Caracterización de una nueva especie

de Lactobacillus estrechamente relacionada con Lactobacillus

johnsonii utilizando una combinación de métodos de genómica
molecular y comparativa.
Luz-Adriana Sarmiento-Rubiano , 1 Bernard Berger , 2 Déborah Moine , 2 Manuel Zúñiga , 1 Gaspar Pérez-
Martínez, 1 y María J Yebra 1

Varias especies que pertenecen al género Lactobacillus son autóctonas del tracto gastrointestinal
de humanos y animales [ 1 - 3 ]. Debido a su interés ecológico y comercial, se han concentrado
esfuerzos sustanciales en los últimos años para aislar e identificar nuevas cepas de
lactobacilos. Muchas de esas cepas pertenecen al complejo Lactobacillus acidophilus . El primer
estudio importante sobre este grupo que utiliza la hibridación de ADN-ADN definió dos grupos
principales de homología, A y B, con seis subgrupos [ 4 ], que luego se convirtieron en especies
distintas [ 5 ]. Las cepas del grupo A se clasificaron como la especie L.
acidophilus , Lactobacillus amylovorus ,Lactobacillus crispatus y Lactobacillus gallinarum , y
las cepas del grupo B se convirtieron en Lactobacillus gasseri y Lactobacillus
johnsonii [ 5]. Algunas cepas de L. acidophilus y L. johnsonii se comercializan como probióticos
y se han sometido a extensos estudios para inferir los mecanismos que gobiernan sus efectos
beneficiosos para la salud. L. acidophilus cepa NCFM aumentó la inmunogenicidad de una
vacuna oral contra el rotavirus humano en animales [ 6 ]. L. acidophilusla cepa Bar13 interfirió
con la adhesión de bacterias enteropatógenas a los enterocitos e inhibió la producción de IL-8
por las células HT-29, lo que sugiere un potencial para proteger las células intestinales de la
respuesta inflamatoria aguda [ 7 ]. Se ha demostrado que L. johnsonii, cepa La1 (NCC533)
suprime la expresión génica de las citoquinas proinflamatorias, supuestamente involucradas en la
dermatitis atópica [ 8 , 9 ] y actúa como un inmunomodulador [ 10 - 12 ]. El genoma de la cepa
NCC533 de L. johnsonii se ha secuenciado [ 13 ] y ha permitido una serie de estudios destinados
a determinar los genes que se expresan in vivoy aquellos cuya expresión es específicamente
necesaria para una larga persistencia en el intestino [ 14 , 15 ].
El concepto de especie bacteriana ha sido ampliamente discutido [ 16 , 17 ], pero no se ha
alcanzado un consenso para establecer una definición regularmente aceptable. En el caso de los
patógenos procarióticos, las especies se identifican tradicionalmente sobre la base de la
enfermedad que causaron, independientemente de las consideraciones genéticas. Sin embargo,
para la gran mayoría de las bacterias, las características fenotípicas generalmente no son tan
precisas como la identificación basada en métodos genotípicos. La observación de que hay una
fracción de genes encontrados en genomas bacterianos compartidos por todos los miembros de
una especie y una fracción presente solo en un subconjunto de la población dio origen a la
hipótesis genómica central [ 18].]. Postula que existe un núcleo de genes responsables de
mantener una identidad de especie y genes auxiliares responsables de la transferencia de genes y
la adaptación de cepas al medio ambiente. La incorporación de datos moleculares permitidos
para afirmar que una especie bacteriana es "una categoría que circunscribe a un grupo
(preferiblemente) genómicamente coherente de aislados / cepas individuales que comparten un
alto grado de similitud en (muchas) características independientes, comparativamente probadas
en condiciones altamente estandarizadas" [ 19 ]. Esencialmente, una especie sería un grupo de
cepas con cierto nivel de consistencia fenotípica y mostrando tasas de reasociación de ADN-
ADN superiores al 70% [ 19]]. Sin embargo, este método de corte de variabilidad no siempre es
apropiado debido al hecho de que diferentes especies claramente reconocidas tienen un amplio
rango de variación genética. Dado que la secuenciación de ADN es hoy en día una técnica
accesible para la mayoría de los laboratorios, el análisis comparativo de secuencias del gen 16S
rRNA se ha utilizado ampliamente para la identificación de especies en nuevos aislados
[ 20 ]. El comité ad hoc para la reevaluación de la definición de especies en bacteriología
consideró la secuenciación de los genes de mantenimiento, los perfiles de ADN y las matrices de
ADN como métodos muy valiosos para la delineación de las especies y el posicionamiento
filogenético [ 19 ].
El grupo L. acidophilus constituye un paradigma de un grupo compacto que muestra especies
estrechamente relacionadas que ofrece dificultades especiales para la correcta asignación
taxonómica de nuevas cepas. Se han aplicado varias técnicas para identificar miembros del
grupo L. acidophilus , como la hibridación de la sonda de oligonucleótidos dirigida a 23S-rRNA
[ 21 ], la amplificación aleatoria de DNA polimórfico [ 22 , 23 ], el alineamiento de secuencias
de la región V1 del 16S rRNA gen codificante [ 24 ] y ribotyping automatizado
[ 25]. Recientemente, se han aplicado con éxito técnicas genómicas más complejas basadas en el
análisis de secuencias multilocus de cinco genes de mantenimiento y la hibridación comparativa
del genoma (CGH) utilizando microarreglos al complejo L. acidophilus [ 26 ]. Mostraron que L.
johnsonii , L. gasseri y L. acidophilus constituyen tres grupos genómicos claramente
independientes y consistentes, aunque L. gasseri estaba más estrechamente relacionado con L.
johnsoniique con L. acidophilus.. La variabilidad genómica bacteriana entre cepas que
pertenecen a la misma especie o entre especies estrechamente relacionadas proviene de
elementos móviles de ADN y de regiones variables. Lo último puede ser requerido para la
adaptación ambiental y podría ser adquirido por transferencia lateral de genes. El cromosoma L.
johnsonii NCC533 alberga tres regiones que contienen dos profagos, Lj928 y Lj965, y una
unidad potencialmente autónoma de 6 kb [ 27 , 28 ]. Estos elementos genéticos representan más
de la mitad del ADN específico de cepa identificado y se han estudiado exhaustivamente
[ 26 - 28 ]. L. johnsonii NCC533 también incluye cuatro integrasas más y varios elementos IS
que flanquean o interrumpen las regiones de diversidad [26 - 28 ].
Un trabajo previo que estudió la influencia de la ingesta de sorbitol en la población de
lactobacilos intestinales de rata mostró la presencia de cinco especies: L.
johnsonii , Lactobacillus intestinalis , Lactobacillus murinus , Lactobacillus
reuteri y Lactobacillus sp. BL263 (anteriormente nombrado como AD102) [ 29 ]. La ingestión
de sorbitol resultó en un incremento de L. reuteri y Lactobacillus sp. Números de células BL263
[ 29 ]. Aunque la cepa Lactobacillus sp. BL263 podría asignarse a la L. acidophilusGrupo, su
asignación de especies era todavía incierta. En el presente estudio, se han implementado métodos
taxonómicos estándar y análisis CGH basados en microarrays para la identificación y
caracterización de Lactobacillus sp. BL263 y cuatro aislamientos intestinales de rata adicionales
(BL301, BL302, BL303 y BL304) que muestran un patrón de PCR-DGGE idéntico.
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Los metodos

