TIP-laboratorio de bioquímica

Efecto de la longitud de onda sobre la síntesis de pigmentos fotosintéticos

de Zea mays. Extracción y cuantificación
Valentina Guerrero Florez, Vanessa Serrano

Fecha de entrega: 16/03/2018

Las plantas requieren luz para la fotosíntesis. Sin embargo, muchos otros procesos en la vida
de la planta también están controlados por la luz, desde la germinación y el crecimiento, hasta
la formación de flores. Para adaptarse a las condiciones de luz en su hábitat particular, las
plantas, han desarrollado varios sistemas de fotorreceptores. Una forma en que las plantas
perciben la luz es a través de los fitocromos, y diversos fotorreceptores de proteínas cuyos
orígenes se remontan a los procariotas fotosintéticos.

Los fitocromos son fotorreceptores transductores
de señales que se convierten entre formas forma
fisiológicamente inactiva, que absorbe el color (Pr)
y en una forma fisiológicamente activa, de
absorción rojo lejano (Pfr) en respuesta a diferentes
longitudes de onda de luz, su conversión se usa para
sincronizar el desarrollo de la planta con las
exigencias del entorno de luz. Los fitocromos
también proporcionan a las plantas señales
temporales que regulas pasos de desarrollo
cruciales en el ciclo de vida de las plantas; tales
como la síntesis de moléculas fotosensibles.
responden a la radiación UV-A (320-400 nm) y
visible.
Una gran cantidad de procesos biosintéticos son
estimulados o regulados por UV-A/azul incluida la
síntesis de clorofilas (Chl) y carotenoides, mientras
que la radiación ultravioleta-B es, en su mayor
parte, perjudicial para función de la planta,
causando deterioros en las características
morfológicas y en los procesos fisiológicos/
bioquímicos, que posteriormente limitan el
crecimiento y el rendimiento fotosintético de la
planta.

