Juan Camilo Sánchez Pulido cod.

201223687
CITOGENÉTICA DEL CÁNCER: REVISIÓN DE LA METODOLOGÍA
Análisis critico

El cromosoma Filadelfia fue la primera anomalía genética descubierta en el cáncer (en

1960) y se encontró que se asociaba de manera consistente con la CML. La descripción del
hromosoma de Filadelfia marcó el comienzo de una nueva era en el campo de la
citogenética del cáncer. Se ha demostrado que la acumulación de datos genéticos está
íntimamente asociada con el diagnóstico y pronóstico de las neoplasias; por lo tanto, el
cariotipo ahora se considera una investigación obligatoria para todas las leucemias recién
diagnosticadas. El desarrollo de FISH en la década de 1980 superó muchos de los
inconvenientes de evaluar las alteraciones genéticas en las células cancerosas mediante el
cariotipo. El cariotipo de las células cancerosas sigue siendo el estándar de oro, ya que
proporciona un análisis global de las anomalías en todo el genoma de una sola célula. Sin
embargo, los avances metodológicos posteriores en citogenética molecular basados en el
principio de FISH que se iniciaron a principios de la década de 1990 han mejorado
enormemente la eficiencia y la precisión del análisis de cariotipos al combinar la
citogenética convencional con las tecnologías moleculares. En esta revisión, se discutirán el
desarrollo, la utilización actual y las dificultades técnicas de los enfoques de citogenética
convencional y molecular utilizados para el diagnóstico de cáncer en las últimas cinco
décadas.

Introduccion
El descubrimiento de un pequeño cromosoma anormal, el cromosoma Filadelfia, como un
sello de CML en 1960 por Peter Nowell y David Hungerford marcó la primera vez que se
demostró que el cáncer era el resultado de una anomalía genética específica [1]. A medida
que mejoraban las técnicas citogenéticas, en 1973, Rowley [2] descubrió la existencia de
una translocación entre los brazos largos del cromosoma 9 y 22 en la CML. El trabajo
posterior reveló que esta translocación dio lugar a una nueva proteína de fusión que se
expresó en las células cancerosas [3]. Sorprendentemente, la descripción del cromosoma
Filadelfia marcó el comienzo de una nueva era de diagnóstico genético. En las últimas
décadas, se ha demostrado que la acumulación de datos genéticos está íntimamente
asociada con el diagnóstico y pronóstico de las neoplasias, lo que hace que los estudios de
investigación de la citogenética del cáncer pasen a la práctica clínica. Reconociendo la
asociación entre anomalías citogenéticas específicas y ciertas características morfológicas y
clínicas, la Organización Mundial de la Salud ha categorizado cuatro subtipos únicos de
AML según la citogenética [4]. Por lo tanto, el análisis citogenético convencional se
considera obligatorio para todas las leucemias recién diagnosticadas, debido a su utilidad en
el diagnóstico, clasificación y pronóstico. FISH se puede usar para mapear loci en
cromosomas específicos [5], detectar anomalías cromosómicas tanto estructurales como
numéricas, y revelar anomalías crípticas. Ha superado muchos de los inconvenientes de los
cariotipos, como el bajo rendimiento de células de espécimen, el bajo índice mitótico, las
metafases de baja calidad y otras dificultades técnicas. Actualmente, el FISH se utiliza
como una herramienta indispensable para la detección de reordenamientos estructurales,
como translocaciones, inversiones, inserciones y microdeleciones, y para la identificación
de cromosomas marcadores y la delineación de los puntos de ruptura del cromosoma [6, 7].
Por lo tanto, FISH ha mejorado mucho la eficiencia y la precisión del análisis de cariotipo
al reunir la citogenética convencional y las tecnologías moleculares.
Esta revisión resume el desarrollo, la utilización actual y las dificultades técnicas de los
enfoques citogenéticos convencionales y moleculares utilizados en los laboratorios clínicos
para el diagnóstico del cáncer.

Citogenica convencional
El análisis de cromosomas es una técnica simple. En condiciones óptimas, en la mayoría de
los casos de leucemia aguda, las anomalías citogenéticas clonales se detectan mediante este
método. El análisis de cromosomas requiere cinco pasos principales: 1) cultivo celular, 2)
recolección de cromosomas en metafase, 3) preparación de cromosomas, 4) bandas y
tinción usando un protocolo especial, y 5) análisis por microscopía óptica o análisis
computarizado asistido por cariotipo (Fig. 1 ). El descubrimiento de que el pretratamiento
con colchicina (o colcemid) dio lugar a un paro mitótico y que el tratamiento de células
detenidas con una solución hipotónica mejoró el rendimiento y la calidad de las
diseminación de las metafases. Por lo tanto, los cromosomas individuales contados y
analizados en células humanas son entonces posibles. El análisis de cromosomas
proporciona una visión general de todas las aberraciones cromosómicas en una sola célula
tumoral.

