Porque un diagnostico

microbiológico?

•Para decisiones de tratamiento

–Ej. Casos clínicos, Terapia de secado
•Para identificar el tipo de mastitis
–Decisiones sobre actividades de gestión,
–programas de control, etc.
•Para controlar el estado de salud Ej. Comprar /
vender, decisiones de cría
 Diagnóstico microbiológico:
¿cómo se hace? Lineamientos

 NMC (Consejo Nacional de Mastitis)

 Manual de Laboratorio sobre Mastitis
Bovina, 1999
 Procedimientos microbiológicos para el
diagnóstico de la infección de ubre
bovina y determinación de la calidad
de la leche,2004
 Acreditación de laboratorio (EN17025)
 Diagnóstico microbiológico:
¿cómo se hace? Lineamientos

 Lineamientos incompletos.

 La técnica de cultivo
depende de los métodos
empleados.

 Las PCR no están incluidas.

 Se necesita actualizaciones.
Diagnóstico microbiológico:
Puntos a considerar
 Muestra de Leche.

 Almacenamiento y transporte de la muestra de leche.

 Investigación de crecimiento / presencia de microorganismos

- Laboratorio de campo veterinario frente a laboratorios
comerciales
- Cultivo frente a PCR

 Interpretación de los hallazgos: hacer un diagnóstico

microbiológico en el laboratorio

 Interpretación de los resultados: tomar una decisión en la

vaca / granja
Muestra de Leche
 Decisiones antes del muestreo

- ¿Cuarto / vaca / hato?

- Tipo de muestra? Cuarto o muestra compuesta?

• Pros y contras, cultivo / PCR ...

- ¿Qué vacas / cuartos para muestrear?

• Basado en propósito, historia, SCC ...

- ¿Cuándo muestrear?
• En relación con el ordeño, durante el ciclo de lactación ...

 El objetivo de la investigación decide qué camino tomar

Muestreo de leche: nivel de vaca
Cuarto versus composito muestras
 muestras de cuartos = patrón oro

- Más fácil de muestrear asépticamente

- Da la mejor imagen de la concentración

bacteriana en la ocasión de muestreo

 • La concentración bacteriana varía

Muestreo de leche: nivel de vaca
Cuarto versus composito muestras

Muestra compuesta de vaca =

- Mayor riesgo de contaminación

- Efecto de dilución
Toma de muestras individual
Muestreo de leche: composito de
muestras
- muestreo manual frente a muestreador de
ordeño
Manual A través del equipo de ordeño
"La misma rutina que el muestreo (PCR)
de cuarto = asepsis, pero  Fácil de hacer
recolecta leche de todos los  Riesgos
cuartos en el mismo tubo - No aséptico
- Contaminación de la piel y el
• Riesgos equipo
 Debe abrir el tubo varias veces - Riesgo de traspaso entre
= <riesgo de contaminación vacas
 Dificultad para obtener la  Efecto de dilución
misma cantidad de todos - Los cuartos subclínicos tienen
cuartos menor producción
 Dificultad de mezclar
adecuadamente
Toma de muestras compuesta
Muestreo de leche: muestreo compuesto de
un grupo de vacas o del hato
 Grupo de vacas
- Pool de muestras tomadas manualmente
- Riesgos
• Debe abrir el tubo varias veces -
contaminación
• Puede ser difícil obtener la misma cantidad de
leche de todas las vacas
• Puede ser difícil mezclar bien
• Dilución

 Hato
- Muestra de leche a granel del conjunto o partes
del hato
- Riesgos
• La muestra siempre está contaminada por
varias fuentes
• Dilución de leche de vacas con mastitis
subclínica
• NO Todas las vacas están en el tanque
Muestreo total del hato
■Determinar prevalencia de los
patógenos de mastitis

■Programas de erradicación de
Streptococcus agalactiae.