La región del espectro efectiva se puede medir

Numerosos estudios de plantas evaluando el efecto
de la radiación UV muestran que las respuestas
varían cualitativa y cuantitativamente y dependen
de muchos factores, incluidos la exposición a la
radiación UV-B, la sensibilidad de especies y el
estrés asociado a las condiciones ambientales. En
este trabajo de investigación se medirá el efecto de
diferentes longitudes de onda sobre la tasa
fotosintética para obtener el espectro de acción, el
cual sirve para identificar los pigmentos implicados
Efecto de la luz sobre los procesos
fotosintéticos de las plantas
La respuesta instantánea a la radiación UV-B (290-
320 nm) en entornos controlados ha sido difícil de
evaluar, posiblemente porque las plantas también
como un espectro de acción correspondiente a la
absorción del fotorreceptor particular; por este
medio, al menos tres fotorreceptores se pueden
distinguir en las plantas. Estos son activos en UV-
B, UV-A/azul. Los primeros dos de estos
fotorreceptores han sido poco caracterizados hasta
la fecha, pero el receptor rojo/rojo lejano,
"fitocromo", ha sido identificado y ya estudiado en
detalle.
La iluminación saturada con luz roja lejana
(λ𝑚𝑎𝑥 =730 nm) transforma el 99% del fitocromo
en la forma Pr, mientras que la saturación de la
iluminación con luz roja produce alrededor del
85% de Pfr con 15% Pr. La Figura 1 muestra los
espectros de absorción de las dos formas. El
fitocromo nativo es un dímero que consiste en dos
subunidades idénticas. Cada subunidad se
compone de un N-terminal que contiene el
cromóforo
Figura 1. Espectros de absorción de fitocromo de 124
kDa a partir de avena etiolada en tampón de fosfato 10
mM, pH 7,8. Los espectros se determinaron a 4 ° C
después de saturar la iluminación con luz roja lejana (-)
y roja (---).
En particular, el efecto de la irradiación UV-B
sobre la fotosíntesis de pigmentos, compuestos que
absorben UV-B, se ha investigado en condiciones
de irradiación diaria a un cultivar de soja con
deficiencia en clorofilas y en flavonoides.
Mohr18 presentó un modelo que describe la
interacción potencial entre tres fotorreceptores. En
ese modelo, se designó al fitocromo como el
fotorreceptor primario: la regulación roja/lejana de
la respuesta inicial podría ser posteriormente
modificado por radiación UV-A /azul o UV-B por
separado. Coacción o aumento de la respuesta
inicial inducida por fitocromo, se esperaba cuando
las respuestas son inducidas por dos (o tres)
fotorreceptores, sin embargo, fueron
cualitativamente similares (por ejemplo, todos
estimulan la síntesis de pigmentos). Se esperaba
moderación o reducción de la respuesta inicial
inducida por fitocromo cuando las respuestas
fueron cualitativamente diferentes (por ejemplo, el
alargamiento del tallo se fomenta en luz roja, pero
se inhibe en luz azul). Los resultados pueden ser
adecuadamente explicado como el efecto neto de
las respuestas estimuladas por el fotorreceptor UV-
A/azul (activado por UV-A/azul) solamente) y
aquellos regulados por la relación Pr/Pfr
(estimulada por radiación roja, UV-B o UV-A/azul
pero inhibida por el rojo lejano radiación).
La secuencia de transducción de señales inducida
por el fitocromo aún se desconoce. La vieja
pregunta de si el fitocromo ejerce un solo efecto
primario o sufre una multitud de reacciones
directas con otros componentes de la planta.
Figura 2. Diagrama de acción del fitocromo.
Los fitocromes se someten a una fotoconversión
desde la forma biológicamente inactiva (Pr) a la
forma activa (Pfr), Figura 2. Pr y Pfr se muestran
como dímeros. Las conversiones Pr-Pfr se inician
por absorción de fotones en el cromóforo que
conduce a cambios estéricos, causando que la
holoproteína se "abra" y facilitando la interacción
con otras moléculas. El diagrama muestra las tres
principales teorías para las acciones posteriores de
los fitocromos, aunque Pfr puede regular el
crecimiento y el desarrollo por otros procesos. Área
rosada: tanto Pr como Pfr interactuar con PKS1, el
sustrato de fitocromo quinasa, en el citosol. Este
puede ser el primer paso en una cascada de cinasa
(área naranja) que culmina en acción dentro del
citoplasma. Alternativamente, la interacción con
PKS1 puede dar como resultado el secuestro de
fitocromo en el citosol, evitando la translocación al
núcleo. Área amarilla: Pfr interactúa con NDPK1,
un nucleósido difosfato quinasa, que se encuentra
tanto en el citoplasma y el núcleo. De nuevo, esta
interacción puede iniciar una cascada de cinasas
(naranja) que conduce a la acción final dentro del
citoplasma y/o núcleo. Area verde: Pfr se transloca
al núcleo y Pr se transloca al citoplasma. Dentro de
núcleo, Pfr se une con PIF3 (factor de interacción
3 del fitocromo) que se encuentra exclusivamente
dentro del núcleo. PIF3 es un factor de
transcripción de hélice-bucle-hélice básico que se
une a los promotores de genes regulados por luz
seleccionados en combinación con Pfr e inicia o
mejora la transcripción.
Método de extracción y cuantificación
de clorofila, xantofilas y carotenos
Las técnicas de extracción de los componentes
celulares generalmente utilizan químicos,
mecánicos y/o procedimientos enzimáticos1,2.
Existen varios métodos disponibles para cuantificar
pigmentos. Los pasos comunes para todos los
protocolos, basados en espectrofotometría, son los
siguientes: 1- separación del sobrenadante de las
células vegetales; 2- extracción de pigmentos con
un solvente orgánico y; 3-determinación
espectrofotométrica de la concentración de cada
pigmento en el extracto3.
En las técnicas de disrupción de la pared celular, se
pueden emplear dos grupos principales: mecánicos
y no mecánicos. Dentro del primer grupo, los
ultrasonidos se usaron en algunos de los métodos
probados. Entre los no mecánicos técnicas de lisis
celular, existen procesos químicos, relacionados
con el solvente utilizado, y métodos físicos, como
la secuencia de congelación y descongelación. Este
último proceso se puede realizar lenta o
rápidamente (mediante el uso de nitrógeno líquido)
dando lugar a un mayor choque térmico en el
material biológico, induciendo una ruptura mucho
más eficiente de las paredes celulares4,5.
El tiempo de contacto entre los compuestos
celulares que se extraerán y el disolvente puede ser
determinante a la cantidad de productos extraídos
Cuando el poder de lisis celular del solvente no es
demasiado alto, lo cual puede ser intencional para
evitar el daño de los compuestos que se extraerán,
un período de extracción más largo puede aumentar
el rendimiento de este proceso.
La selección del solvente para promover la
extracción es un tema muy importante ya que
determina el grado de afinidad a la composición
química de las sustancias que se extraerán Aparte
de la capacidad de disolución hacia los compuestos
a extraer y cuantificar, el disolvente también juega
un papel importante en la lisis celular. Los
solventes más agresivos pueden aumentar el
rendimiento de extracción en células con paredes
fuertes. El metanol fue el primer solvente que se
usó para extraer clorofilas, pero debido a su
toxicidad ha sido reemplazado por otros. la
evaluación del contenido de clorofila se realizó
mediante el uso de un método de extracción con
acetona. Desde entonces, el uso de etanol como
disolvente de extracción ha sido sugerido.
La determinación cuantitativa de clorofila (Chl) a,
Chl b y carotenoides en un extracto de pigmento
entero de tejido vegetal verde mediante
espectroscopía UV-VIS se complica por la elección
de muestra, el solvente y espectrofotómetro
utilizado8. Los diversos pigmentos vegetales
absorber luz en regiones espectrales superpuestas,
dependiendo del sistema seleccionado. Arnon et al,
discuten los métodos usados para explicar tales
superposiciones mediante la aplicación de
ecuaciones para la determinación cuantitativa de
Chl a, Chl b, y carotenoides totales en el mismo
extracto de pigmento de hojas o frutas.
Los máximos de absorción de los pigmentos
extraídos dependen en gran medida del tipo de
disolvente y, hasta cierto punto, en el tipo de
espectrofotómetro utilizado. Por ejemplo, al
aumentar la polaridad del disolvente, el máximo de
absorción de color rojo de Chl a varía de 660 a 665
nm, y el máximo de absorción azul de 428 a 432
nm. Lo mismo se aplica a Chl b, que cambia de 642
a 652 nm y de 452 a 469 nm. Estos cambios de
longitud de onda de los máximos de absorción se
correlacionan con los cambios en los coeficientes
de absorción utilizados para la determinación
cuantitativa de Chls a y b y carotenoides. Por estas
razones, la absorbancia las lecturas de un extracto
de pigmento se deben realizar en la posición de
longitud de onda correcta, es decir, los máximos de
Chl a puro y Chl b puro en una disolvente
particular. Además, los coeficientes de extinción
específicos del solvente deben ser considerados
aplicando las ecuaciones correspondientes para el
cálculo del contenido del pigmento.