1. Consideraciones tecnológicas
Los estudios cromosómicos de tumores malignos plantean un desafío técnico particular.
Como los resultados son tan impredecibles, no hay una sola técnica que garantice que
funcione de manera consistente y confiable. Por lo tanto, cada laboratorio debe adoptar una
ligera variación del protocolo básico. Además de configurar un cultivo celular en
suspensión de la médula ósea de neoplasias hematológicas, también se puede investigar la
sangre periférica, si contiene más del 10% de blastos circulantes o células inmaduras.
Además, se requiere una biopsia de ganglio linfático, ya que los ganglios linfáticos son el
tejido preferido para los estudios de la mayoría de los linfomas [8]. La duración del ciclo
celular en las células malignas varía mucho entre los pacientes; se obtuvo un rango de 16
horas a 292 horas en una serie de 37 pacientes con LMA [9]. Por lo tanto, uno de los
factores más importantes para obtener un resultado exitoso es configurar múltiples cultivos
para maximizar las posibilidades de obtener divisiones óptimas de células malignas: 1)
extracción directa de células de médula ósea, 2) cultivo durante la noche y 3) cultivo
durante la noche con sincronización (mediante el bloqueo en la fase S del ciclo celular)
[10].
Se pueden lograr bandas de alta resolución de cromosomas largos con buena morfología
mediante la aplicación de técnicas de sincronización [10]. Permite la identificación de
aberraciones cromosómicas estructurales sutiles que se encuentran comúnmente en las
células malignas. Sin embargo, se ha informado de que los cultivos de sincronización de
fluorodeoxiuridina son inferiores a los cultivos a corto plazo para el análisis de
cromosomas en LLA [11]. La ALL es una enfermedad frustrante para la mayoría de los
especialistas en citogenética, ya que presenta varios desafíos técnicos, entre los que se
incluyen la morfología frecuente de los cromosomas, el bajo índice mitótico y las muestras
que tienen una marcada tendencia a la coagulación durante la recolección.

