AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE BACILLUS

La implementación de nuevas técnicas moleculares como el análisis de secuencias de genes ha

contribuido al fortalecimiento de la taxonomía y la instauración de nuevos taxas donde ubicar los
microorganismos, en este sentido, la comparación de secuencias del gen que codifica para la
subunidad 16S es la base de la sistemática microbiana.

En la actualidad para la caracterización e identificación de microorganismos se usan varios métodos,

entre los cuales se destacan los métodos clásicos que utilizan como criterios de diferenciación los
caracteres fenotípicos tales como: morfológicos y fisiológicos los cuales se enuncian en el Manual
de Clasificación Bergey’s.

Para el caso de Bacillus spp., con el análisis del fenotipo se admite ubicarlo dentro del género
Bacillus, no obstante, en ocasiones no resulta suficiente para una determinación robusta . En
consecuencia, se acuden a técnicas más sofisticadas, como los ensayos moleculares basados en el
análisis del genotipo de los microorganismos. La determinación de la composición de bases del ácido
desoxirribonucleico, el estudio de hibridación de ácidos nucleicos y la secuenciación de ácidos
nucleicos son tecnicas de análisis que se pueden realizar sobre ácidos nucleicos para una
caracterización del genotipo

Actualmente ha tomado gran popularidad el empleo de paneles con pruebas bioquímicas como API
50CHB para Bacillus, porque facilitan la caracterización fácil y rápida de la fisiología de estos
microorganismos, además de permitir caracterizar el catabolismo de los aislados, y en la mayoría de
los casos la identificación hasta especie con precisiones del orden del 76-97%

En la presente practica de laboratorio se emplearan pruebas bioquímicas convencionales de uso

rutinario en los laboratorios para caracterizar diferentes grupos de bacterias, en esta oportunidad
se emplearán para caracterizar Bacillus sp. Los resultados se compararan con el perfil de otras
bacterias del género Bacillus obtenido de literatura especializada

OBJETIVOS: Aislar y caracterizar bacterias del género Bacillus de muestras de suelo.

A. PROCEDIMIENTOS GENERALES (PRIMERA JORNADA DE LABORATORIO)

1. Pese 10 gramos de muestra de suelo dilúyalos con 90 ml de agua destilada estéril y someta
la preparación a calentamiento en baño maría a 60 grados centígrados durante 15 minutos.

2. En tubos de ensayo con 9 ml de agua estéril, prepare diluciones seriadas hasta 10-8

3. De las diluciones pares siembre por profundidad en cajas Petri estériles con agar Plate
count.

4. Incube durante 48 horas y describa las colonias, y seleccione tres colonias diferentes.

5. Prepare laminas portaobjetos para observar al microscopio, La preparación debe ser teñida
con tinción Gram.
 6. Si la morfología microscópica coincide con la del género Bacillus conserve la colonia en
tubos con agar Plate count inclinado. Durante 8 días (dos tubos por colonia).

7. Realice una preparación en lámina portaobjetos para observación de espora, tiña con verde
de malaquita.

8. Observe localización de la espora, (terminal, central o sub-terminal)

B. CARACTERIZACION BIOQUIMICA (SEGUNDA JORNADA DE LABORATORIO)

1. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO Y GAS A PARTIR DE GLUCOSA

Para las dos pruebas se utilizará el mismo medio de cultivo I

Preparación
Peptona 0,5 g
PO4H2K 0,5 g
Glucosa 0,5 g
H2O destilada 100 ml

Se distribuye a razón de 5 ml por tubo. Se Introduce un tubo Durham invertido, Esterilizar en

autoclave y conservar bajo refrigeración hasta el momento de su empleo.

Con asa estéril transfiera una muestra de colonia en el tubo con el medio I incube durante 48 horas

Lectura gas: presencia de gas en la campana Durham Positivo (+)

Lectura Acidez:

Se toman de 0,5 a 1 ml de cultivo en caldo con desarrollo de 48 h.s. y se agrega una gota de reactivo
Rojo de metilo.

Rojo positivo (+), Amarillo negativo (-)

Reactivo rojo de metilo (indicador de ácido)

Disolver 0,1 g de rojo de metilo en 300 ml de alcohol etílico.

Agregar 200 ml de agua destilada a la mezcla alcohol-indicador.