■Programas de segregación de
Staphylococcus aureus
 PRUEBAS DE CAMPO

Indicadores de pH

Aumento de conductividad

Aumento de celularidad

Prueba de Wisconsin
Prueba de Mastitis California CMT
Recuento de Células Somáticas
 INDICADORES DE PH

pH Leche Normal 6.6 a 6.8

Leche con Mastitis: pH

alcalino

Baja Sensibilidad

Incluido en CMT
CONDUCTIVIDAD
Fácil y económica
Baja sensibilidad
Falsos positivos final de la lactancia
Screening
PRUEBA DE CALIFORNIA MASTITIS CMT

Muy sensible

Falsos Positivos
al Final Lactancia

Económica

Fácil Manejo

Universal
MUESTRA
La cantidad de leche

debe ser igual

en los cuatro pozos

Igual cantidad

reactivo
leche

Lauril Sulfato de Sodio

+
DNA celular

Viscosidad
LECTURA

15 a 20 segundos
 GRADO TIPO DE
CELULARIDAD/ mL
REACCION

< 200.000
Mezcla se
Negativo mantiene liquida
ligera viscosidad
Trazas 200.000 - 500.000
Mezcla viscosa no
400.000 -1.500.000
1 adherida al fondo
Mezcla viscosa que
se adhiere al fondo
2 800.000 - 5.000.000
Mezcla muy viscosa
fuertemente
3 adherida que forma
> 5.000.000
un solo grumo.
PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO

Recuento de Células Somáticas

Microscópico
Automatizado

Cultivo Bacteriológico
Aislamiento
Caracterización

Antibiograma
RECUENTO
MICROSCOPICO
Calcular Factor Microscópico

Área del extendido : 1 cm2

Muestra de leche : 10 uL

Contar y Promediar No. De Células en 10 campos

Promedio x Factor Microsc = Células/ mL

Recuento Automatizado
Análisis de Flujo de CCS
Contribución de
Vacasindividuales
* Nuevas Crónicas Frescas
Top <5% <5% <10%
Ok ~8% ~8% ~15%
Pocas (<2%) Más de 2%
No ok 10+% 10+% 20+%
Responsables de De vacas son
Altas cuentas responsables

Crónica vspicos Nuevas infecciones InfeccionesCrónicas Infecciones en Frescas

>8%* >8%* >15%*
Segregar
Picos
Cultivo Analizar: PatronesCCS: Alta - baja - alta Analizar:
Tratamiento Vaq vsvacas Vaq vsVacas Crónica alta Vaq vsvacas
Secado
Rechazo Terapia vaca seca
Higiene
Procedimientos ordeño Cultivo Vacas Higiene de secas
Compra de reemplazos Altas CCSCronicas Minerales
Segregacion Estacionalidad
Dias en leche / Secado Vaquillonas
Estacionalidad Segregar Rechazar Tratar ManejoTransicion
Efecto del tambo
Ynte H.Schukken, Secado Lactancia
Periodo
Frank Welcome,
LindaTikofsky,
LACTANCIA SECO 34
Diagnóstico
Bacteriológico
Contagiosos o ambientales?

Contagiosos Ambientales

Staphylococcus aureus Streptococcus (no

agalactiae)

Streptococcus Coliformes
agalactiae

Mycoplasma SCN

Algunas cepas de Protothecas,

Strep. dysgalactiaey Arcanobacterium pyogenes,
uberis levaduras
2
9
Pruebas bacteriológicas
de campo
Desempeño de las pruebas
diagnósticas
Validez de las pruebas
■ Habilidad para distinguir entre los
individuos que poseen un enfermedad
de aquellos que no la poseen.
■ Sensibilidad (Se)
■ Especificidad (Sp)
Validez de las pruebas
■Sensibilidad (Se)
Habilidad de un test para identificar
correctamente aquellos individuos que poseen la
enfermedad (enfermos)
■ Especificidad (Sp)
Habilidad de un test para identificar
correctamente aquellos individuos que no poseen
la enfermedad (sanos)
Prueba PCR
• Pruebas multiplex en
tiempo real de PCR
comercial