2. Clones anormales adquiridos versus anomalías cromosómicas constitucionales o

heteromorfismos citogenéticos
En los casos en que el análisis citogenético revela solo metafases anormales, especialmente
en aquellos con una translocación equilibrada, puede ser necesario descartar una anomalía
cromosómica constitucional. Además, las regiones heterocromáticas constitutivas justo
debajo de los centrómeros de los cromosomas 1, 9 y 16 y el extremo telomérico del brazo
largo del cromosoma Y pueden variar ampliamente en tamaño entre los individuos y
algunas veces pueden aparecer anormales (Fig. 2A). Las anomalías cromosómicas
constitucionales se diferencian mejor de la diferenciación de los clones anormales
adquiridos mediante el examen citogenético de linfocitos estimulados con
fitohemaglutinina (PHA) de sangre periférica en la remisión de la enfermedad. El Comité
de Recursos Citogenéticos (CyRC) del Colegio de Patólogos Estadounidenses (CAP) /
Colegio Americano de Genética y Genómica Médica (ACMG) ha pedido a los participantes
que no incluyan los heteromorfismos cuando responden a un desafío de la encuesta
citogenética. Sin embargo, las pautas para reportar heteromorfismos no han sido
estandarizadas. De los 223 laboratorios citogenéticos, 136 (61%) declararon que incluirían
información de heteromorfismo seleccionado identificada por bandas G de rutina en un
informe clínico citogenético en una encuesta de CyRC sobre heteromorfismos citogenéticos
[12]. La mayoría de los estudios citogenéticos clínicos estudiados no incluirían las variantes
cromosómicas más comunes (como los brazos cortos prominentes, los satélites grandes o
dobles y la mayor longitud del tallo o los tallos dobles en los cromosomas acrocéntricos y
las variaciones de heterocromatina en el brazo largo de los cromosomas 1, 9, 16 e Y), pero
reportaría la mayoría de las inversiones pericéntricas [como inv (9) (p11q13); Fig. 2B] y
otros heteromorfismos raros [12].
La inversión pericéntrica constitucional del cromosoma 9 [inv (9) (p11q13)] ocurre en
0,8% a 2% de la población normal y durante mucho tiempo se ha considerado una variante
normal. Si el inv. Constitucional (9) es un factor predisponente para el cáncer, sigue siendo
controvertido. Fuimos el primer grupo en documentar un caso de invicencia pericéntrica
adquirida (9) en trombocitemia esencial [13]. Desde entonces, se han notificado otras
neoplasias malignas hematológicas con inv (9) adquirido. Sin embargo, inv (9) no está
representada en exceso en pacientes con neoplasias hematológicas; por lo tanto, no hay
evidencia que sugiera que la presencia de inv (9) constitucional aumenta el riesgo de
malignidad hematológica [13, 14].
Además, algunas anomalías son tanto adquiridas como heredadas. Por ejemplo, la trisomía
21 es común tanto como una anomalía hereditaria en el síndrome de Down como una
anomalía adquirida en la AML, MDS y LLA infantil [15-17]. La trisomía 21 es la segunda
trisomía más común en AML y MDS después de la trisomía 8 [18]. Por lo tanto, si se
encuentra la trisomía 21 en un cariotipo, es necesario considerar tanto las anomalías
hereditarias como las adquiridas. Sin embargo, la mayoría de los individuos con síndrome
de Down tienen características físicas características.
3. Mecanismos que generan anomalías cromosómicas.
1) Ganancia neta y pérdida de material cromosómico.
En general, la ganancia o pérdida de material cromosómico da como resultado la
amplificación génica o la pérdida de heterocigosidad, respectivamente. Dos clases
principales de genes relevantes para el cáncer, los oncogenes y los genes supresores de
tumores han sido reconocidos como los principales objetivos patógenos para las anomalías
cariotípicas asociadas con el cáncer. Las aberraciones cromosómicas numéricas se detectan
como el único cambio clonal en aproximadamente el 15% de todas las neoplasias malignas
hematológicas citogenéticamente anormales, y muestran variaciones sustanciales en la
frecuencia entre los diversos subgrupos de enfermedades [19]. A pesar de su ocurrencia
relativamente frecuente, los cambios numéricos, incluidas las trisomías autosómicas únicas,
han recibido menos atención que los cambios estructurales. Hay varias razones para esta
discrepancia. Primero, el alto grado de correlación entre los cambios citogenéticos y la
morfología que se observa con los cambios estructurales, como la translocación, carece de
aberraciones numéricas. En segundo lugar, el papel que desempeñan los cambios
numéricos en la leucemogénesis tiende a ocultarse. En tercer lugar, las consecuencias
moleculares de las ganancias y pérdidas de cromosomas completos aún no están claras.
La ganancia neta del material cromosómico puede ser causada por la duplicación (Fig. 2C)
y la triplicación (Fig. 2D) de segmentos o regiones cromosómicas particulares, lo que
también puede conducir a un producto génico desequilibrado. La mala segregación de
cromosomas completos en la división celular también puede dar lugar a trisomías o