2. PRODUCCIÓN DE ACETOÍNA A PARTIR DE GLUCOSA

Algunas bacterias pueden fermentar la glucosa por la VIA ACIDA MIXTA con producción de
metabolitos como ácido láctico, fórmico y succínico, los cuales van a hacer descender el pH inicial
del medio de 6.9 a 4.2, o también productos neutros como el ACETIL METIL CARBINOL (ACETOINA).
Estas diferencias metabólicas se pueden detectar al agregar el indicador de pH ROJO DE METILO, el
cual a pH ácido vira a un color rojo. La adición de alfa naftol y KOH evidencian la formación de
productos finales neutros los cuales se forman por la vía BUTILEN GLICOLICA

Preparación del Medio II

Resuspender 17, g de caldo RMVP en un litro de agua, llevara ebullición y distribuir en tubos de
ensayo a razón de 5 ml por tubo. (uno por colonia). Esterilizar en autoclave.

Con asa estéril transfiera una muestra de colonia en el tubo con el medio II, (Caldo RV-VP).

Al tubo VP agregar 10 gotas de KOH al 40% y 5 gotas de ALFA NAFTOL al 5%, mezclar fuerte después
de la adición de cada reactivo, esperar 15 minutos y leer, la aparición de un color rojo indica una
prueba de VP POSITIVA, la aparición de un color amarillo o café indica una prueba de VP NEGATIVA.

Reactivos;

KOH al 40% (recién preparado)

ALFA NAFTOL

Alfa Naftol 5g
Alcohol etílico al 95% 100ml

3. PRUBA DE LA CATALASA

La enzima catalasa se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas

que contienen citocromos. Por lo general, los organismos que no poseen el sistema de citocromos,
carecen también de la enzima catalasa. Esta enzima descompone el peróxido de hidrógeno en O2 y
H2O. Químicamente es una hemoproteína, de estructura similar a la hemoglobina, salvo que los
cuatro átomos de Fe se encuentran en estado oxidado (Fe+++) en vez de reducido (Fe++). El
peróxido de hidrógeno se forma como un producto final oxidativo de la descomposición aeróbica
de los azúcares. Las oxidaciones de flavoproteínas por O2 conducen a la formación de peróxidos
cuya acumulación es tóxica para las bacterias provocando su muerte.

Reactivos:

Peróxido de hidrógeno al 3%.

Mantener en frasco color ambar y refrigerado.

Técnicas:
Técnicas del portaobjeto:
Con palillo de madera transferir bacterias de uno de los tubos de conservación al centro de una
colonia bien aislada a la superficie de un portaobjeto limpio.

Añadir 1 o 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3%.

Método en tubo o en placa de agar: Añadir unas gotas del peróxido diluido al 3%, directamente
sobre la superficie del desarrollo del pico de flauta o placa.

Interpretación del resultado: La rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas (O2) se
considera una reacción positiva.

4. PRUEBA DE REDUCCIÓN DE NITRATO:

La reducción de nitrato a nitrito y a gas nitrógeno tiene lugar generalmente en condiciones

anaeróbicas, en las cuales un organismo utiliza nitrato como aceptor de electrones. El nitrato actúa
como el oxidante final en los sistemas citocromo. La reducción de NO3 - a NO2 - se evidencia por el
agregado de reactivos A y B de Peter Griess.

Preparación del medio de cultivo

Caldo nutritivo suplementado al 1% con KNO3

Reactivo A:

Alfa-naftil amina 0,5 g

Ácido acético 5N 100 m

Reactivo B:

Ac. sulfanílico 0,8 g

Ac. acético 5N 100 ml

Agregar directamente al medio de cultivo con 1% de nitrato (previamente inoculado e incubado a

37ºC) 1 ml de reactivo A y luego 1 ml de reactivo B.

La reducción de NO3 a NO2 está indicada por la aparición de color rojo intenso cuando el nitrito
reacciona con el ácido sulfanílico y el alfa naftilamina formando el p-sulfobenceno-azo alfa naftil
amina (sal diazóica).

5. HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN

El almidón es un homopolisacárido, formado por muchos monómeros de alfa-Dglucosa. La

estructura básica del almidón es una mezcla de 2 moléculas de polisacáridos poliglucosa: la amilosa
que es lineal y forma una estructura helicoidal enrollada, que es la responsable del color azul que
se produce frente al reactivo iodado, forma entre un 10 a un 20 % del almidón. La otra molécula es
la amilopectina que es mayor que la amilosa y está muy ramificada, se encuentra entre un 80 a un
90%. La hidrólisis de la amilopectina produce dextrinas que conforman una serie de moléculas de
almidón parcialmente digeridas, son moléculas grandes que constan de un número pequeño de
polímeros de glucosa. Las dextrinas sufren degradación más o menos completa a maltosa y a una
pequeña cantidad de glucosa.