• Identificación de
ADN
- ciertos patógenos de
la ubre
- En algunas pruebas -
gen blaZ = producción
de β-lactamasa
PCR - ¿Cómo funciona?
• Extracción de ADN
directamente de la
leche (350 μl)
• Mezcle el extracto de
ADN con soluciones de
PCR
• Amplificación de ADN
en 40 ciclos térmicos
- instrumento de PCR en
tiempo real
 Problemas con la
interpretación de los
resultados de PCR
• Staphylococci
- Si se detecta Staphylococcus spp, puede deberse a la presencia
de varias especies = contaminación
- Si se detecta el gen blaZ y Staphylococcus spp y / o S aureus, no
se puede decir qué especie es resistente
• Cuando se detectan varios patógenos en una muestra
- Difícil decidir si hay contaminación o no
• PCR detecta más muestras con presencia de bacterias que
cultivo
- Interpretación? ¿Muerto o vivo? ¿Verdadera infección /
contaminación?
• Basado en el conocimiento de hoy
- Si no se trata de muestras asépticas, la PCR se recomienda
principalmente en las investigaciones de rebaños de Str agalactiae
y Mycoplasma bovis
Pros y contras PCR vs
cultivo
 Pros,  Cons,
- Más rápido -Identifica una cantidad
-Puede detectar limitada de patógenos
cantidades más -Más caro
pequeñas de bacterias -No es posible guardar los
-Puede detectar aislamientos para otros
bacterias muertas e estudios, por ejemplo,
inhibidas del crecimiento resistencia a los
-Posible usar leche con antimicrobianos, genotipado
bronopol -Los resultados pueden ser
-Puede detectar difíciles de interpretar
Mycoplasma bovis (difícil
de cultivar)
Interpretación de los hallazgos
"haciendo un diagnóstico en
el laboratorio”

• Cultivo • PCR
- Sin crecimiento -Sin presencia
- Crecimiento de patógeno -Presencia de uno o más
• Cantidad (1-3) patogenos y / o blaZ
• En cultura pura ¢ Cantidad (+, ++, +++)
• En flora mixta ¢ valores Ct
- Contaminación -Contaminación?
Interpretación de los
resultados en la vaca /
rebaño
• Combina hallazgos microbiológicos con
información sobre
- Historial de vacas / rebaños, signos clínicos, SCC
- Muestreo y manejo de muestras
- Cultivo o PCR
• ¿Los resultados de laboratorio son verdaderos o
falsos?
Interpretación de los
resultados en la vaca /
rebaño
• Sincrecimiento / presencia de bacterias
- Cierto
• Ubre sana
• Mastitis no infecciosa
• Patógeno ya eliminado
- Falso
• El patógeno necesita condiciones de cultivo
especiales o no está incluido en el panel
• La concentración de patógenos en la leche es
demasiado baja
- ¿Tomar nueva muestra? ¿Qué tan bueno es una
muestra?
Interpretación de los
resultados en la vaca /
rebaño
• Crecimiento / presencia de un
patógeno

- Cierto
• mastitis infecciosa
• infección latente

- Falso
• Si está contaminado desde el inicio y
la muestra manejada / almacenada
subóptimamente puede resultar en un
crecimiento excesivo de una especie
Interpretación de los
resultados en la vaca /
rebaño
• Crecimiento / presencia de flora mixta /
contaminación
- Cultivo: si 3 o más especies = contaminación
• Excepción si S aureus o Str agalactiae son
claramente identificado
- PCR: ¿número de especies?
- Mala muestra o mala manipulación / transporte
- Resultado incierto - puede ocultar una infección
- ¡Toma una nueva muestra!
Desarrollos futuros y necesidades
 Nuevos métodos y comprensión de la
patogénesis

 Metodología dependientes del cultivo,

p. ej.
-Control de calidad (laboratorio de
campo / laboratorio comercial)
-Mejoras p. ej. MALDI-TOF
-Métodos moleculares rentables para la
diferenciación de aislamientos dentro de
las especies
 Métodos independientes de cultivo, por
ejemplo
-Mejoras de PCR
-Nuevas tecnicas para detectar
microorganismos en la leche
 Pruebas rápidas bacteriológicas al lado
de la vaca
Medidas para disminuir la tasa de nuevas infecciones

•Evitar el estrés de
los animales
Preguntas????