polisomías más extensas [20]. Una única trisomía autosómica es una anomalía citogenética
numérica común en las neoplasias malignas hematológicas, y muestra una predilección por
los trastornos mieloides [15, 16, 18, 21]. Sin embargo, la ganancia de un cromosoma sexual
como única anomalía adquirida es muy rara en las neoplasias malignas hematológicas [22].
Curiosamente, la morfología celular del espejo de la mano se ha descrito en la AML con
trisomía 13 [23], particularmente en la AML-M0 y -M1, y puede no detectarse en los
subtipos más diferenciados de la AML [24]. Además, la ganancia de cromosomas no es
aleatoria en la LLA infantil, y ocho cromosomas (+4, +6, +10, +14, +17, +18, +21 y + X)
representan casi el 80% de todas las ganancias. Sin embargo, la trisomía 4 también se ha
descrito como la única anomalía cariotípica en la ALL [25].
La pérdida neta de material cromosómico puede ser causada por la pérdida de un
cromosoma completo (monosomía) [26-28], deleciones de segmentos cromosómicos
particulares [29] (Fig. 2E, F), translocaciones desequilibradas (Fig. 2G) o isocromosomas (
Fig. 2H). Las eliminaciones terminales resultan de una única ruptura en el brazo del
cromosoma, con pérdida del segmento distal (Fig. 2E). Las supresiones intersticiales
emergen cuando se producen dos roturas dentro del mismo brazo cromosómico y se pierde
el segmento intermedio (Fig. 2F).
2) Reordenamientos cromosómicos
Un reordenamiento cromosómico ocurre cuando una parte de un cromosoma se rompe y se
adhiere a otro cromosoma. Se puede crear una fusión de genes cuando la translocación se
une a otros dos genes separados, cuya aparición es común en el cáncer. Puede ser una
translocación equilibrada, una translocación desequilibrada, una inserción o una inversión.
En una translocación equilibrada, los fragmentos de cromosomas se reorganizan, pero no se
gana ni se pierde material genético en la célula (Fig. 2I). Una translocación equilibrada
puede implicar más de dos cromosomas y formar una translocación variante compleja [30,
31] (Fig. 2J). En la CML, una translocación variante de 3 vías compleja, que involucra 3
cromosomas, ocurre a menudo como un proceso de un solo paso con 3 puntos de ruptura y
sin fusión recíproca ABL1-BCR [32] (Fig. 2J). Curiosamente, se ha detectado una
translocación compleja de 3 vías a partir de 4 puntos de ruptura, un proceso de 2 etapas y
una fusión génica recíproca en el tercer cromosoma en leucemia promielocítica aguda y
CML, utilizando sondas FISH de translocación de fusión dual de doble color [32, 33].
En una translocación desequilibrada, el intercambio de material cromosómico es desigual,
lo que resulta en fragmentos cromosómicos extra o extra [34, 35]. El derivado (1; 7) (q10;
p10) con una translocación desequilibrada de todo el brazo es una anomalía citogenética
recurrente en los trastornos mieloides [36, 37] (Fig. 2K). Durante mucho tiempo se lo
consideró como un indicador de mal pronóstico en MDS y AML [38], hasta la publicación
de un gran estudio sobre las características clínico-patológicas de las neoplasias mieloides
con esta anomalía cariotípica [39]. Se ha propuesto que las neoplasias mieloides con der (1;
7) (q10; p10) pueden no tener un comportamiento clínico homogéneamente favorable en
comparación con el MDS, que tiene una citogenética de bajo riesgo [37].
Una inserción es un reordenamiento estructural, en el que parte de un cromosoma
generalmente se posiciona intersticialmente en un área diferente del cariotipo (Fig. 2L). La
inserción puede ser críptica y, a nivel genético, hemos informado previamente un caso de
CML infantil con una inserción críptica de BCR en 9q34 y cromosomas morfológicamente
normales 9 y 22 en bandas G [40]. FISH confirmó la presencia de la fusión del gen BCR /
ABL1 en el cromosoma 9 en cromosomas en metafase. Por lo tanto, en la práctica clínica,
los resultados de las pruebas genéticas atípicas no deben interpretarse de forma aislada y
deben integrarse con la información recopilada a través de diferentes estudios genéticos.
Una aberración cromosómica, en la cual un segmento de un cromosoma se invierte en
orientación pero no se reubica, se llama inversión. La inversión del cromosoma 16 [inv (16)
(p13q22)] es la inversión cromosómica más común observada en la leucemia (Fig. 2M). Se
ha detectado en aproximadamente el 5% de los casos de LMA de novo, que en su mayoría
se clasifican como subtipo M4Eo, y se asocia con un resultado relativamente favorable. En
el subgrupo AML M4Eo, inv (16) es mucho más frecuente (88%) [41]. Sin embargo, se han
informado diferencias étnicas, incluida una prevalencia muy baja de anomalías de inv (16)
(p13q22) en dos cohortes de AML chinas [41, 42]. Curiosamente, la banda R no es
adecuada para detectar esta aberración de inv (16) (p13q22) (Fig. 2N) [42], y es mucho más
fácil de reconocer por la banda G. Por lo tanto, los análisis de FISH, transcripción inversa
(RT) -PCR y transferencia de Southern son herramientas confiables para la detección de inv
enmascarados (16).