Proceso analítico de extracción y

cuantificación de pig mentos
fotosintéticos

Tomando una muestra de hojas con 10 ml de

disolvente extractante, según la tabla 1, consignada
Figura 3. Estructura de la clorofila
en anexos. Luego se homogenizar la mezcla se
centrifugó a 10.000 rpm durante 15 minutos a 40ºC. Otro grupo clave de pigmentos que absorben luz
El sobrenadante se debe separar y mezclarse con son los carotenoides, estos absorben luz violeta y
0,5 ml de este con 4,5 ml del solvente respectivo.
verde. Los carotenoides pertenecen al grupo de los
La mezcla de solución se analiza para Contenido de
isoprenoides los cuales se encuentran en plantas y
clorofila-a, clorofila-b y carotenoides en un
otros organismos fotosintéticos, dependiendo de su
espectrofotómetro. La ecuación utilizada para la
cuantificación de clorofila-a, clorofila-b y estructura se dividen en dos grupos: carotenos y
carteniods por diferentes disolventes extractantes xantofilas. Los carotenos son carotenoides no
se dan en la tabla 1. oxigenados y las xantofilas son derivados
oxigenados de los carotenos.
Determinación del espectro de absorción
de un extracto de pigmentos obtenidos Los carotenos pertenecen a la familia de los
posterior a una extracción con acetona terpenos, es el carotenoide más abundante en la
naturaleza y el más importante en la dieta humana,
Los pigmentos fotosintéticos son lípidos unidos a
por otra parte, las xantofilas contienen grupos
proteínas que se encuentran en algunas membranas
funcionales como oxigeno e hidroxilo, se
plasmáticas, estos se caracterizan por tener enlaces
encuentran en vegetales y son las responsables de
sencillos y dobles de manera alternada siendo
responsables de la coloración en plantas como en el A.
caso de la clorofila y los carotenoides, en
cianobacterias, algas rojas en las que existe
ficocianina y ficoeritrina y en bacterias
fotosintéticas. B.