Cepas bacterianas, condiciones de cultivo, extracción de ADN.

Los Lactobacillus cepas utilizadas en este trabajo se enumeran en la Tabla Tabla11 y se
cultivaron en medio MRS (Difco) a 37 ° C durante 48 h en condiciones estáticas. El ADN
cromosómico se aisló como se describe anteriormente [ 30 ].
tabla 1
Lista de cepas utilizadas en este estudio.
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a
BL, Colección Cultura de nuestro laboratorio. Las cepas BL263, BL260, BL261, BL262 y BL259 fueron
nombradas previamente como AD102, AD38, AD99, AD100 y AD23, respectivamente [ 29 ].
b
CECT, La Colección Española de Cultivos Tipo; DSMZ, Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos
Celulares; NCC, Nestlé Culture Collection; ATCC, Colección Americana de Cultivos Tipo.
16S rRNA que codifica gen y secuencias de análisis multilocus
Los genes de mantenimiento seleccionados para el análisis de secuencias multilocus basados en
los resultados de estudios previos sobre especies de Lactobacillus [ 26 , 31 ] fueron la
recombinasa A ( recA ), fenilalanil-ARNt sintetasa ( pheS ), CTP sintetasa ( pyrG ) y el factor de
elongación de la traducción Tu ( tuf ). Las reacciones de PCR se realizaron con el Expand
System PCR Alta Fidelidad (Roche), utilizando el ADN cromosómico y los cebadores
enumerados en la tabla Tabla2.2. La secuenciación del ADN fue realizada por el Servicio Central
de Apoyo a la Investigación de la Universidad de Valencia (España) utilizando el método de
terminación de cadena de ADN Dideoxinucleótido. Se secuenciaron ambas cadenas de los
fragmentos de PCR. En el caso del gen recA , los fragmentos de PCR se clonaron en Escherichia
coliutilizando el vector pMOS Blue contenido en el kit de clonación de extremos romos (GE
Healthcare) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se aisló ADN plásmido de cada clon que
contenía una parte del gen recA de las cepas de Lactobacillus estudiadas
aquí. Los genes recA parciales se secuenciaron utilizando los cebadores universal e inverso M13.
Tabla 2
Análisis de secuencia multilocus

Análisis filogenético
Las secuencias se obtuvieron en este trabajo, se recuperaron de la base de datos GenBank o de
Ribosomal Database Project II (RDP) [ 32 ]. Se obtuvieron múltiples alineaciones utilizando
ClustalX [ 33 ]. Las posiciones de homología dudosa y los huecos se eliminaron mediante el uso
de Gblocks [ 34 ]. La reconstrucción filogenética se realizó con la máxima probabilidad
implementada en PHYML [ 35]] con el GTR, el modelo de sustitución en combinación con la
estimación de la relación de transición / transición maximizando la probabilidad de la filogenia,
y las estimaciones del conjunto de datos de la proporción de invariantes y el parámetro de forma
(alfa) de la distribución gamma para tener en cuenta Tasa de sustitución heterogeneidad entre
sitios. Los valores de soporte de Bootstrap se obtuvieron a través del análisis de 500
pseudoreplicados.

Caracterización fisiológica
Los patrones de fermentación de carbohidratos se determinaron utilizando el API 50 CH
(BioMérieux, SA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los resultados se registraron
después de 48 h a 37ºC. El crecimiento a 15 ° C, 45 ° C, pH 4.5 o en presencia de NaCl (4.5% y
7.0%) se determinó en caldo MRS (Difco). Todos los análisis de crecimiento se realizaron al
menos por duplicado. Los datos se analizaron utilizando el coeficiente de correlación de Pearson
(programa XLSTAT). Se creó un árbol mediante análisis de conglomerados utilizando el método
de grupos de pares no ponderados con promedios aritméticos (UPGMA).

