UNIVERSIDAD DEL VALLE NORMA: VERSIÓN:

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ABRIL-2016

FECHA DE REVISIÓN:
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

ÁCIDOS NUCLEICOS: ADN, AISLAMIENTO Y PROPIEDADES

ELABORADO POR:CAGV & col. REVISADO POR:CAGV. APROBADO POR:

Departamento de Química

1. OBJETIVOS

 Familiarizar al estudiante con la metodología básica para la separación de ácidos

nucleicos del resto de componentes celulares de un tejido.
 Determinar experimentalmente algunas de las propiedades características del ADN.

2. INTRODUCCIÓN

El ADN es un polímero lineal compuesto

de nucleótidos unidos a través de
enlaces fosfodiéster. Estos nucleótidos
están formados a su vez de fosfato -
azúcar- base nitrogenada. Según el tipo
de ácido nucleico, el azúcar puede ser
desoxirribosa o ribosa (ARN o ADN,
respectivamente) que en posiciones 5’ y
3’ forman uniones fosfodiéster y en
posición 1’ se unen a una base
nitrogenada que otorga identidad al
nucleótido.

Las bases nitrogenadas son compuestos

orgánicos heterocíclicos, que incluyen
dos o más átomos de nitrógeno. Son
parte fundamental de los nucleósidos,
nucleótidos y ácidos nucleicos.
Biológicamente existen cinco bases nitrogenadas principales, que se clasifican en dos
grupos, bases púricas (derivadas de la estructura de la purina) y bases pirimidínicas
(derivadas de la estructura de la pirimidina). La adenina (A) y la guanina (G) son
púricas, mientras que la timina (T), la citosina (C) y el uracilo (U) son pirimidínicas.
Las cuatro primeras bases se encuentran en el ADN, mientras que en el ARN en lugar
de timina existe el uracilo.
Por comodidad el nombre de los nucleótidos hace referencia a cada una de las bases
nitrogenadas que se representan por la letra indicada. Un punto fundamental es que
las bases nitrogenadas son complementarias entre sí, es decir, forman parejas de igual
manera que lo harían una llave y su cerradura (donadoras y aceptoras de puentes de
H). La adenina y la timina son complementarias (A=T), al igual que la guanina y la
citosina (G≡C). Dado que en el ARN no existe timina, la complementariedad se
establece entre adenina y uracilo (A=U). La complementariedad de las bases es la
clave de la estructura del ADN y tiene importantes implicaciones, pues permite
procesos como la replicación del ADN y la traducción del ARN en proteínas.

El ADN consiste en dos hebras complementarias que se retuercen sobre un eje común
a manera de α-hélices de igual quiralidad. El orden de las bases en la cadena de ADN
tiene un importante significado biológico: es el elemento fundamental diferenciador de
un ser vivo de otro.

Casi todas las células contienen ADN, pero la cantidad presente en algunos tejidos es
muy pequeña. Algunos tejidos contienen alta actividad de desoxirribonucleasa
(ADNasa) y el ADN es roto en pequeños pedazos. Una fuente conveniente para aislar el
ADN debe contener una alta cantidad del material y una baja actividad de ADNasa. El
ADN se desnaturaliza fácilmente y en consecuencia debe tenerse mucho cuidado
durante su extracción.

3. MATERIAL (a reservar por cada grupo) Y REACTIVOS

Material Frasco lavador (1)

Vaso de precipitados de 250 mL (2) Pinzas para bureta (2)
Termómetro (1) Gotero (1)
Microespátula (1) Probeta 100 mL (1)
Vidrio reloj (1) Pinza para tubo de ensayo (1)
Pipeta volumétrica 5 mL (2) Falcón (1)
Pipeta graduada 1 mL (2) Escobillón (1)
Pipeta graduada 2 mL (2) Reactivos
Pipeta graduada 5 mL (1) NaCl
Varilla de vidrio delgada (2) Etanol
Baño maría (2) SDS
Balón aforado 25 mL con tapa (3) NaOH
Balón aforado 50 mL con tapa (2) Cisteína
Tubo de ensayo mediano Pyrex (15) Ácido sulfúrico frio
Gradilla (2) Albúmina patrón
Cronómetro (1) HCl concentrado
Vaso de precipitados de 50 mL (2) EDTA (tetrasódico)
Vaso de precipitados de 100mL (1) Acetato de sodio anhidro
Plancha calentadora con control de temperatura (1) Fosfato de sodio anhidro
Termostato (1) Tris-HCl
Bureta de 10 mL (2) ARN patrón
Pipeta Pasteur (2) ADN patrón
Jeringa (2)
La concentración y composición de cada una de las soluciones empleadas en esta
práctica se encuentra descrita en el Anexo 2.