Preparación del Medio

Peptona 5 g
Extracto de carne 3g
NaCl 5g
Agar. 15 g (según especificaciones del fabricante)
Agua destilada. 1000 ml

Pesar las cantidades y disolverlas en 500 ml de agua destilada. Calentar hasta disolución. Agregar al
medio 1% de almidón soluble disuelto en 250 ml de agua destilada.

Mezclar todo y llevar a 1000 ml. No debe hervir en exceso, ya que el sobre calentamiento puede
hidrolizar al almidón. Se distribuye en placas y se siembra en estrías un cultivo puro de 18-24 hs.

Lectura:

Se utiliza la solución iodada del Gram. Se adiciona unas gotas de solución iodada sobre la siembra
cultivada en el medio base de almidón. La amilosa y la amilopectina se comportan diferente frente
al Iodo. La amilosa se combina más fuertemente con el Iodo que la amilopectina y produce un color
azul intenso. El color puede variar hacia el purpura y al incoloro si el almidón ha sido hidrolizado. La
amilopectina da un color rojo con el Iodo ya que no se une efectivamente y puede virar hacia el
incoloro si se encuentran presentes acrodextrinas.

Reactivo Solución iodada del Gram

6. HIDRÓLISIS DE GELATINA

Las proteínas que se producen naturalmente son demasiado grandes para entrar en una célula
bacteriana; por lo tanto, para que una célula utilice las prteínas, primero deben ser catabolizadas
en componentes más pequeños. Las enzimas exocelulares de tipo proteolítico, gelatinasas, son
secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las proteínas y este proceso se realiza en dos
etapas primero a péptidos y luego a aminoácidos.

Preparación Medio de Cultivo:

Extracto de carne 3 g
Peptona 5 g
Gelatina 120 g
Agua destilada 1000 ml

El medio estéril se distribuye 3 a 4 ml en cada tubo en columna y se inocula por punción un cultivo
de 24 hs. La incubación puede ser prolongada.
Interpretación:

Prueba positiva: Se licúa el medio.

Prueba negativa: El medio permanece sólido.

7. UTILIZACION DE CITRATO

En la mayoría de las bacterias el metabolismo del citrato es rápido a través del ciclo del ácido
tricarboxílico o el ciclo de la fermentación del citrato. El desdoblamiento del citrato comprende el
sistema enzimático de la citritasa (citrato oxalacetato-liasa) o citrato desmolasa. La enzima requiere
de un catión bivalente para activarse, se utiliza el magnesio incluido al medio como sulfato de
magnesio.

Los organismos capaces de usar citrato como única fuente de carbono utilizan también las sales de
amonio como única fuente de nitrógeno. Estas sales se desdoblan en NH3, dando alcalinidad,
virando el indicador (azul de bromotimol) hacia el azul. La degradación del piruvato, formado a partir
del oxalacetato, depende del pH del medio. En medio alcalino se degrada a formato y acetato.

Preparación Medio de cultivo:

Sulfato de magnesio 0,2 g

Monofosfato de amonio (PO4H2) NH4 1 g
Fosfato dipotásico. 1g
Citrato de sodio 2g
Cloruro de sodio 5g
Agar 15 g (según especificaciones del fabricante)
Azul de bromotimol 0,08 g (solución alcohólica al 1,5%)
Agua destilada 1000 ml

O se puede emplear Agar Simmon Citrato según especificaciones del fabricante

El medio una vez esterilizado, se lo fracciona en tubos en pico de flauta. Se siembra el medio por
estrías, utilizando una cepa de 18-24 hs. Se incuba a 37ºC durante 24 a 48 hs.

Interpretación

Coloración azul con crecimiento. Positivo (+)

Coloración verde sin crecimiento: Negativo (-)

8. CRECIMIENTO EN NaCL AL 7%.

Prepare caldo nutritivo suplementado con Nacl al 7% distribuya en tubos a razón de 5 ml por tubo,
esterilice en autoclave siembre con aza estéril e incube a 37 grados centígrados.

9 y 10. CRECIMIENTO A 45 °C Y CRECIMIENTO A 55°C.

