UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHOMAN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

ESCUELA DE BIOLOGIA MICROBIOLOGIA

MONOGRAFÍA
“Virus vectores y terapia génica”

MATERIA:
Virología

PROFESOR:
Mblga. Liduvina Sulca Quispe

ALUMNOS:
Karen Alexandra Cabana Gil 2012-36899
Lorena Cinthia Vásquez Ticacala 2014-118031
Grisell Mamani Parihuana 2014-118008
Naomy Rivera Cahuana 2014-118015
Jersson Velasquez Tacora 2014-118016

TACNA – PERÚ

2017

1
 CONTENIDO

RESUMEN.................................................................................................................... 3
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 5
CAPITULO I ................................................................................................................. 6
INGENIERÍA GENÉTICA EN TERAPIA GÉNICA ........................................................ 6
1.1. DISEÑO GENERAL........................................................................................ 6
CAPITULO II ................................................................................................................ 9
TIPOS DE VECTORES ............................................................................................... 9
2.1 RETROVIRUS ................................................................................................ 9
2.2 ADENOVIRUS .............................................................................................. 12
2.3 VIRUS ASOCIADOS A ADENOVIRUS ........................................................ 15
2.4 VIRUS HERPES SIMPLEX (HSV) ................................................................ 16
CAPITULO III ............................................................................................................. 18
TERAPIA GÉNICA SOMÁTICA Y TERAPIA GÉNICA GERMINAL ........................... 18
CAPITULO IV ............................................................................................................. 21
TERAPIA GÉNICA IN VIVO YEX VIVO ...................................................................... 21
CAPITULO V .............................................................................................................. 23
TRANSFERENCIA GÉNICA o GENES DELIVERY ................................................... 23
5.1 GENES INTEGRADOS EN CROMOSOMAS................................................ 25
5.2 TECNICAS DE TRANSFERENCIA .............................................................. 27
5.2.1 GÉNICA DIRECTA ................................................................................ 28
5.2.2 INYECCIÓN DIRECTA DE ADN “DESNUDO” ..................................... 39
5.2.3 CONJUGADOS ADN-PROTEÍNAS ...................................................... 40
5.2.4 CONJUGADOS ADN –ADENOVIRUS .................................................. 42
5.2.5 LIPOSOMAS ......................................................................................... 44
5.3 MARCAJE CELULAR .................................................................................. 45
CAPITULO VI ............................................................................................................. 47
APLICACIONES ......................................................................................................... 47
6.2. TERAPIA GÉNICA PARA LA CORRECCIÓN DEL EXCESO DE FUNCIÓN
DE UNA PROTEÍNA ............................................................................................... 49
6.3. TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER ............................................................... 51
6.4. TERAPIA GÉNICA DE LA INFECCIÓN POR VIH........................................ 53
CONCLUSIONES ....................................................................................................... 57
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 59

2
 RESUMEN

La terapia génica es una estrategia terapéutica que implica la introducción

de material genético en los pacientes, con la finalidad de corregir las

deficiencias celulares expresadas en el fenotipo y sanar enfermedades

hereditarias o adquiridas. La terapia génica es de gran esperanza para los

pacientes que padecen alguna alteración genética u otra enfermedad ya

que se puede sustituir el gen alterado por otro normal.

La transferencia de genes se realiza por medio de vectores; estos son

sistemas que se utilizan en el proceso de transferencia de un gen

exógeno a la célula facilitando la entrada y la biodisponibilidad intracelular

del mismo. Los vectores se dividen en 1) virales: retrovirus, adenovirus,

virus adenoasociados y otros; 2) no virales: bombardeo de partículas,

inyección directa de ADN, liposomas catiónicos, transferencia mediante

receptores, entre otros.

Las principales aplicaciones de la terapia génica son: 1) enfermedades

hereditarias: hemoglobinopatías, inmunodeficiencias, etc; 2) cáncer; 3)

enfermedades auto inmunitarias: artritis reumatoide, lupus eritematoso

sistémico; y 4) otras como las infecciones: SIDA, las cardiopatías

3
isquémicas y otras. Muchas de las enfermedades genéticas y adquiridas

son potencialmente tratables con terapia génica; sin embargo, esta

terapéutica ha tenido grandes dificultades. Se han realizado estudios de

fase I y II con diversos vectores virales y no virales, pero hay problemas

por resolver, como la eficacia y la respuesta inmunitaria del huésped,

además de su inocuidad.