Análisis PAGE de proteína de células enteras

Los cultivos se cultivaron en 10 ml de MRS a 37ºC hasta una OD 550 de 1.0. Las células se
recogieron por centrifugación, se lavaron con Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, se resuspendieron en 1
ml del mismo tampón más sacarosa 0,5 M y lisozima 2,5 mg / ml. Después de la incubación
durante 1 hora a 37ºC, las células se lavaron, se recogieron por centrifugación y se
resuspendieron en 50 µl de tampón de carga SDS-PAGE. Las células se lisaron a 100 ° C durante
5 min y se separaron 20 μl de extracto total en una SDS-PAGE al 12% utilizando protocolos
estándar [ 36]. Los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie. Para cada cepa, entre dos y
cuatro extractos independientes se realizaron y analizaron mediante SDS-PAGE. En los
resultados se muestra un análisis de PAGE representativo de cada cepa. Los datos se analizaron
utilizando el coeficiente de correlación de Pearson (BioNumerics 4.6 Applied Maths
Kortrijk). Se creó un árbol mediante análisis de conglomerados utilizando UPGMA.

Ensayos de hibridación ADN-ADN.

Se realizaron macro-matrices de ADN en membranas de nailon (Hybond N, Amersham
Biosciences) utilizando un ensayo de transferencia de puntos según Hänninen et al. [ 37 ] con
algunas modificaciones. Tres manchas alícuotas (160, 80 y 40 ng) de muestras de ADN
cromosómico desnaturalizado de 26 cepas de Lactobacillus fueron manchadas en membranas
duplicadas. Se prepararon seis sondas marcadas con digoxigenina mediante cebado aleatorio
utilizando el kit de etiquetado de ADN DIG (Roche) y el ADN genómico aislado de las cepas
tipo L. intestinalis , L. johnsonii , L. crispatus , L. gasseri , L. acidophilus o L. taiwanensis . Esas
sondas se hibridaron contra seis macroarreglos idénticos con 26Cepas de lactobacilos. La
hibridación, el lavado y la tinción se llevaron a cabo según lo recomendado por el fabricante
utilizando el sustrato quimioluminiscente CDP- Star (Roche). La quimioluminiscencia se detectó
en un sistema de imágenes Fujifilm LAS 1000 (Fuji Photo Film Co. Ltd.) y se midió utilizando
el programa Image Gauge versión 4.0. Los experimentos de hibridación ADN-ADN se
realizaron por triplicado.

Hibridación genómica comparativa en micromatrices.

Basándose en la secuencia del genoma de L. johnsonii NCC533 [ 13 ], se diseñaron microarrays
de oligo Agilent 60-mer con 5 a 6 sondas que difunden la secuencia de codificación de cada gen
(Agilent technologies Inc., EE. UU.). El ADN genómico se preparó y marcó como se describió
anteriormente [ 26]. Las reacciones de hibridación se realizaron en un volumen de 210 µl con 10
µl de ADN marcado, 70 µl de agua libre de nucleasas, 25 µl del control Agilent objetivo y 105
µl de tampón de hibridación Agilent, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los
portaobjetos se lavaron 10 min a temperatura ambiente en 6 x SSC, 0,005% de Triton x-100 y 10
min en hielo en 0,1 x SSC, 0,005% de Triton x-100. Los portaobjetos se secaron inmediatamente
mediante centrifugación y se escanearon a 10 µm con un Scanarray 4000 (Packard Biochip
Technologies, Billerica, MA, EE. UU.). Los datos se extrajeron con Imagene 5.6 (Biodiscovery,
El Segundo, CA, EE. UU.) Y se trataron con guiones caseros en lenguaje
Python http://www.python.org . Las sondas se eliminaron del análisis si su intensidad de señal
era menor que el doble de la desviación estándar del fondo local cuando se hibridaba conL.
johnsonii NCC533 ADN genómico. La relación de señal (ADN de cepa desconocida marcada
con Cy3 versus ADN de L. johnsoniiNCC533 marcada con Cy5 ) de cada punto se calculó sin la
sustracción del fondo y se normalizó en función de nuestra experiencia previa con CGH
[ 26 ]. Teniendo de 5 a 6 sondas por gen, cada relación de señal génica fue dada por la mediana
de los valores de las sondas correspondientes. Teniendo en cuenta el bajo nivel de variabilidad
de la cepa para la molécula probada (ADN), el gran número de sondas por gen y la robustez de la
mediana, las réplicas biológicas de las hibridaciones se centraron solo en el análisis más crítico:
self-NCC533 (validación de las matrices) , ATCC33200 T / NCC533 (comparación intra-
especie), y BL263 / NCC533 (comparación inter-especie con la novelaLactobacillus ).