4. PROCEDIMIENTO

POR GRUPO NECESITARÁN TRAER SOLO 2 FRESAS FRESCAS Y MADURAS (sin

las partes blancas o verdes) y unos 5 palillos para dientes o 5 clips metálicos.

- ANTES DE EMPEZAR ATIENDA LAS INSTRUCCIONES DEL PROFESOR. EL

ASIGNARÁ MISIONES PRIORITARIAS A CADA GRUPO. Conserve las disoluciones
con ADN en baños con hielo.
- Guarde el ADN en la solución salina y refrigérelo antes de usarlo.
- El ácido sulfúrico debe ser manipulado con extremo cuidado: use guantes, gafas y
demás elementos de seguridad.

4.1. EXTRACCIÓN DE ADN

a) Pese 4 gramos de fresas maduras limpias y sin hojas y póngalas en la bolsa
ziplock, ciérrela y haga un puré empleando suavemente sus dedos. Añada 1 mL
de “Extracto de bromelina” fresco si está disponible.

b) Posteriormente adicione 5mL de buffer de extracción 1 (si agregó la

“bromelina” este deberá estar libre de ablandacarne”, asegurese de eso) y
mézclelo en la bolsa con el macerado de fresas, agite durante cerca de 10
minutos.

c) Adicione 5 mL de buffer de extracción 2 y agite durante cerca de 10 minutos en

la misma bolsa evitando formar espuma ¡Cuidado este buffer debe estar
caliente (~80 °C)!

d) En un vaso de 50 mL, filtre con dos capas de tela. Descarte el sólido.

e) (Muy opcional) Distribuya el sobrenadante anterior entre los integrantes

del grupo. c/u hará esto en baño de hielo o el encargado:

f) Adicione por las paredes de una probeta de 50 mL MUY LENTAMENTE 3 volúmenes

de Etanol del 80% BIEN FRIO RECIEN SACADO DEL CONGELADOR. Deje
establecer las dos fases sin agitar durante 10 minutos. En la interfase deberá
aparecer una especie de red filamentosa (el ADN) que en ocasiones asciende hacia
la superficie.

g) Rote (no mezcle) lentamente (~1 vuelta cada 4s) la varilla delgada de vidrio o
madera para tratar de atrapar el ADN precipitado. Una vez lo extraiga, retire el
exceso del líquido acercando su varilla con el ADN suavemente a las paredes del
vidrio del recipiente.

h) Lávelo en la varilla varias veces con un poco de etanol del 80%, evitando que el
ADN se vaya de la varilla y/o se seque (guárdelo y reúnalo con el resto que
extraerá después).
i) Extraiga más ADN agitando vigorosamente el resto del sistema bifásico (sin
introducir la varilla). De nuevo espere 5 minutos o hasta que se establezcan dos
fases para extraer más ADN. Repita lo indicado en “f”, “g” y “h”.

j) Reúna todo el ADN extraído por todos los grupos de todo el laboratorio (cada
grupo le dará el ADN que no haya presentado problemas en el momento de la
extracción) y resuspéndalo en buffer de resuspensión caliente por 30
minutos (~60°C) y después llévelo a un volumen final de 150 ó 200 mL
en un balón aforado.

k) Centrifugue a 4750 rpm por 10 minutos a 4°C. Y trabaje con el sobrenadante.

l) La anterior será la disolución madre de ADN de fresa (de esta se realizarán

diluciones, de ser necesario, en las partes que siguen) que se emplearán en la
cuantificación y la determinación de las propiedades de esta biomolécula. Prepare
una dilución 1/5 (50 mL en total).

4.2. CUANTIFICACIÓN DE ADN POR COLORIMETRÍA (474nm- sólo un grupo).

Prepare 9 tubos de ensayo medianos (~20 mL) como se indica en la tabla 1 (valores
en mL). Ejemplo; Al tubo 1, se le adiciona 0,2 mL de patrón de ADN, 1 ml de cisteína
al 0,05 % y 0,8 mL de agua.