Prepare caldo nutritivo distribuya en tubos a razón de 5 ml por tubo, esterilice en autoclave.

Siembre con aza estéril e incube un tubo a 45OC y el otro a 55OC

C. ANALISIS DE RESULTADOS (TERCERA JORNADA DE LABORATORIO)

Compare sus datos con los de la tabla 1 según los procedimientos explicados previamente.

D. MATERIALES (Primera jornada, Alirio)

5 muestras de suelos de diferente procedencia

10 mecheros de gas

5 matraces con 90 ml de agua destilada estéril

35 tubos de ensayo con 9 ml de agua destilada estéril

20 cajas estériles para el aislamiento (4 por grupo)

15 tubos de ensayo tapas rosca para preservación de colonias (3 por grupo)

40 Pipetas de transferencia de 10 ml (8 por grupo)*

 * ó pipetas automáticas de 1000 ul y puntas azules (un juego por grupo total 5 juegos)

5 microscopios para segunda jornada.

E. MATERIALES PARA MEDIOS DE CULTIVO (Primera Jornada de laboratorio-Alirio)

15 tubos Durham (3 por grupo).

15 Tubos de ensayo con medio de cultivo producción de ácido y gas a partir de glucosa (3 por grupo)

15 tubos de ensayo vacíos producción de ácido a partir de glucosa (3 por grupo)

15 Tubos de ensayo para el medio de cultivo RMVP (3 por grupo)

15 portaobjetos para prueba de catalasa (3 por grupo)

15 tubos de ensayo para Caldo nutritivo suplementado al 1% con KNO3 (3 por grupo)

1 erlenmeyer de 500 ml para medio de cultivo hidrólisis del almidón

15 cajas Petri estériles para medio de cultivo hidrolisis del almidón (5 por grupo)

1 erlenmeyer de 500 ml para medio de cultivo hidrolisis de gelatina

15 cajas Petri estériles para medio de cultivo hidrolisis de gelatina (5 por grupo)

1 erlenmeyer de 250 ml para preparación medio de citrato

15 tubos para preparación medio de citrato (3 por grupo)

15 tubos de ensayo para caldo nutritivo suplementado con Nacl al 7% (3 por grupo)

15 tubos de ensayo para caldo nutritivo crecimiento a 45 °C (3 por grupo)

15 tubos de ensayo para caldo nutritivo crecimiento a 55 °C (3 por grupo)

Pipetas para cada uno de los reactivos

5 goteros

REACTIVOS (Tercera jornada de Laboratorio-Alirio)

1 Reactivo rojo de metilo (indicador de ácido)

Disolver 0,1 g de rojo de metilo en 300 ml de alcohol etílico.
Agregar 200 ml de agua destilada a la mezcla alcohol-indicador.

2 KOH al 40% (recién preparado)

3 Peróxido de hidrógeno al 3%.
4 Reactivo Solución iodada del Gram
5 KNO3

6 ALFA NAFTOL
Alfa Naftol 5g
Alcohol etílico al 95% 100ml

7 Reactivo A de Gries:
Alfa-naftil amina 0,5 g
Ácido acético 5N 100 m

8 Reactivo B de Gries:
Ac. sulfanílico 0,8 g
Ac. acético 5N 100 ml

LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO (PRIMERA JORNADA D ELABORATORIO)

PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SE DISTIBUYEN DE LA SIGUIENTE FORMA:

Grupo 1: PRODUCCIÓN DE ÁCIDO Y GAS A PARTIR DE GLUCOSA

Grupo 2: PRODUCCIÓN DE ACETOÍNA A PARTIR DE GLUCOSA
Grupo 3 PRUEBA DE REDUCCIÓN DE NITRATO
Grupo 4 UTILIZACION DE CITRATO y CRECIMIENTO A 45 °C
Grupo 5 CRECIMIENTO EN NaCL AL 7%. CRECIMIENTO A 55°C
Alirio: HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN, E HIDRÓLISIS DE GELATINA
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS PARA LA PRIMERA JORNADA DE LABORATORIO (ESTUDIANTES)

Agua destilada
Agar Plate count.
Tinción Gram.
Peptona
PO4H2K
Glucosa
Tubos Durham
Caldo RMVP
Caldo nutritivo
KNO3
Peptona bacteriológica
Extracto de carne
NaCl
Agar Agar
Agar Simmon Citrato