Números de acceso
El gen 16S rRNA, recA , pheS , tuf y pyrG secuencias generadas en este estudio fueron
depositados en el GenBank bajo los números de
acceso FJ556999 a FJ557013 , FJ557014 a FJ557023 , GU121623 a GU121628 y HM777006 ,
GU121629 a GU121634 y HM777008 , y GU121635 a 121.640 y HM777007 ,
respectivamente. Los datos de microarrays se han depositado en Gene Expression Omnibus de
NCBI [ 38] y son accesibles a través del número de acceso de la serie GEO GSE21627 .
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Resultados

El análisis del 16S rRNA que codifica el gen y la secuencia multilocus colocó los
nuevos aislados de Lactobacillus dentro del grupo Lactobacillus acidophilus
Secuencias del gen 16S rRNA (aproximadamente 1,440 pb) de los aislamientos de
rata Lactobacillus sp . Se determinaron BL263, BL301, BL302, BL303 y BL304. Las secuencias
de BL263, BL301, BL302 y BL303 fueron idénticas (datos no mostrados) y compartieron una
identidad de secuencia del 99,9% con la cepa BL304. Un análisis preliminar mostró que estas
secuencias eran muy similares a las secuencias de L. gasseri y L. johnsonii . Posteriormente, se
obtuvo un árbol filogenético utilizando las herramientas disponibles en RDP [ 32 ]. Sobre la base
de esta reconstrucción, secuencias de especies cercanas a L. gasseri y L. johnsoniifueron
seleccionados para una reconstrucción filogenética detallada por máxima verosimilitud. Durante
la preparación de este manuscrito, se describió la nueva especie de L. taiwanensisaislada de
ensilaje [ 39 ]. La reconstrucción filogenético basado en las secuencias de genes de ARNr 16S
sugiere que estas cepas pertenecen a L. taiwanensis especies y que están estrechamente
relacionados con L. johnsonii y L. gasseri (Fig. (Fig.1).1 ). La identidad entre el gen 16S rRNA
de L. taiwanensis y L. johnsonii y L. gasserilas cepas variaron de 99.2% a 99.7% y de 98.5% a
99.5%, respectivamente. Esto es más alto que el umbral de identidad generalmente aceptado>
97% para la definición de especie, pero este problema se conoce por mucho tiempo en el grupo
acidophilus [ 24 ].
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Figura 1
Árbol filogenético que muestra relaciones entre las secuencias del gen 16S rRNA de especies en
el grupo Lactobacillus acidophilus , incluyendo Lactobacillus taiwanensis , y especies que
representan diferentes linajes dentro del género Lactobacillus . El árbol se creó utilizando un enfoque
de máxima verosimilitud y los números en los puntos de ramificación son valores de arranque (basados
en 500 muestreos expresados en porcentajes). Solo se muestran los valores de arranque por encima del
75%. La barra indica la divergencia de la secuencia. El árbol ha sido arraigado arbitrariamente. Entre
paréntesis se muestran los números de acceso de GenBank o Ribosomal Database Project II.
El análisis de las secuencias de genes recA , pheS , pyrG y tuf de las cepas BL263, BL301,
BL302, BL303, BL304 y L. taiwanensis DSM 21401 T también condujo a árboles filogenéticos
que separaban claramente un grupo que abarca L. taiwanensis y los aislamientos intestinales de
ratas. de todo el L. johnsonii y L. gasseri cepas como se indica por los valores de arranque
(Fig. (Fig.22 y la Fig. fig.3).3 ). Por lo tanto, concluimos que nuestros aislamientos pertenecen
a L. taiwanensis.. Estas reconstrucciones filogenéticas estuvieron en general de acuerdo con la
obtenida con las secuencias del gen 16S rRNA descritas anteriormente. Aunque altamente
conservados, esos genes mostraron un mayor grado de variabilidad entre las bacterias
relacionadas que el gen 16S rRNA. Por lo tanto, el análisis de secuencia multilocus proporcionó
un mayor poder de discriminación que es más adecuado para la reconstrucción filogenética y
taxonómica dentro de las especies estrechamente relacionadas que constituyen el grupo L.
acidophilus .

Figura 2
Árbol filogenético que muestra las relaciones entre las secuencias de los genes recA (A) y pheS (B)
de especies en el grupo Lactobacillus acidophilus , incluyendo Lactobacillus taiwanensis , y especies
que representan diferentes linajes dentro del género Lactobacillus . Los árboles se crearon utilizando
un enfoque de máxima verosimilitud y los números en los puntos de ramificación son valores de arranque
(basados en 500 muestreos expresados en porcentajes). Solo se muestran los valores de arranque por
encima del 75%. La barra indica la divergencia de la secuencia. Los árboles han sido arraigados
arbitrariamente. En paréntesis se muestran los números de acceso de GenBank.

figura 3
Árbol filogenético que muestra relaciones entre las secuencias de los genes pyrG (A) y tuf (B) de
especies en el grupo Lactobacillus acidophilus , incluyendo Lactobacillus taiwanensis , y especies que
representan diferentes linajes dentro del género Lactobacillus . Los árboles se crearon utilizando un
enfoque de máxima verosimilitud y los números en los puntos de ramificación son valores de arranque
(basados en 500 muestreos expresados en porcentajes). Solo se muestran los valores de arranque por
encima del 75%. La barra indica la divergencia de la secuencia. Los árboles han sido arraigados
arbitrariamente. En paréntesis se muestran los números de acceso de GenBank.

Los análisis fenotípicos y de perfil de proteínas no resolvieron las especies.