Tabla 1. Datos para realizar la cuantificación de calibración de ADN

Tubo No. B 1 2 3 4 M1 M2 RNA ALB Una vez
Patrón de ADN (sin diluir) 0 0,2 0,4 0,6 1,0 0 0 0 0 preparado
ADN fresa (disolución madre) 0 0 0 0 0 1,0 0 0 0 cada tubo,
ADN fresa diluido 1/5 (opcional) 0 0 0 0 0 0 1,0 0 0 agítelo y
ARN patrón (sin diluir) 0 0 0 0 0 0 0 1,0 0 déjelo en
Albumina patrón (sin diluir) 0 0 0 0 0 0 0 0 1,0 baño de
Cisteína al 0,05% 1 1 1 1 1 1 1 1 1 hielo por 5
Agua 1 0,8 0,6 0,4 0 0 0 0 0 minutos.

Vaya por el H2SO4 frío en la nevera y en campana de extracción, adicione 5,0 mL a

cada tubo de los anteriores dejando verter el líquido por la paredes. Mezcle después
con una varilla de vidrio del menos concentrado al másconcetrado en ADN. Este es el
tiempo cero. Coloque enseguida el tubo en un baño a 35°C y lea la Abs474nm
exactamente 20 minutos después. Repita el procedimiento para el resto de tubos
manteniendo los intervalos de tiempo.

4.3. PROPIEDADES DEL ADN

Estas medidas las deberá realizar en un espectrofotómetro UV una vez realizado la

parte 4.1. Idealmente, tres grupos empezarán con el efecto de la temperatura y tres
grupos les seguirán con el efecto del pH. LAS CUBETAS EMPLEADAS SON MUY
COSTOSAS TRÁTELAS CON EXTREMO CUIDADO. (Emplee como blanco el buffer de
resuspensión sin ADN para las medidas de efecto de la temperatura).

A) DETERMINACIÓN DE DILUCIÓN ADECUADA (lo hace un sólo grupo pero

los demás no pueden avanzar hasta que esto se defina).
En un tubo de ensayo (PYREX) adicione 2,5 mL de muestra de ADN de fresa sin diluir y
adicione 2,5 mL de buffer de resuspensión. En tres tubos de ensayo adicione según sea
el caso 2,5 mL de patrones de (ADN o ARN o Albúmina) diluidos 1/5 y adicione 2,5 mL
de buffer de resuspensión. Mezcle y saque espectros entre 340 nm y 190 nm frente al
blanco (buffer de resuspensión). Determine los valores de absorbancia máxima
alrededor de 260nm (la longitud de onda correspondiente será λmáx) así como los
valores a 280 y 320 nm. Si la lectura es muy baja (Abs.<0,5) realice la medida con la
disoluciones de ADN más concentradas. Si es muy alta (Abs>2) emplee diluciones
adecuadas (haga los cálculos) de modo que logre una lectura de alrededor de 0,7- 1,0.
Deberán preparar al menos 50 mL de la “dilución adecuada”. Registre el valor de la
absorbancia a 280 nm.

B) EFECTO DEL CALENTAMIENTO Y RÁPIDO ENFRIAMIENTO.

Separe 6 tubos de ensayo PYREX iguales de los más grandes y a c/u ponga 4 mL de la
disolución apropiada hallada en el procedimiento anterior. (Un grupo pondrá además 1
mL de etanol absoluto solo opcionalmente). Lleve cada tubo por 15 minutos a una
de las siguientes temperaturas: 25ºC (o T ambiente), 65°C, 75°C, 85ºC, 90ºC y agua
hirviendo (96-97°C en Cali). Use los baños maría o los termostatos que cada grupo se
encarga de mantener a la temperatura indicada. Agite para que alcancen el equilibrio
térmico rápidamente. Manténgalos en tal temperatura (registre la temperatura real
alcanzada dentro del tubo). Inmediatamente pase los tubos a baño de agua/mucho
hielo/mucha sal, agitando para que se enfríen rápidamente (midala la T), después
de mínimo 5 minutos déjelos atemperar y mida la absorbancia a la longitud de
onda máxima (λmáx) de absorción determinada en el punto anterior. Haga un blanco
para esta medida con tampón de resuspensión (y el mismo pero con 1mL de etanol
absoluto para quienes lo hayan usado).

