TEMA 2.- TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE DNA.

 99,99% de la secuencia de ADN es idéntica entre individuos

 SÓLO el 0,01 % de la secuencia de ADN es diferente entre dos individuos

EL MISMO GEN CON UNA SECUENCIA DISTINTA PUEDE

ORIGINAR PROTEÍNAS DISTINTAS

ATCGGCATACGTTAGCCGG
PROTEINAS
DIFERENTES

ATCGGCATGCGTTAGCCGG

¿FUNCIONES BIOLÓGICAS DIFERENTES?

ENFERMEDAD VARIABILIDAD
Enfermedades como el albinismo… mutación en el gen de la Tirosinasa (TYR)

Copito de Nieve
o simplemente variabilidad…sin enfermedad
 Si estudiamos el ADN, podemos detectar las diferencias entre
individuos e identificarlos de forma inequívoca

DOS IDEAS FUNDAMENTALES:

 Los animales presentan diferencias en su ADN,
a excepción de los gemelos monocigóticos o los clones.
 La información genética contenida en las células es igual en
todas las partes del cuerpo del animal y no varía con el tiempo

ANALIZANDO EL DNA PODEMOS IDENTIFICAR LOS INDIVIDUOS

BASÁNDONOS EN LAS DIFERENCIAS EXISTENTES EN SU SECUENCIA
 TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE DNA

I.-Tecnología del DNA recombinante

II.- Herramientas básicas para el análisis y modificación del

DNA

III.- Marcadores moleculares aplicados a la identificación

genética
 I.TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

1973 - Berg, Boyer y Cohen – Primeros experimentos de DNA recombinante

con los que introducen Genes en E.coli

CLONACIÓN

Unión artificial de DNA

de distintos orígenes

VECTOR + FRAGMENTO DE DNA

 II. HERRAMIENTAS BÁSICAS NECESARIAS PARA EL
CONOCIMIENTO Y MODIFICACIÓN DEL DNA

1 - ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

2 – SECUENCIACIÓN

3 – PCR

4 - MARCADORES MOLECULARES
 1.- ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
- Nucleasa sintetizada por las bacterias como un
mecanismo de defensa natural

- Nucleasa capaz de reconocer y cortar una secuencia

específica de nucleótidos en una doble cadena

- Longitud de la secuencia reconocida de 4 a 8

- Reconocen secuencias palindrómicas y el corte es

simetrico
AAGCTT
TTCGAA

Primera enzima descubierta fue a partir de Haemophilus

influenzae
 PUEDEN CORTAR DE DOS FORMAS:

EXTREMOS COHESIVOS

EXTREMOS ROMOS
 Utilizacion: Clonación de genes
PRIMER PASO: cortar DNA que se quiere clonar y el vector que se va a
utilizar con enzimas de restricción
GEN PLÁSMIDO
(otro tipo de vector)

SEGUNDO PASO: LIGACIÓN. Mediante un enzima denominado ligasa se unen el

vector y el fragmento de DNA

+ MOLÉCULA DE DNA
RECOMBINANTE

TERCER PASO: Introducción de la molécula de DNA recombinante en las células

procariotas o eucariotas correspondientes para la obtención de numerosas copias
 2.- SECUENCIACIÓN
BASADA EN METODO DE SANGER (1977)

1 aagtaccaga aaatgagctc agtatatatg attgtttacc tccatcttca cctgataaag

61 aaccagaata atagatccat tcattgatgc agtgctcaga gagactgaat ctcgatgaat
121 cttgaatgag ttttttaaat attgttatat atttaattac cactgagcca ataatacgca
181 acatgcacta aaatatccaa ttcaataatt ttatacacgc aaaaaatatc tttaattttc
3.- PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

HASTA AHORA HEMOS HABLADO DE CLONAR DNA… existe otra

forma de “clonación de DNA”

PCR ¿Qué es?