La terapia génica sigue siendo la esperanza para el tratamiento futuro de

varias enfermedades. Se espera que el progreso de la tecnología y los

nuevos vectores mejorarán la eficacia e inocuidad de esta terapia.

4
 INTRODUCCIÓN

Los vectores génicos han sido de estudio y búsqueda para encontrar

vectores más eficiente en el transporte de genes y su aplicación en

terapias le da una gran importancia debido a su eficacia en corregir las

enfermedades de células y las enfermedades hereditarias, Se ha

entendido que existen diversos tipos de vectores que se encuentran

estrechamente relacionados a los virus debido a su capacidad de

introducir material genético a sus célula huésped.

En la presente monografía abordaremos el tema de los vectores génicos,

sus tipos y la forma de trasferencia de los genes. Otro tema que

abordaremos es la terapia génica germinal y somática, siendo esta

última más desarrollada al poder darse in vivo y ex vivo, ambas muy

importantes para entender la maquinaria de reparación de errores de

células y errores hereditarios.

5
 CAPITULO I
INGENIERÍA GENÉTICA EN TERAPIA GÉNICA

1.1. DISEÑO GENERAL

Para poder remplazar la función de un gen, o sea, volver a fabricar la

proteína que éste codifica en su contexto celular adecuado, normalmente

se utiliza una copia en ADN del mARN (llamada cADN) de esta proteína

clonado en el contexto de un vector de expresión. Este es un

“minicromosoma” circular cuyas características más importantes son que

es capaz de reconducir la fabricación de la proteína que nos interesa

dentro de un contexto celular correcto y que se puede cultivar fácilmente

en el laboratorio para producir cantidades suficientes para su utilización

en ensayos o terapias específicas. Los vectores de expresión por lo

general incluyen material genético procedente de plásmidos (moléculas

de ADN extracromosomales de ciertas bacterias) y material genético

procedente de virus eucariotas como el virus vaccinia, el citomegalovirus,

o más recientemente algún retrovirus.(Isamat, 2007)

El minigen de interés se posiciona tras un promotor activo en la célula

diana y a partir de la cual se comienza la transcripción a RNA y

posteriormente a proteína. Los promotores funcionan (empiezan a

transcribir) por la acción de los factores de transcripción propios de la

célula sin los cuales el minigen no podría expresarse. Así podemos hablar

6
de la utilización casi secuestrada de los mecanismos naturales de una

célula para producir la proteína deseada, algo que se debe tener en

cuenta para diseñar vectores de expresión que fabriquen la proteína

codificada por el minigen en el tipo celular diana, y no en otros tejidos

celulares donde la expresión de la misma proteína pudiese causar

problemas. Para ello es importante delimitar la especificidad tisular de la

región promotora que se incluye en el vector de expresión, es decir,

comprobar que responda a los factores de transcripción específicos del

tejido diana en el cual se debe expresar la proteína.(Isamat, 2007)

La medicina clásica ha abordado las enfermedades hereditarias

tratando las consecuencias biológicas de una mutación; el objetivo de la

terapia génica es corregir esa mutación y prevenir así sus consecuencias

biológicas. La mutación de un gen puede tener varios desenlaces:

(Isamat, 2007)

a) La proteína deja de fabricarse,

b) La proteína se fabrica pero su función es nula o escasa,

c) La proteína se fabrica pero su función es excesiva.

Cualquiera de estas alteraciones puede resultar en un mal

funcionamiento de una célula y consecuentemente del tejido que utilizan

7
el producto génico normal, causando enfermedad. El método de

transferencia del gen terapéutico dependerá de los objetivos terapéuticos.