Los patrones de fermentación de carbohidratos, y los perfiles de crecimiento de 26 lactobacilos
(incluyendo los aislados novedoso y miembros de la acidophilus L. grupo) a diferentes
temperaturas y concentraciones de sal se utilizaron para construir un dendrograma (tabla (Tabla
33 y la Fig. Fig. 4).4 ). Del mismo modo, un análisis comparativo de los patrones de proteínas de
células enteras se realizó con extractos de proteínas bacterianas de los nuevos aislamientos y
otros miembros de la acidophilus L. grupo (Fig. (Fig.4).4). Ni el dendrograma fenotípico, ni el
análisis agrupado de los perfiles de la proteína SDS-PAGE mostraron un buen acuerdo con las
relaciones filogenéticas inferidas de los marcadores genéticos. Estos análisis fenotípicos y de
perfiles de proteínas coinciden con los análisis taxonómicos previos [ 40 ] que mostraron una
falta de correlación entre el posicionamiento filogenético y las propiedades fisiológicas /
bioquímicas en los lactobacilos. No obstante, L. taiwanensis cepas agrupan en un subgrupo del
análisis fenotípico con una similitud interna por encima de 30% (Fig. (Fig.44 ).
Tabla 3
Características fenotípicas diferenciales de las cepas de Lactobacillus taiwanensis (BL263,
BL301, BL302, BL303, BL304) con respecto a las especies relacionadas del
género Lactobacillus ( L. acidophilus, L. crispatus, L. gasseri, L. intestinalis, L. johnsonii, L.
murinus y l. reuteri )
 Abrir en una ventana separada
una
La cepa nombres corresponden con la lista mostró en la Tabla Tabla1.1 . +, buen crecimiento; -, no crece; d,
pobre crecimiento. Todas las cepas fermentan D-glucosa y sacarosa. Ninguna cepa fermentada L-sorbosa, ramnosa,
inositol, sorbitol, inulina, melezitosa, xilitol, fucosa, arabitol o gluconato.

Figura 4
Dendrograma derivado del análisis de propiedades fenotípicas (A) y perfiles de proteínas de células
completas SDS-PAGE (B) de cepas de Lactobacillus taiwanensis y cepas relacionadas de especies del
género Lactobacillus . El análisis se realizó utilizando el coeficiente de correlación de Pearson ( r ) y los
valores se muestran en la parte inferior de cada dendrograma. Ambos árboles (A y B) se construyeron
utilizando el método de grupos de pares no ponderados con promedios aritméticos (UPGMA).

Los experimentos de hibridación ADN-ADN confirmaron el estado separado de

las cepas de Lactobacillus taiwanensis a nivel de especie
Los valores de similitud de ADN se determinaron mediante hibridación de ADN-ADN con
26 cepas de Lactobacillus . ADN de las 26 cepas se inmovilizó en transferencias de membrana y
 el ADN genómico de seis Lactobacillus cepas de tipo y L. taiwanensis cepa BL263 se utilizó
como sonda (Tabla (Table4).4 ). Los valores de hibridación relativos obtenidos a partir de
ensayos de hibridación intraespecífica con L. intestinalis , L. acidophilus o cepas de L.
crispatus siempre arrojaron valores por encima del 82%, mientras que los valores de re-
asociación de ADN entre especies entre esas especies fueron bajos (1% a 18%). ). Resultados
obtenidos con L. johnsonii , L. gasseri.y L. taiwanensis fueron menos claros. Los valores de
hibridación intraespecie de L. johnsonii y L. gasseri fueron mayores que 71%, pero L.
johnsonii BL261 y L. gasseriBL223 solo mostraron valores de 57% y 62% con sus respectivas
cepas de tipo. Sin embargo, esos valores todavía se encuentran dentro de los límites de
delineación de especies relajadas (50-70% de reasociación del ADN) [ 20 ]. L.
taiwanensis mostró valores de hibridación intraespecífica en el rango de 73% a
95%. Hibridaciones entre especies entre L. johnsonii y L. gasserilas cepas representaron valores
de hasta el 46%, y siempre más altos que con las otras especies incluidas en este ensayo, lo que
confirma que están estrechamente relacionadas pero son especies distintas. Las cepas de L.
taiwanensis también mostraron altas tasas de reasociación con L. johnsonii y L. gasseri , cuyos
valores de hibridación entre especies oscilan entre el 21 y el 40% y entre el 10 y el 26%,
respectivamente. Por lo tanto, estos resultados también demostraron el estado separado de
las cepas de L. taiwanensis a nivel de especie y, sin duda, las ubicaron dentro del complejo L.
acidophilus . Dentro de este grupo mostraron una homología de ADN más cercana con L.
johnsonii y L. gasseri que con L. crispatus yL. acidophilus de acuerdo con los análisis
filogenéticos anteriores.
Tabla 4 Valores de re-asociación de ADN determinados por el análisis de macroarray de ADN
entre cepas de Lactobacillus
Los valores se calcularon como porcentaje de la hibridación relativa tomando como un 100% la hibridación de cada
cepa consigo misma y son las medias ± SD de tres experimentos de hibridación independientes. Los valores de
hibridación de ADN intraespecífico se muestran en negrita.