CITOGENÉTICOS MOLECULARES
La citogenética molecular implica el uso de una serie de técnicas denominadas FISH, en las
que las sondas de ADN se marcan con etiquetas fluorescentes de diferentes colores para
visualizar una o más regiones específicas del genoma (Fig. 3). Se utiliza como una prueba
rápida y sensible para la detección de cambios cromosómicos sutiles o crípticos. Además,
puede usarse para detectar alteraciones genéticas en poblaciones de células que no se
dividen, y es un método conveniente para apoyar la práctica de la medicina personalizada.
Sin embargo, los ensayos de FISH todavía se ven obstaculizados por los costos de los
reactivos, que impiden su adopción por medio de exámenes oncológicos a gran escala.

1. Metodología
El protocolo estándar de FISH se ilustra en la Fig. 3. Brevemente, incluye cinco pasos: 1)
pretratamiento de la muestra, 2) desnaturalización de la sonda y la muestra, 3) hibridación
de la sonda a las células diana o diseminaciones de metafase (recocido), 4) post- lavado de
hibridación, y 5) detección utilizando un microscopio de epifluorescencia simple con
conjuntos de filtros apropiados. Cuando se implementa inicialmente una prueba FISH, las
características de rendimiento del ensayo evaluadas deben incluir sensibilidad, precisión,
precisión y especificidad [43]. El límite superior para los resultados normales en un ensayo
FISH se puede determinar calculando el intervalo de confianza del 95% para los patrones
de señal de la sonda detectados en las muestras de control normales que son representativas
del tipo de muestra que se analizará.
ACMG establece estándares aceptados internacionalmente para el análisis de FISH para
garantizar que los resultados de FISH sean claros e interpretables [44]. Además, el
monitoreo continuo de la reproducibilidad interobservador, realizado en parte por dos
personas de laboratorio que leen cada caso, puede ayudar a detectar cambios en el
rendimiento del ensayo o pérdida de consistencia al aplicar los criterios de calificación. La
nomenclatura estándar FISH se ha simplificado y ampliado en la última edición del Sistema
internacional para la nomenclatura citogenética humana, ISCN 2013 [45]. Sin embargo,
dado que es probable que el uso del FISH ISCN completo dificulte la comprensión de los
médicos, no está recomendado por la Red Europea de Mieloma [46].
2. Selección de sondas FISH para su uso en oncología.
Hay tres tipos generales de sondas FISH utilizadas en los laboratorios de genética clínica,
cada una con una aplicación diferente: 1) sondas de pintura de cromosomas completos
(WCP) para descifrar las aberraciones citogenéticas [8, 34, 47, 48]; 2) sondas de secuencia
repetitiva para enumeración de cromosomas [21, 25, 26, 49-51]; y 3) sondas de
identificador específico de locus (LSI) para fusiones de genes [17, 33, 52], deleciones de
genes [35, 53, 54] o duplicaciones [55]. Estas sondas también se pueden usar en varias
combinaciones cuando se investigan anomalías complejas de los cromosomas [56, 57].
Las sondas WCP están diseñadas para marcar todo el cromosoma de interés y son útiles
para descifrar las aberraciones citogenéticas que son difíciles de resolver en términos
morfológicos, como los cromosomas marcadores de naturaleza incierta o cambios
complejos. Sin embargo, el uso de sondas de WCP en células en interfase es muy limitado,
ya que los cromosomas se dispersan en el núcleo celular durante la interfase y no forman
unidades discretas.
Las sondas de enumeración centromérica (CEP) se hibridan con secuencias de repetición de
satélite alfa (o beta) dentro de las regiones centroméricas específicas de cada cromosoma y
se utilizan para la enumeración cromosómica. El análisis de FISH de interfase que utiliza
CEP de dos colores para los cromosomas X e Y es un método eficaz para predecir la
recaída o el fracaso del injerto en pacientes después del trasplante de médula ósea no
coincidente con el sexo (Fig. 4A) [58].
Hay dos sistemas principales de sondas LSI FISH para la detección de reordenamientos
genéticos en oncología, sondas de translocación de doble color y sonda de separación de
doble color. Las sondas de translocación de doble color están diseñadas para detectar
translocaciones cromosómicas que involucran genes asociados conocidos, como BCR-
ABL1 que resultan de t (9; 22) (q34; q11.2) en la CML (Fig. 4B). Además, las sondas de
separación de dos colores son útiles para detectar translocaciones cromosómicas que
involucran genes con compañeros de translocación desconocidos o múltiples, como MLL,
ALK y RARα (Fig. 4C). Las sondas FISH de translocación separadas proporcionan de
manera conveniente información importante sobre la presencia de reordenamientos
genéticos, aunque son incapaces de identificar el gen asociado específico. Recientemente,
con el uso de la reacción en cadena de la polimerasa inversa a larga distancia (LDI) -PCR,
ha sido posible identificar compañeros de translocación desconocidos y mapear los puntos
de ruptura en el nivel del par de bases. LDI-PCR solo requiere información de secuencia
aproximada para un compañero, por lo que es ideal para usar en combinación con FISH
para extender y refinar los datos del punto de interrupción citogenética [59]. Las sondas
LSI FISH también se han utilizado para identificar el origen del ADN amplificado que
constituye regiones de tinción homogénea (HSR) y minutos dobles (DM), que se producen
en una variedad de células tumorales (Fig. 4D) [60].