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

FORMA DE CLONACIÓN “ IN VITRO”

FOTOCOPIADORA MOLECULAR

Técnica que nos permite amplificar o clonar

selectivamente un segmento específico de DNA, hasta
obtener una cantidad suficiente para su posterior
manipulación
 ¿Cuáles son los fundamentos?
EXTENSIÓN DEL CEBADOR: La DNA polimerasa realiza la extensión
del primer utilizando la cadena complementaria como molde

DNA Polimerasa

3’ 5’

dTTP
dNTPs
dATP
+ Mg ++
dGTP
dCTP

5’ 3’
 EXTENSION DEL CEBADOR

Utilizando dos cebadores que son complementarios a los

extremos 3’ del fragmento de DNA de doble cadena que
queremos amplificar

5’ 3’

DNA polimerasa

DNA Polimerasa

3’ 5’
 REPETICIÓN “n” VECES DE UN CICLO
CONSTITUIDO POR TRES ETAPAS

DESNATURALIZACIÓN C
i
c
l
HIBRIDACIÓN DE
LOS CEBADORES
o
1

EXTENSIÓN
“n CICLOS”: ciclo 3
“n CICLOS”: ciclo 5
La cantidad de DNA dobla teóricamente con
cada ciclo de PCR, Después de cada ciclo, la
cantidad de DNA es dos veces la del ciclo
anterior.

Después de:
- 2 ciclos tenemos 2 x 2
- 3 ciclos - 2 x 2 x 2
- 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2
Así, después de ciclos de N ciclos
tendremos 2N.

Pero la reacción no puede

mantenerse indefinidamente, se
alcanza una fase de meseta, según lo
demostrado en las cifras que
aparecen en rojo.
 4. MARCADORES MOLECULARES
Son fragmentos de DNA que sirven de referencia para seguir la
transmisión de un segmento de cromosoma, que manifiesta polimorfismo y
se hereda de forma mendeliana.

IDENTIFICACIÓN GENÉTICA

Patógenos

Test de paternidad Trazabilidad

Diagnóstico
Autentificación de productos de patologías
MARCADOR GENÉTICO

fragmento de DNA que por sus características nos permite hacer un

seguimiento de los individuos o sus productos.

De todas las características que son aconsejables para la elección de un marcador

para identificación genética hay cuatro que “deben” de cumplir:

-Ser polimórfico, de otra forma no sería informativo

-Ser neutral, sin ninguna ventaja selectiva

-Ser un locus simple, no estar localizado en varios sitios

del genoma

-Ser independiente, es decir no estar en el mismo

cromosoma que otros utilizados para ese fin
 Marcadores genéticos a nivel del DNA

DETECCIÓN DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA

• RFLPs : Polimorfismos tamaño de los fragmentos de restricción

• RAPDs : Random amplified polymorphic DNA

• Microsatélites: repeticiones de un pequeño número de bases

• SNPs . Single nucleotide polymorphisms

•…
Para su detección : amplificación por PCR
RFLPs : Polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción
_

Origen: mutaciones 199 pb

165 pb
delecciones
inserciones
reordenaciones
34 pb
+
Ampl. CC TT CT
_

1 2 3 4 5 6 7 8
 RAPDs (Random ampliflied polymorphic DNA)

• Se utilizan primers diseñados al azar.

• Generalmente de pequeño tamaño (10-12 nucleótidos)
• No es necesario el conocimiento previo de la secuencia
 Microsatélites

Secuencias del genoma que consisten en repeticiones de 1 a 6 pb.

TGLA227 TGLA126 ETH225 BM2113 TGLA122 BM1824 INRA23 ETH10 SPS115

TGLA 122

TGLA 126

TGLA 227
 SNPs (single nucleotide polymorphisms)

Son mutaciones, debidas a la variación de un nucleótido.

A C G A C A A C G T C A A C G A C A

A C G A C A A C G T C A A C G T C A

cerdo 1 cerdo 2 cerdo 3

AA TT AT

C/C

C/T