Hibridación completa del genoma entre L. taiwanensis BL263 y L. johnsonii NCC533

usando microarrays de ADN
En primer lugar, la micromatriz de ADN construida con oligonucleótidos que representan todas las
regiones codificantes de la cepa NCC533 de L. johnsonii se probó en un experimento de auto-
hibridación para validar el diseño de los microarrays. Este paso fue necesario ya que las micromatrices
utilizadas previamente para CGH entre especies en el grupo de L. acidophilus [ 26 ] estaban basadas en
amplicones y no en oligonucleótidos. Por lo tanto, se utilizó la cepa L. johnsonii NCC533 como
referencia y como cepa de prueba y, como se esperaba, la distribución de las relaciones log 2 mostró
una distribución normal alrededor de cero (datos no mostrados). El rendimiento de la micromatriz de
oligonucleótidos se evaluó adicionalmente mediante hibridación con ADN de L. johnsoniiCepa tipo
ATCC 33200 y L. johnsoniiBL261. En los ensayos de hibridación ADN-ADN, esta última cepa cayó
en la definición relajada de especie. La distribución de los registro de 2 proporciones de los resultados
de CGH se muestran en la Fig. La figura 5A.5A . Aproximadamente el 83% de los ORF presentes en
la cepa NCC533 produjeron una relación log 2 de -3.5 o mayor con estas dos cepas, lo que sugiere una
mayoría de secuencias de ADN muy similares. El resto de los ORF mostraron valores de log 2 por
debajo de -3.5, lo que refleja una alta divergencia o genes ausentes en las cepas de prueba. Los
dos perfiles de cepas de L. johnsonii fueron típicos de las comparaciones dentro de las especies. En
contraste, L. taiwanensis yL. gasseri cepas mostraron una desviación significativa de cero para casi
todos los genes, lo que sugiere divergencia de secuencia global entre L. johnsonii y las dos cepas
ensayadas (Fig. (Figura 5A).5A ). Estas cepas dieron un perfil similar, característico de las
comparaciones entre especies. Sin embargo, L. taiwanensis tiene más sondas (51%) con proporciones
de -3.5 o mayores que L. gasseri (47%), mostrando una conservación genética ligeramente mejor. Esto
está de acuerdo con los resultados de los experimentos de hibridación ADN-ADN. Estos resultados
confirmaron el estado separado de L. taiwanensis de L. johnsonii a nivel de especie, y mostraron
que L. taiwanensisestá más cerca de L. johnsonii que L. gasseri está de L. johnsonii .
Figura 5
Datos comparativos de hibridación genómica (CGH) . (A) Histogramas de distribución de frecuencia
de los datos de CGH. La cepa de referencia es L. johnsonii NCC533. Las proporciones se expresan en
una escala log 2 ; (B) Datos CGH mapeados en L. johnsonii NCC533. Cada fila horizontal corresponde a
una región de codificación específica en la matriz y los genes están ordenados verticalmente de acuerdo
con sus posiciones en la L. johnsoniiNCC533 genoma. Las columnas representan las cepas analizadas,
identificadas por sus números de código. El gradiente del código de color varía de negro (presencia de un
gen homólogo) a blanco (divergencia o ausencia de un gen). Algunos genes relevantes se muestran a la
izquierda (conservado) o a la derecha (variable) a lo largo del genoma. El asterisco mostró genes
conservados en L. taiwanensis , que son opcionales en L. johnsonii .
Resultados de CGH se mapearon en el L. johnsonii NCC533 genoma (Fig. (5B).5B ). Las
diferencias genéticas observadas en el análisis intraespecífico con la cepa de tipo ATCC 33200
de L. johnsonii coinciden estrechamente con el análisis anterior mediante microarrays basados en
amplicón [ 26 ], lo que valida aún más los microarrays basados en oligonucleótidos utilizados en
este estudio. Mientras que L. taiwanensisBL263 compartió menos genes con la referencia L.
johnsonii NCC533 que las otras cepas de L. johnsonii , mostró 78 genes que no siempre están
presentes en las cepas de L. johnsonii . Están organizados principalmente en 6 grupos de genes:
el segundolocus, una hipotética proteína fimbrial, la bacteriocina lactacin F operón de
biosíntesis, el clúster utilización de lactosa, el nucleótido de azúcar dTDP-ramnosa operón
síntesis y glicosiltransferasas (Fig. (5B,5B , marcado con un asterisco). En particular, el más
genes similares, que muestran las mayores relaciones log 2 (≥ -0,34) para un grupo completo,
entre L. johnsonii y L. taiwanensis forman un grupo claro que contiene un transportador ABC y
proteínas hipotéticas, que está flanqueado por transposasas (LJ1292- LJ1298). Este grupo está
ausente en todas las otras cepas de L. johnsonii y L. gasserianalizado hasta la fecha. En conjunto,
estas observaciones abogan fuertemente por una transferencia horizontal de genes. Teniendo en
cuenta la notable conservación de este grupo en comparación con el resto del genoma de L.
taiwanensis , la hipótesis de su pérdida en el resto de las cepas analizadas es muy poco probable.
A fin de comparar la conservación genoma de L. taiwanensis BL263, L. gasseri ATCC
33323 T y L. johnsonii ATCC 33200 T frente a L. johnsonii NCC533, sus resultados CGH se
combinaron en la Fig. Fig.6.6 . Curiosamente, las dos especies no siempre compartieron genes
variables o ausentes en L. taiwanensis y L. gasseri . Estos genes variables "relacionados con las
especies" representaron casi una cuarta parte de la L. johnsoniiNCC533 genoma. Dado que
estaban en minoría en relación con los elementos móviles, esta observación apoya firmemente
tres ramas evolutivas. El número de genes conservados en L. taiwanensis y ausentes /
divergentes en L. gasseri fue de 257, mientras que los conservados en L. gasseri y ausentes /
divergentes en L. taiwanensis fueron solo de 186. Estos resultados muestran claramente que L.
taiwanensisestá más cerca de L. johnsonii que L. gasseri es para L. johnsonii . El código de color
de la Fig. Fig.66 muestra que la mayoría de la L. johnsonii ATCC 33200 Tgenes ausentes /
variables también están ausentes en las otras dos especies probadas. Sin embargo, 63 genes
ausentes en la cepa de tipo L. johnsonii están presentes en L. taiwanensis (archivo
adicional 1 ). En contraste, un análisis similar realizado con los resultados CGH de L.
johnsonii BL261 en lugar de L. johnsonii ATCC 33200 T recupera solo 34 genes ausentes en L.
johnsonii BL261 y está presente en L. taiwanensis (archivo adicional 1 ). Esta diferencia puede
reflejar la adaptación a diferentes nichos ecológicos, ya que la cepa de tipo L. johnsonii se ha
aislado de la sangre humana, mientras que L. johnsoniiLas cepas NCC533 y BL261 y L.
taiwanensis cepa BL263 se aislaron a partir del contenido intestinal. Varios genes conservados
en L. taiwanensis BL263 y L. johnsonii BL261, pero no en L. johnsonii ATCC 33200 T ,
ayudarían a sobrevivir en un ambiente microbiano tan poblado y competitivo. Entre esos genes
se encuentran la agrupación de genes bacteriocina lactacina F, que está flanqueada por
componentes del mobiloma L. johnsonii NCC533, y genes que codifican proteínas
hipotéticamente involucradas en el transporte y metabolismo de los carbohidratos (PTS celobiosa
específica, sistema PTS específico de trehalosa).