3. Avances en la tecnología FISH.

Se iniciaron numerosos avances metodológicos en la tecnología citogenética molecular a
principios de la década de 1990, incluida la hibridación genómica comparativa (CGH) [54],
cariotipo espectral (SKY) [62], FISH multicolor (MFISH) [63], bandas multicolores
(mBAND) [64 ], y la matriz CGH (aCGH) [65]. Todas estas técnicas citogenéticas agregan
colores al monótono mundo de las bandas convencionales. Se han introducido dos
tecnologías de fluorescencia multicolor, MFISH [63] y SKY [62]. Estas tecnologías se
basan en la hibridación simultánea de 24 sondas compuestas específicas de cromosomas.
Esta técnica es adecuada para la identificación de aberraciones cromosómicas sutiles que
incluyen un cromosoma no identificado (marcador cromosoma) y una translocación
cromosómica desequilibrada. Con respecto al diseño de la sonda, estas sondas de pintura
cromosómica se generan a partir de cromosomas humanos clasificados por flujo. Los
colores específicos de cada cromosoma se producen al etiquetar cada biblioteca de
cromosomas con un solo fluorocromo o con combinaciones específicas de fluorocromos
múltiples.
mBAND ha sido desarrollado para facilitar la identificación de reordenamientos
intracromosómicos y para mapear el punto de ruptura exacto mediante el uso de bibliotecas
de microdisección superpuestas humanas que están marcadas diferencialmente [64]. Las
bandas de color tienen un gran valor para delinear los intercambios intracromosómicos,
tales como inversiones, deleciones, duplicaciones e inserciones [6].
CGH se basa en un FISH de doble color cuantitativo en cada cromosoma [61]. CGH se
puede usar para detectar desequilibrios genéticos en genomas de prueba y para determinar
las posiciones del mapa cromosómico de ganancias y pérdidas de cromosomas completos o
subregiones cromosómicas presentes en preparaciones de metafase de referencia normales.
Una clara ventaja de CGH es que el ADN tumoral es el único requisito para este análisis.
Por lo tanto, también se pueden utilizar tejidos archivados, fijados con formalina y
embebidos en parafina. La CGH es útil para la investigación del cáncer, especialmente para
determinar el bajo índice mitótico de células malignas con mala morfología y resolución
cromosómica [66-68].
Los tremendos avances técnicos en citogenética han cambiado los enfoques utilizados para
el diagnóstico clínico y la investigación, en particular, el desarrollo de la tecnología CGH
(aCGH) para la "cariotipo molecular" con una resolución de 100 kb a 1 Mb [65]. aCGH
mejora en gran medida la resolución de esta técnica al sustituir los objetivos de hibridación,
la propagación del cromosoma en metafase, con segmentos genómicos marcados en un
formato de matriz. La complejidad de las aberraciones genómicas en la mayoría de los
tumores humanos dificulta la delineación de los genes que conducen el proceso
tumorigénico. Curiosamente, se ha demostrado que los modelos de ratón cognado
recapitulan estas alteraciones genéticas con una fidelidad inesperada [69]. Estos resultados
indican que el análisis de aCGH entre especies es una estrategia poderosa para identificar
los genes responsables y evaluar su capacidad oncogénica en el contexto genético
apropiado [69]. Las metodologías de microarray genómico desarrolladas recientemente,
que incluyen arrays basados en aCGH y polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), son
métodos innovadores que proporcionan datos genómicos para múltiples trastornos
neoplásicos [70-72]. Además, estos métodos pueden revelar información adicional
importante sobre la genética de trastornos específicos, como la leucemia con análisis
citogenéticos normales y FISH [73, 74]. En 2013, ACMG desarrolló normas y pautas
profesionales para ayudar a los laboratorios clínicos en la validación, el uso coherente y la
interpretación y el informe de los resultados de estas metodologías de microarrays [75].
RECURSOS CITOGENÉTICOS DEL CÁNCER
1. La base de datos Mitelman de aberraciones de cromosomas y fusiones de genes en el
cáncer
La base de datos Mitelman de aberraciones cromosómicas y fusiones de genes en cáncer
(http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) incluye una base de datos completa de
todos los cariotipos asociados a neoplasias publicadas y sus correspondientes fusiones de
genes. La información disponible sobre las anomalías cromosómicas en las neoplasias
humanas ha aumentado de manera constante durante las últimas tres décadas. Los datos en
esta base de datos han sido seleccionados manualmente de la literatura por Felix Mitelman,
Bertil Johansson y Fredrik Mertens. El número total de casos de tumores, en los que se
informaron aberraciones citogenéticas clonales, ha alcanzado 64.319, y la base de datos se
actualizó con la adición de 2.072 genes de fusión quiméricos en mayo de 2014 [76].
2. El Atlas de Genética y Citogenética en Oncología y Hematología.
El Atlas de Genética y Citogenética en Oncología y Hematología
(http://atlasgeneticsoncology.org/) [77], que se estableció en 1997, es un sitio de acceso
abierto, revista en línea, enciclopedia y base de datos dedicado a genes, citogenética y
entidades clínicas en el cáncer y las enfermedades propensas al cáncer. Hasta el momento,
aproximadamente 2.200 autores han contribuido al Atlas, lo que hace que haya 2.167
artículos de revisión disponibles. El Atlas contiene artículos revisados por pares sobre
1.135 genes, 503 entidades de leucemia, 177 tumores sólidos y 104 enfermedades
hereditarias con tendencia al cáncer. También contiene "tarjetas automatizadas" en otros
8.190 genes que están potencialmente implicados en el cáncer [78].

