Universidad Autónoma Del Estado de Hidalgo

ÁREA ACADEMICA DE QUÍMICA

LICENCIATURA EN QUÍMICA DE ALIMENTOS

ASIGNATURA: BIOMOLÉCULAS Y SU METABOLISMO

Dr. JAVIER AÑORVE MORGA

PRACTICA 10: Cuantificación de la actividad enzimática de la

fosfatasa ácida en una muestra biológica.

 Montaño Dávila Marian

 López Ibarra Pamela
 Flores González Amaranta
 Lechuga Bello Erika Graciela
 Rodríguez Luna Karen Beatriz
Equipo 4

Fecha: 23 de Octubre del 2019

INTRODUCCIÓN
Las fosfatasas ácidas se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo,
siendo particularmente altas las cantidades de estas enzimas en próstata, estómago,
hígado, músculo, bazo, eritrocitos y plaquetas. Las distintas isoenzimas se diferencian entre
sí por su pH óptimo, peso molecular, y requerimientos de activadores e inhibidores. La
fosfatasa ácida prostática (PAP) constituye un valioso auxiliar en el diagnóstico precoz de
cáncer prostático, una de las formas neoplásicas de mayor morbilidad. La determinación de
la actividad enzimática de PAP usando α-naftil fosfato como sustrato ha mostrado
sensibilidad y especificidad adecuadas para su utilización en el diagnóstico de esta
enfermedad. Se encuentran actividades elevadas de Fosfatasa ácida total (ACP) en algunas
enfermedades hematológicas (leucemia mielocítica, trombocitopenia idiopática) y óseas
(enfermedad de Paget, carcinoma óseo), así como en algunos tipos de cáncer,
enfermedades hepáticas (hepatitis, ictericia obstructiva), etc (Hillmann, G.Z).
La fosfatasa ácida (ACP EC 3.1.3.2.) hidroliza el α-naftil fosfato a pH 5,2 con liberación de
fosfato y α-naftol. El naftol reacciona a su vez con un diazorreactivo presente en el sistema
(Fast Red TR) produciendo un pigmento amarillo, de modo que el aumento de la
absorbancia, leído a 405 nm, es proporcional a la actividad de fosfatasa ácida total (ACP) de
la muestra. Cuando se mide la actividad en presencia de tartrato, se inhibe la actividad de
la isoenzima prostática. La diferencia entre las actividades de fosfatasa ácida total (ACP) y
de la resistente al tartrato (Fosfatasa Acida no Prostática/ ACP-NP) corresponde a la fracción
prostática (PAP) (Hillmann, G.Z).

OBJETIVOS
 Cuantificar la actividad de una fosfatasa ácida en un extracto hepático.
RESUMEN
Se hizo una recta de calibrado con 8 tubos con p-nitrofenol, H₂O y NaOH a diferentes
mediciones. Se leyeron a 420 nm, se ajustó a cero con el blanco.
Se prepararon dos tubos, un tubo (B) con 0.8 ml de tampón citrato y 0.2 ml de la muestra
de hígado. El segundo tubo (1) se le adiciono 0.2 ml de la muestra y 0.8 ml de p-NFP. Se
incubaron durante 20 minutos en un baño maría a 30°C.
Pasando ese tiempo, se le adiciono 5 ml de NaOH. El tubo 1 que obtuvo un color amarillo
concentrado se diluyo con 40 ml de agua. Se leyeron ambas muestras de los tubos a 420
nm.

RESULTADOS

Curva de calibrado
0.9

0.8

0.7

0.6

0.5
Abs

0.4
y = 1.4955x + 0.0047
0.3 R² = 0.9414

0.2

0.1

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Concentración

R=0.9414 La actividad de la enzima de la fosfatasa

Y=mx+b acida presente en el hígado de pollo es de
0.6597−0.0047
b=0.0047 X= 0.5Ul/ml
X=y-b/m 1.31
m=1.31 𝑥 =0.5Ul/ml
y=0.6597
DISCUSIÓN

Se realizaron las soluciones patrón para poder hacer un comparativo físico (visual) con las
dos muestras problemas. La primera prueba de p-NFP (sustrato) con muestra de hígado de
pollo y la segunda prueba es de tampón citrato con muestra de hígado de pollo. Dicho
comparativo se puede hacer al observar la coloración de todas las soluciones pues debe
tener un color amarillento claro.

Posteriormente se realizó la lectura de las absorbancias de las soluciones patrón a 420 nm

posteriormente se lleva a cabo la lectura de las dos muestras problema. Con los datos
obtenidos se puedo hacer la gráfica que se muestra en los resultados.

Así pues, mostrando la actividad enzimática de la fosfatasa ácida que es liberada en las
diferentes soluciones.

Como menciona Aparicio R. L (2015) se puede realizar la determinación de la actividad de

la fosfatasa midiendo la concentración no absorbancia de p-nitrofenol liberado por acción
del enzima durante un período de tiempo determinado, en las condiciones de ensayo
empleadas.

Como menciona Aparicio R. L (2015) El p-nitrofenol posee un color amarillo característico

en disolución alcalina, con un máximo de absorbancia a 400 nm. No obstante, la
determinación se hará a 430 nm para evitar interferencias por parte del sustrato, que
también absorbe luz de 400 nm de longitud de onda.

CONCLUSIÓN
Con los resultados obtenidos al finalizar con la práctica pudimos observa la actividad de una
fosfatasa ácida en un extracto hepático presente en el hígado, y con la curva de calibrado
pudimos notar cual fue el nivel de absorbancia en el hígado.

BIBLIOGRAFÍA
 Hillmann, G.Z. - Klin. Chem. Klin. Biochem. 9:273 (1971).