Figura 6
Conservación del genoma en L. johnsonii NCC533 microarrays . Diagrama de dispersión de los
perfiles de hibridación para L. taiwanensis BL263 (eje y) versus L. gasseri ATCC 33323 T (eje x). Los
valores de los ejes representan las relaciones de señal de hibridación expresadas en una escala log 2 . Para
cada gen, los puntos de datos fueron codificados por colores de acuerdo con el perfil de hibridación de
tercera cepa, L johnsonii ATCC 33200 T . El color de conservación de genes se obtuvo a partir de la
relación de señal para cada gen en escala log 2 . Va desde el negro (presencia en ATCC 32200 T).de un gen
homólogo con respecto a la cepa de referencia NCC533) a blanco (ausencia de un gen). Por ejemplo, un
círculo blanco en la esquina superior izquierda de la trama representa un gen presente en BL263 y ausente
en tanto ATCC 33323 T y ATCC 32200 T.
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Discusión
Un estudio previo diseñado para analizar el efecto prebiótico del sorbitol en un modelo de rata,
resultó en el aislamiento de cinco cepas de Lactobacillus del contenido intestinal que no
pudieron asignarse de manera concluyente a especies conocidas [ 29 ]. Aquí, hemos demostrado
que los cinco aislamientos comparten secuencias genéticas del ARNr 16S casi idénticas, forman
un grupo estrecho en las reconstrucciones filogenéticas recA , pheS , pyrG y tuf, y los
experimentos de hibridación ADN-ADN revelaron una estrecha relación entre ellos a nivel
genómico (> 72%). Por lo tanto, se consideraba que pertenecían a la misma especie. Durante la
preparación de este manuscrito un nuevo L. taiwanensis.Se describieron especies aisladas de
ensilaje [ 39 ]. El análisis del 16S rRNA que codifica el gen y la secuencia multilocus mostró que
nuestras cepas aisladas del intestino de rata pertenecen a la especie L. taiwanensis . Esta especie
se coloca dentro del grupo L. acidophilus , pero constituyen un grupo diferente de sus parientes
más cercanos, L. johnsonii y L. gasseri . Las cinco cepas de L. taiwanensis se han aislado del
mismo entorno y mostraron una homología muy alta en los análisis filogenéticos; sin embargo,
los perfiles de utilización y crecimiento de carbohidratos distinguen claramente a L.
taiwanensis BL301 de los grupos creados por L. taiwanensiscepas BL304 y BL302 y por L.
taiwanensis cepas BL303 y BL263 (tabla (Tabla 33 y la Fig. la figura 1A).1A ). Estas dos
parejas de cepas pueden distinguirse por sus perfiles de proteínas (Fig. (Figura 1B)1B ) y por
DNA-DNA experimentos de hibridación (Tabla (Table4).4 ). En conjunto, estos resultados
indican que los cinco aislamientos de L. taiwanensis constituyen cepas distintas.
El CGH basado en microarrays se ha utilizado para caracterizar la diversidad genética bacteriana
intraespecífica a nivel del genoma completo [ 41 - 46 ]. También se ha utilizado para
comparaciones genómicas entre especies del mismo género o géneros estrechamente
relacionados que difieren en el origen ambiental o potencial de virulencia [ 47 - 49 ]. Los análisis
de CGH por microarrays también se han utilizado para discriminar entre las especies
del complejo L. acidophilus [ 26]. Aquí, la tecnología CGH basada en microarrays se ha aplicado
para caracterizar una nueva especie mediante la determinación del gen por los límites de los
genes con su vecino filogenético más cercano. La rápida acumulación en los últimos años de
secuencias genéticas completas del genoma (en la actualidad hay 721 genomas completos o en
curso depositados en el filo Firmicutes , 57 de ellos del género Lactobacillus, en el Centro
Nacional de Información Biotecnológica), y la tendencia general hacia un aumento en los
proyectos de secuenciación del genoma ofrecerá la oportunidad de aplicar el CGH basado en
microarrays de ADN como una alternativa a las clásicas hibridaciones de macroarray de ADN de
genoma completo para la determinación de especies bacterianas. A un precio más asequible que
la secuenciación completa del genoma, el análisis CGH presenta muchos más parámetros de
información que la asociación completa del ADN. Aunque los microarrays CGH presentaron la
limitación de ser incapaces de detectar nuevos genes, ofrece la relación de reasociación para cada
ORF, la gráfica de la frecuencia de la señal y la relación, y el mapeo de los genes conservados en
el genoma de referencia, proporcionando así una Diferentes motivos para las comparaciones
intra e inter-especies.L. taiwanensis demostró claramente su estado separado con respecto a L.
johnsonii .
Los valores obtenidos al comparar la relación de L. taiwanensis BL263 y L. johnsonii NCC533
utilizando la hibridación de ADN-ADN con macro o micromatrices pueden parecer diferentes:
los valores de re-asociación de ADN completo fueron del 25% para el método de macroarray,
pero en el análisis CGH de microarrays 51 El% de los genes de L. johnsonii NCC533 se