3. Nomenclatura citogenética.
En la comunidad de la genética médica, la interpretación y la comunicación científica a
menudo se ven facilitadas por una nomenclatura aceptada universalmente con términos
definidos y convenciones de sintaxis que minimizan la complejidad y agregan precisión al
proceso. La nomenclatura citogenética se basa en los informes de un comité internacional
que se estableció en 1960, conocido como el Sistema Internacional de Nomenclatura
Citogenética Humana (ISCN) [79]. La nomenclatura se actualiza periódicamente, más
recientemente en 2013 con directrices ampliadas para la citogenética del cáncer, FISH y
microarrays [45]. En el cáncer citogenético, un clon citogenético anormal se define como
una población de células con el mismo complemento cromosómico que se deriva de un solo
progenitor. Un clon debe tener al menos dos células con la misma aberración si la
aberración es una ganancia de cromosoma o un reordenamiento estructural. Si la anomalía
es la pérdida de un cromosoma, la misma pérdida debe estar presente en al menos tres
células para que se acepte como clonal. Sin embargo, en la versión actual de ISCN (2013),
dos células con pérdidas idénticas de uno o más cromosomas y la misma aberración (es)
estructural (es) pueden considerarse clonales y nuevamente incluidas [45]. Sin embargo, si
las dos células con la misma pérdida de un cromosoma individual o una célula con una
ganancia de un solo cromosoma en un cariotipo compuesto deben contarse e incluirse en el
tamaño del clon no se ha mencionado en el sistema de nomenclatura actual.
Recientemente, llevamos a cabo una encuesta piloto de las prácticas de notificación de la
pérdida o ganancia aleatoria de un solo cromosoma en los informes de citogenética clínica.
El cuestionario, que consistió en dos preguntas, se envió a 19 laboratorios citogenéticos del
cáncer en 13 condados y ciudades, y los invitamos a informarnos utilizando su sistema de
informes habitual (Tabla 1). En la pregunta 1, a los participantes se les presentó una
muestra de médula ósea de un paciente con AML con pérdida no clonal (aleatoria) de
cromosoma (s), y se les preguntó si estas metafases deberían considerarse normales e
incluirse en el tamaño de clon del cariotipo normal. . En la pregunta 2, a los participantes se
les presentó una muestra de sangre de médula ósea de un paciente con LMC con 19
metafases de t (9; 22) (q34;
q11.2) y una metafase con solo -5. Preguntamos si la metafase normal con una pérdida de
un cromosoma 5 debería informarse en el cariotipo final además de las 19 metafases de t (9;
22) (q34; q11.2). Para nuestra sorpresa, las respuestas no fueron unánimes. Para la pregunta
1, 11 de los 19 laboratorios (57,9%) informaron 46, XX [20], y los 8 restantes (42,1%)
informaron 46,
XX [9] (Tabla 1). Por lo tanto, el 57.9% de los laboratorios citogenéticos asumieron que las
metafases con pérdida no clonal de cromosomas eran normales, e incluían todas estas
metafases en el tamaño del clon del clon normal. La mayoría de los organismos de
acreditación de laboratorios requieren el "número total de metafases analizadas" en el
informe final. Por lo tanto, para el 42,1% de los laboratorios citogenéticos que informaron
46, XX [9], los médicos tienen una idea general de que el paciente tiene 11 metafases con
pérdida o ganancia de cromosomas no clonales entre las 20 metafases analizadas. Para la
pregunta 2, 8 de los 19 laboratorios (42.1%) reportaron 46,
XX, t (9; 22) (q34; q11.2) [19] y omitió la única metafase con -5; 7 laboratorios (36.8%)
informaron 46, XX, t (9; 22) (q34; q11.2) [19] / 46, XX [1] y contaron la única metafase
con -5 como un clon normal; y 4 laboratorios (21.1%) informaron 46, XX, t (9; 22) (q34;
q11.2) [19] / 45, XX, -5 [1] y simplemente anotaron la única metafase con -5 en el
Cariotipo final (Tabla 1). En conjunto, el comité permanente de ISCN debe continuar
discutiendo tales discrepancias y hacer esfuerzos para alinear el sistema de informes
utilizado por los laboratorios de citogenética [80].
Curiosamente, un informe de revisión de las encuestas de competencia CAP FISH entre
1997 y 2001 mostró que los errores de sintaxis eran mucho más comunes que los errores de
diagnóstico [81]. Además, los errores de sintaxis que son comunes en las encuestas de
competencia también son comunes en las encuestas FISH. Recientemente, dado que el
ISCN FISH completo es probablemente más difícil de entender para los médicos, la Red
Europea de Mieloma no recomienda el uso de ISCN FISH [46]. Por lo tanto, la mejora
continua de las directrices de nomenclatura para abordar algunos de estos problemas e
identificar la causa de estas variaciones es esencial [78, 82].