C) EFECTO DEL pH.

En 6 tubos de ensayo iguales tome 2,5 mL de la dilución adecuada de ADN de fresa

(o del patrón de ADN según se asigne) establecida en el punto “A”, adicione 2,5 mL de
los tampones respectivos a pH 1 / 3 / 7/ 9/ 12 y 13 y sométalos a agua hirviendo
(registre la Temp. real) por 20 minutos. Enfríe rápidamente los tubos como lo hizo en
el paso anterior y después déjelos a T ambiente. Lea en el espectrofotómetro el valor
de absorbancia a λmáx (OPCIONALMENTE algunos grupos agregarán a los anteriores
0,5 mL de etanol absoluto). Dos grupos realizarán los blancos para cada punto de pH
(un grupo blancos sin etanol y si se estudia el efecto, el otro con etanol).
D) EFECTO DE LA UREA.
Prepare tubos de ensayo iguales de acuerdo a las instrucciones de la siguiente tabla:
Tabla 2. Datos para realizar efecto de la urea
Tubo 1 2 3 4 5 6 7
Dilución adecuada de ADN Patrón
2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2.5
o de ADN de Fresa (mL)
Agua (mL) 2,5 2,2 2,1 1,9 1,6 0,9 0
Urea 8M (mL) 0 0,3 0,4 0,6 0.9 1,6 2,5
Concentración final de úrea (mM) 0 480 640 960 1440 2560 4000
Para c/u de los anteriores tubos realice blancos (tienen todo excepto el ADN patrón,
dicho volumen se remplaza por tampón de resuspensión). Incúbelos en agua
hirviendo (registre la Temp. real) por 20 minutos mínimo y posteriormente enfríelos
según el protocolo de rápido enfriamiento.

5. TRATAMIENTO DE DESECHOS

Al final del curso el profesor indicará el protocolo respectivo para llevar a cabo el
tratamiento de cada uno de los desechos generados en la presente práctica. Sin
embargo, esto no exonera al estudiante de hacer la respectiva búsqueda bibliográfica
que deberá ser consignada en sus preinformes.

6. CÁLCULOS Y RESULTADOS

 Como siempre, hay partes que otros grupos realizaron y su grupo no. Deberá
averiguar los resultados obtenidos por ellos en tales casos e incluirlos en su
informe.

 Analice los efectos de cada una de las variables termodinámicas en la estructura de

ADN de acuerdo a las medidas realizadas en el espectrofotómetro UV.

 Comente además sobre la selectividad y sensibilidad del método colorimétrico de

cuantificación de ADN.

 Exprese la concentración de ADN extraído por masa de fresa según lo encontrado

en el punto 4.2.

7. PREGUNTAS

Preguntas a resolver en el preinforme

Como siempre, incluya diagrama de flujo sobre los procedimientos a seguir; desde
antes planee cómo se va a organizar con su/s compañero/s. Trate de resolver ANTES
de la práctica las dudas que se le presenten con el profesor. Incluya fichas de
seguridad y de tratamiento de los reactivos empleados.
 I. Averigüe sobre los fundamentos de la separación selectiva de ADN del resto de
componentes celulares (proteínas, lípidos, carbohidratos, etc.) que vamos a
utilizar en ésta práctica. Indique la función de cada reactivo durante cada parte el
proceso.
II. ¿Por qué se eligió fresa y no otra fruta para la práctica?
III. ¿Por qué es importante incluir EDTA en la extracción de ADN?
IV. ¿Qué es un mutágeno? Dé un ejemplo explicando cómo interactúa con la doble
hélice de ADN.
V. ¿Cómo se cuantifica ADN mediante la absorción en el UV? ¿Cómo interferiría la
presencia de proteínas en dicho caso?