conservaron en L. taiwanensis . En este último experimento, la distribución de las proporciones
de hibridación de los genes conservados en L. taiwanensis se centra en -1 (Fig. (Figura 5A),5A),
que corresponde a una intensidad de señal reducida al 50%. Por lo tanto, el 51% de los genes
conservados que muestran aproximadamente el 50% de la intensidad de la señal se aproxima al
25% de la intensidad global, como se observa mediante la hibridación ADN-ADN.
Una serie de características en el genoma de L. johnsonii NCC533 [ 13 ] que se conservan en L.
taiwanensis BL263 pueden contribuir a la adaptación de esta bacteria a su nicho
ecológico. Curiosamente, nuestro combinado CGH resultados con dos L. johnsonii cepas
mostraron que L. taiwanensis BL263 está más cerca del intestino aislado de L. johnsonii BL261
que a la sangre aislar L. johnsonii ATCC 33200 T . La L. JohnsoniiEl genoma de NCC533
codifica 16 sistemas putativos de fosfoenolpiruvato: azúcar fosfotransferasa (PTS) y varios de
ellos, incluidos los anotados para el transporte de fructosa, glucosa y celobiosa, se inducen
específicamente en el tracto gastrointestinal (GIT) [ 14 ]. Los resultados de CGH mostraron que
cuatro PTS, hipotéticamente involucradas en el transporte y el metabolismo de la fructosa,
celobiosa, trehalosa y sacarosa se conservan en L. taiwanensis BL263. Estas predicciones son
compatibles con el API 50CH resultados mostraron para L. taiwanensis BL263 (tabla (Tabla
3).3 ). Un grupo de genes de utilización de maltosa / maltodextrina putativo, que incluye un gen
que codifica una α-amilasa putativa de neopululanasa / maltogénica, se conserva enL.
taiwanensis BL263, lo que sugiere que esta cepa puede usar productos degradados con
almidón. Otras enzimas que pueden contribuir a la supervivencia / persistencia de L.
taiwanensis BL263 en el GIT son las hidrolasas de sales biliares (BSH). Estas enzimas se han
encontrado casi exclusivamente en especies bacterianas asociadas con el GIT y su función ha
sido ampliamente discutida [ver revisión [ 50 ]. L. taiwanensis BL263 exhibió actividad de
desconjugación del ácido taurocólico y taurodeoxicólico (LA Sarmiento-Rubiano y MJ Yebra,
resultados no publicados). Esto está de acuerdo con el análisis de CGH que muestra que un
operón putativo que codifica un BSH y dos transportadores de sal biliar (LJ0056 a LJ0058) en
el genoma de L. johnsonii NCC533 se conserva enL. taiwanensis BL263, aunque esta cepa tiene
solo uno de los dos genes codificadores del transportador. Se demostró que los homólogos de
estos genes en L. johnsonii 100-100 son duplicados de genes y tienen una función en la captación
de ácido taurocólico [ 51 , 52 ]. Se ha demostrado que la capacidad de L. johnsoniiNCC533 para
interactuar con mucinas y células epiteliales depende del factor de alargamiento Tu asociado a la
superficie celular y de la proteína de choque térmico GroEL [ 53 , 54 ]. Como se esperaba para
estas clases de proteínas, sus genes codificadores (LJ1009 y LJ0461) también se conservan en L.
taiwanensisBL263, que ofrece un papel putativo de las proteínas codificadas en la interacción de
esta cepa con el huésped. Esta interacción también puede verse influida por la presencia de otro
gen conservado que codifica una adhesina putativa (LJ0391) que mostró similitudes con la
proteína fimbrial Fap1 de Streptococcus parasanguinis [ 55 ].
Estudios previos que utilizaron CGH basados en microarrays de ADN y en el análisis genómico
comparativo in silico mostraron una amplia similitud de secuencia y una sintenia de genoma
precisa entre L. johnsonii y L. gasseri especies [ 13 , 26 ]. A pesar de esta estrecha relación, las
nuevas especies de Lactobacillus que se describen aquí se colocan en una tercera ramificación de
cercanía similar, lo que plantea una vez más la pregunta sobre los límites de la delineación de las
especies. Además, el análisis de CGH mostró que la nueva especie está genéticamente
ligeramente más cerca de L. johnsonii que de L. gasseri.es. Este resultado también está
respaldado por nuestros datos de hibridación de ADN-ADN y nuestro análisis filogenético de las
secuencias recA , pheS , pyrG y tuf en estas tres especies.
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Conclusión
Dado que el genoma es el objetivo final de todos los indicadores taxonómicos moleculares de la
determinación de especies, el análisis CGH basado en microarrays de ADN es la tecnología más
poderosa para la tipificación de cepas y la asignación de especies, justo detrás de la costosa
secuenciación del genoma. En este trabajo, hemos caracterizado con análisis taxonómicos
convencionales una nueva especie de Lactobacillus dentro del grupo L. acidophilus , y con el
análisis CGH basado en microarrays confirmamos el estado de L. taiwanensis BL263 como
especie que muestra gen por diferencias genéticas y similitudes con su pariente más cercano. L.
johnsonii cepa NCC533.