PERSPECTIVAS FUTURAS Y OBSERVACIONES FINALES

En las últimas cinco décadas, los avances técnicos innovadores en el campo de la
citogenética del cáncer han mejorado mucho la detección de alteraciones cromosómicas y
han facilitado la investigación y el potencial de diagnóstico de los estudios cromosómicos
en tumores malignos. El cariotipo de una sola célula sigue siendo la forma más fácil de
entender la relación entre la evolución clonal y la progresión de la enfermedad. El uso de
técnicas avanzadas de FISH permite la identificación de alteraciones cromosómicas que no
están resueltas por el cariotipo. Recientemente, se han desarrollado tecnologías de
micromatrices de ADN que proporcionan una visión de alta resolución de todo el genoma,
que puede generar grandes cantidades de información nueva sobre la genómica del cáncer.
Sorprendentemente, la citogenética del cáncer no solo proporciona información clave para
mejorar la atención de los pacientes con leucemia y varios tipos de cáncer, sino que
también actúa como una guía para identificar los genes responsables del desarrollo de estos
estados neoplásicos.
La investigación y el desarrollo continuos de los procedimientos de citogenética
automatizados incluyen: un recolector de metafases automatizado, un separador de
metafases automatizado, un teñidor de diapositivas de alto rendimiento, un buscador de
metafases de alto rendimiento, un cariotipo automatizado, un procesador de pretratamiento
FISH automatizado, un conteo automatizado de puntos FISH y un sistema de seguimiento
de muestras computarizado. Sin embargo, la microscopía sigue siendo una técnica esencial
para una revisión final de los cromosomas. Obviamente, los laboratorios de citogenética
necesitan obtener una mayor inversión de capital para mantenerse al día con las tecnologías
de avance rápido y robótica, ya que los costos de los equipos son actualmente altos.
El objetivo principal del laboratorio FISH es identificar las técnicas que son más útiles e
informativas para un estudio en particular y realizar análisis exhaustivos para llegar a una
interpretación que sea útil para fines de investigación y diagnóstico. Las características
únicas de los ácidos nucleicos peptídicos (ANP) permiten el uso de sondas más cortas, que
combinadas con la naturaleza hidrófoba del esqueleto peptídico, permiten que las sondas de
APN atraviesen más fácilmente el núcleo hidrófobo de las membranas celulares. Se puede
lograr una eficiencia de tinción de casi el 100% utilizando sondas teloméricas basadas en
PNA [83]. La longitud de los telómeros se puede medir por FISH cuantitativo en humanos
[84] y en otras células de vertebrados [85]. Recientemente, se demostró que la flexibilidad
inherente de las bibliotecas de oligonucleótidos sintetizados de novo tiene una poderosa
ventaja que podría ayudar en la visualización de la estructura genómica de escala fina de
alta resolución [86].
En el futuro, las terapias dirigidas encontrarán aplicaciones más amplias en la leucemia y el
cáncer. Oncología personalizada, además de FISH y la información sobre el objetivo de los
medicamentos para la toma de decisiones sobre el tratamiento, otros aspectos incluyen la
aplicación de marcadores genéticos para la estratificación del riesgo del paciente. Esto es
particularmente relevante para la CLL [87] y el mieloma múltiple. Dado que la población
neoplásica tanto en la CLL como en el mieloma múltiple es mitóticamente inactiva, el uso
de la FISH de interfase para la detección de anomalías genéticas juega un papel importante
en el pronóstico y la estratificación del riesgo de estos trastornos [88]. La identificación o
selección de células malignas por morfología, inmunofenotipificación o clasificación de
células plasmáticas es necesaria antes de que las sondas FISH puedan producir resultados
confiables [89]. Además, aunque la medicina genómica personalizada en la clínica puede
ser muy atractiva, existe la necesidad de una correlación clínico-patológica concisa y el uso
racional de métodos más rápidos y más rentables entre la gran variedad de pruebas
genómicas disponibles para la selección del fármaco-objetivo. Recientemente, la potencia y
la aplicabilidad de la secuenciación de todo el genoma para el diagnóstico de pacientes con
leucemia con fusión génica críptica ha demostrado y ha afectado enormemente el
tratamiento clínico y el pronóstico de estos pacientes. Sin embargo, los pacientes
leucémicos con reordenamientos genéticos crípticos a menudo pueden ser diagnosticados
sin un análisis completo del genoma, un procedimiento costoso, que requiere mucho tiempo
y es altamente especializado.
La citogenética convencional ahora se complementa con FISH y biología molecular.
También se ha informado un reordenamiento de PML / RARα críptico negativo para FISH
detectado por PCR a larga distancia y análisis de secuenciación [90]. Por lo tanto, se debe
realizar un análisis FISH si los hallazgos morfológicos, citogenéticos y moleculares son
inconsistentes. Se prevé que los esfuerzos realizados para la caracterización de los defectos
moleculares en las neoplasias se traducirán finalmente en mejores resultados clínicos para
los pacientes. En conjunto, las características morfológicas, de cariotipo, FISH y
moleculares deben considerarse para obtener diagnósticos precisos de tumores malignos.
Esto resalta la importancia clínica de un enfoque de modalidad combinada para el
diagnóstico y clasificación precisos de los cánceres.