Debido a las diferentes estructuras moleculares que

poseen los pigmentos fotosintéticos absorben
energía en una amplia gama de longitudes de onda, coloraciones amarillas y naranjas9.
dos de los pigmentos más importantes en plantas Figura 4. Estructura de los carotenos A.) y la xantofila
son clorofila y carotenoides. B.).

La clorofila es un pigmento que se encuentra en En el proceso de la fotosíntesis los carotenoides

organismos eucariontes que tienen cloroplastos.
Existen cinco tipos de clorofila; a, b, c, d y una
relacionada a las bacterioclorofilas, en las plantas
se encuentra la clorofila a y b. la estructura
molecular de la clorofila se divide en dos: una cola
hidrófoba insertada en la membrana del tilacoide y
una cabeza de porfirina con un ion magnesio en su
interior encargado de absorber luz.
ayudan a capturar luz y a deshacer el exceso de
energía luminosa.
El espectro de absorción de una molécula es el
resultado de una transición entre dos niveles de
energía electrónica diferente. Cuando se irradia un
pigmento fotosintético con radiación
electromagnética, este pigmento absorbe un fotón,
provocando una excitación, una transición desde el
nivel fundamental electrónico a un nivel de mayor
energía, para que este proceso de excitación ocurra
es necesario que la energía con que se irradia sea la
justa para promover la transición de un electrón a
orbitales de mayor energía.
Debido a las diferentes estructuras químicas de los
pigmentos absorben a diferentes longitudes de
onda, y por los enlaces π de las estructuras se puede
predecir que absorberá en el rango de la radiación
electromagnética del ultravioleta visible, sin
embargo, cada pigmento necesita fotones con
diferente energía para que ocurra la absorción, ya
que cada composición química es diferente, es por
ello es por lo que cada espectro de absorción para
cada pigmento cambia.
Figura 5. Espectro de absorción para diferentes
pigmentos.
Existen variaciones en el 𝜆𝑚á𝑥 de absorción en el
espectro para los pigmentos fotosintéticos, entre los
cuales se encuentra el pH, polaridad del solvente o
ambiente químico en el que se encuentre la
molécula, y orientación de los cromóforos, es por
esto que un 𝜆𝑚á𝑥 para un pigmento cuyo solvente
es un alcohol va a presentar pequeñas variaciones
con respecto a otro solvente usado. Generalmente,
la clorofila tiene un espectro de absorción en el que
se presentan dos máximos de longitud de onda, uno
hacia la zona azul (400-500 nm) y otro hacia la
zona roja (500-600nm) la cual corresponde al color
verde típico de las plantas o a los organismos que
contengas cloroplastos.
Usando acetona como solvente para medir la
absorbancia de los pigmentos se espera encontrar
dos máximos en longitudes de onda en los rangos
mencionados anteriormente, este solvente es
usando pues descompone los enlaces lipídicos en el
caso de la clorofila de la a la estructura tilacoide
haciendo que el pigmento quede en solución,
también porque los pigmentos fotosintéticos no son
solubles en agua, pero en acetona si presentan
solubilidad.
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Anexos

Tabla 1. Ecuaciones para determinar concentraciones (μg / ml) de clorofila a (Ch-a), clorofila b
(Ch-b) y carotenoides totales (C x + c) por diferentes solventes extractantes en espectrofotómetro.