Preguntas a resolver en el informe

I. Suponga que su ADN presenta un elevado número de errores en el

apareamiento de las bases: ¿qué influencia tendría esto sobre, por ejemplo, el
Tm?
II. ¿Qué información se obtiene a partir de la medida Abs a λmáx / Abs a 280 nm
para la dilución de trabajo de ADN en el punto “4.3 A”?
III. De acuerdo al rango de Tm que Ud. determinó para el ADN de la fresa y el de
esperma de arenque, ¿Es un ADN rico en C y G? Compárelo con el Tm de otros
ADN (otros vegetales, organismos termófilos o psicrófilos) en la literatura.
IV. ¿Cuál es la temperatura inicial de ADN que más cambio tuvo en la lectura de
absorbancia a λmáx? ¿Por qué esto fue así?
V. Si hubiese realizado el experimento del efecto de la temperatura en presencia
de formaldehído. ¿Cómo sería el resultado de Tm obtenido en tales condiciones
frente al que obtendría usted en ausencia de formaldehido? Explique.

8. BIBLIOGRAFÍA

1. Lehninger. Principios de Bioquímica. 5ta. Edición. 2006.

2. López E. Guías de laboratorio (Bioquímica para la carrera de química). Notas de
clase. Universidad Nacional. 2005.
3. Brody S. A spectrophotometric study of the desoxipentonse nucleic acid. Act. Scan.
Chem. 1953 (502-506).
4. Singer, A.; Kuhn, H. Frank-Kamenetskii, M. Meller, A. Detection of urea-induced
internal denaturation of dsADN using solid-state nanopores. J Phys Condens
Matter, 2010, 22(45).
 ANEXOS

ANEXO 1: TABLAS DE RESULTADOS

Cuantificación de ADN por colorimetría

Vol. ADN o
Tubo Abs
RNA (mL)
B 0,0

1 0,2

2 0,4

3 0,6

4 1,0

M1 1,0

M2 1,0

RNA 1,0

ALB 1,0

Efecto del Calentamiento y el Rápido Enfriamiento

Tubo Tubo
Temperatura Abs Abs Temperatura Abs Abs
(Sin (Con
(ºC) Blanco Tubo (ºC) Blanco Tubo
Etanol) Etanol)
1 25 1 25
2 60 2 60
3 70 3 70
4 85 4 85
5 90 5 90
6 100 6 100
Efecto del pH
Tubo Tubo
Abs Abs Abs Abs
(Sin pH (Sin pH
Blanco Tubo Blanco Tubo
Etanol) Etanol)
1 1 1 1
2 3 2 3
3 7 3 7
4 9 4 9
5 12 5 12
6 13 6 13

Efecto de la Urea
Tubo
Urea Abs Abs
(Sin
(mM) Blanco Tubo
Etanol)
1 0
2 500
3 750
4 1000
5 1500
6 2500
7 4000

ANEXO 2: SOLUCIONES DE TRABAJO

SOLUCIÓN O REACTIVO CONCENTRACIÓN

Buffer de extracción1 EDTA 0,1 M, NaCl 2M (pH 8).
Buffer de extracción 2 a ~80 °C EDTA 0,1 M, SDS 1, Borato de sodio
0,1 M (pH 8) calentado a 80 °C.
Buffer de resuspensión NaCl 0,20 M, EDTA 10mM (pH 8,5).
Buffer pH 1 (HCl en agua) ~100 mM
Buffer pH 3 (acetato) 50 mM
Buffer pH 7 (fosfato) 50 mM
Buffer pH 9 (tris HCl) 50 mM
Buffer pH 12 (NaOH en agua) ~50 mM
Buffer pH >13 (NaOH en agua) ~100 mM
Cisteína recién preparada. 0,05 %
Ácido sulfúrico (frio) 98 %
Etanol absoluto 25 mL
Etanol (frio) 80 %
Albumina patrón 20 mg/50 mL
Patrón de DNA de Arenque: 80 mg en 200 mL de buffer de resuspensión. El patrón
anterior sin diluir se usará para la parte 4.2. El patrón anterior diluido 1/5 en buffer de
resuspensión (volumen total de la dilución 250mL) se usará para la parte 4.3. Esta
dilución la preparará un grupo y será usada por los demás.

Patrón de RNA: 20 mg en 50 mL de buffer de resuspensión. A partir de esta prepare

una dilución 1/5 en buffer de resuspensión (25mL).

Albúmina de huevo: 10 mg en 25 mL de buffer de resuspensión. A partir de esta

prepare un dilución 1/5 en buffer de resuspensión (25mL).