. Algunas de las principales micotoxinas producidas por


Fusarium eulmorum.

Determinacin de ca racteres morfolgicos y culturales


En cada unade las placas seobservaron los siguientes caracteres:
Caracteres morfolgicos:

1. Caractersticasdelashitassumergidas: color, presencia oausencia desep


tos, dimetro aproximado ycaracteresdistintivosde estructuras especiales
si tienen.
2, Grado de desarrollo de las estructu ras de fructificacin.
3. Caractersticas y disposicin de los rganos defru ctificacin maduros, li
bresobien en el substrato, en lasuperficie oen el mi celio areo. Tambin

es muy importante destacar si existe ms de un tipo de estructuradees

porulacin .

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A

clul as ap lca les

;//

/'\

clul as basales en forma d e pie

:c
~

Figura 4. Fusarium culmorum: (A)Detalle de macroconidios. (B) Mi


croconidios y macroconidios (x400) (C) Macroconidios y clami
dosporas (x 400) (D) Conidiforos y macroconidios (x 400 CF (con
traste de fase)) .

Figura 2. Distintas colonias fng icas crecidas a partir de los granos


de arroz sembrados en PDA durante 5 das a 25C en la oscuridad.

ADS 5D

ADS70

AOS SD

4. Co lor, tamao y forma delos rganos defructificacin, tomando medidas


de laspartes esenciales y disposicin enellas de esporas.
5. Detalles sobre laestructurade fructificacin, tomandomedidasdelas partes
fundamentales y disposicin en ellas delas esporas.
6. Detallescompletos de lasesporas: color, forma, tamao, tabicacin ymar
cas superficiales.

Caracteres culturales:

PDA 50

POA 7D

POA5D

1. Grado decrecimiento. Se describe como muy lento, lento, moderado, dis


creto, rpido, etc. En algunas diagnosis se dan los dimetros reales delas
colonias transcurrido un determinado nmero dedas.
2. Color delacolonia y cambios que pueda sufrir. Si es uniforme, porzonas
oenmosaico. Esinteresante anotar tambin los coloresqueaparecen alrede
dorde las colonias en desarro llo.
3. Colores y cambios quepuedan producirseenel reverso delas colonias.
4. Cambios decolor en el medio, tanto si tienen lugar slo en el rea de la
colonia o si se hadifundido aeste.
5. Texturasuperficial, ya sea sueltaocompacta, plana, rugosa ocurvada, ater
ciopelada, algodonosa, filamentosa, gelat inosa, etc.
6. Olorsi existe. En general son muy difciles dedescribir. Muchas especies
tienen un olorque podramos catalogar como "enmohecido".
7. Caractersticas del exudado del lquidotranspirante, que se encuentra, ave
ces, en el crecimientoareo
Las pr incipales monog rafas quese han utilizado para laclasificacin del
gnero Fusar/umson: Booth (1977); Gerlachy Niremberg, (1982); Nelson y col.
(1983); Burgess y col. (1988); Pitt YHocking (1999); Samson y col. (2000).

Resultados Vdiscusin
Figura 3. Fusarium culmorum en diferentes medios decultivo a 25C.
Andverso: columna izquierda y derecha . Reverso : columna cen
tral. (3D, 4D, 5D Y7D: 3, 4, 5 Y7 dasde cultivo).

EnPDA a25C lascolonias presentan undimetrode7.5 a9cm en 4das sien


dodonde se presenta unmayor crecimiento. El micelioareo es algodonoso, al
principiosuco lor va de blanco aamarilloorosa,volvindoseocre omarrnro-

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jizo y fieltroso cuandosehace viejo El reverso y la superficiedel agar, adop
tanuna coloracin roja-prpurao marrn (Figura3)
En ADSel crecimientoesmuy similar al queseproduceenPDA aunque un
poco menos vigoroso y deunatonalidad ms intensa.
Lascolonias en MEA presentan undimetrode4a5 cm , en4 das, de as
pecto atercopelado. Decolorrojoclaro hastarojopastel, comnmente conuna
capa naranja griscea hasta marrnamarillenta; reverso marr namarrn rojizo
(Figura3).
Lascolonias crecidas enAgarCzapek, alcanzan un dimetro de5 y 6 cm
a los cuatro das de crecimiento. El micelio areo es menos algodonoso que

enPDA, el colo r del mismo varadesde entre blancoyamar illo. convirtindose


con el tiempo en un naran japlido . El reverso tomaunacol oracin amarillo
intenso o rosa(Figura3)
Los macroconidios normalmente tienen 5 septos (aunque podemos en
co ntrar de 3, 4, 6, 7Y8 septos): 3 sepias 26-36 x 4-6 pm; 4 sep ias 30-46 x
5-7um; 5sepias: 34-50x5-7urn Clamidosporas: 10-14 x9 - 1 2 ~m (Figura4).

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