El enfoque terapéutico de los casos “a” y “b” citados, cuando la proteína

en un tejido específico deja de fabricarse, o se fabrica pero su función es

deficiente, comparten en cierto modo el diseño básico de reinserción de

un gen para el aporte continuo de su proteína en un tejido específico, o

corrección de la deficiencia de la proteína correspondiente. Esta es la

estrategia preferida para la terapia génica de enfermedades hereditarias

monogénicas del tipo de la hemofilia, fenilcetonuria o la deficiencia de

ADA (adenosin-desaminasa),odas ella provocada por la falta de una

proteína debida a la mutación heredada de su gen correspondiente. En el

caso “c”, cuando la función de la proteína es excesiva, el enfoque

terapéutico cambia, y el interés se centra en el silenciamiento de una

proteína fabricada desde un gen endógeno de la célula. En este caso la

estrategia se dirigirá a evitar la producción de una proteína celular, o a

provocar la muerte celular específica de la célula que contenga el gen

mutado. (Isamat, 2007)

8
 CAPITULO II
TIPOS DE VECTORES

2.1 RETROVIRUS

Los retrovirus son virus de ácido ribonucleico (ARN) que pueden

encontrarse en diversas especies animales. El ARN viral contiene la

información genética viral. Luego de infectar la célula, el ARN es

convertido en ácido desoxiribonucleico (ADN). El ADN viral se inserta al

azar en el genoma de la célula y de esta manera se convierte en parte de

ella, replicándose cada vez que la célula infectada se replica y

expresando los genes virales en respuesta a diversas señales celulares.

Un sistema retroviral para terapia genética necesita de dos

componentes: el vector de expresión, el cual lleva el gen terapéutico y la

célula empaquetadora . El vector retroviral está desprovisto de genes

virales, dejando espacio para llevar el gen terapéutico. En el vector se

conservan las secuencias de nucleótidos que sirven de señales para

empaquetar la partícula viral y para lograr la inserción dentro del genoma

celular. Este material genético es introducido dentro de la célula

empaquetadora, la cual produce las proteínas virales necesarias para la

formación de una partícula viral. El vector viral es producido y liberado al

sobrenadante del cultivo celular. Este sobrenadante es utilizado para

infectar las células o el tejido objetivo. Una vez que la célula objetivo es

9
infectada, el material genético viral se integra al genoma celular. La

ausencia de genes virales asegura que no haya producción de partículas

virales. Luego de ser integrado, el gen terapéutico se expresa utilizando

las enzimas de la célula hospedera .

Figura N°01: Sistema de vector retroviral

Fuente:desconocida

Una de las preocupaciones en el desarrollo inicial de los vectores

retrovirales fue la posibilidad de inserción del ADN retroviral cerca de

genes que controlan la división celular (oncogenes), y así hacer que la

célula se vuelva cancerosa. Modelos matemáticos han demostrado que

esta posibilidad es muy pequeña para ser considerada significativa. Es

10
necesario que el retrovirus sea capaz de replicarse y lo haga por muchos

ciclos antes que haya una chance importante. En la práctica, luego de

múltiples protocolos que han incluído cientos de pacientes, no se han

reportado casos de transformación maligna debido a vectores retrovirales.

Un estudio experimental en monos reportó la ocurrencia de leucemia

posiblemente inducida por el vector retroviral, pero también se demostró

que el vector había recombinado y era capaz de replicarse. Desde

entonces, se han desarrollado nuevas generaciones de vectores y células

empaquetadoras, con modificaciones específicas de las secuencias que

determinan la producción de partículas virales y con mayores márgenes

de seguridad para impedir la recombinación de los vectores y reducir aún

más la posibilidad de generar virus con capacidad de replicación .

El vector retroviral ha sido el más utilizado en los protocolos de

terapia genética, debido a la relativa facilidad de construcción de la

expresión del gen transferido. El mayor problema de estos vectores es

producir sobrenadantes con altas concentraciones (títulos) de vectores,

pues la eficiencia de la transferencia de genes depende de estos títulos.

Se han mejorado los métodos de producción y se están ensayando

vectores utilizando proteínas de envoltura de otros virus, como la

envoltura del virus de la estomatitis vescicular (VSV), la cual permite una

mayor producción de partículas virales por célula. El vector retroviral

11
requiere que las células objetivo estén dividiéndose, pues es necesario

que la membrana nuclear desaparezca para permitir la integración del

material genético retroviral. Este requerimiento limita el universo de tejidos

y células que pueden utilizarse; sin embargo, la preferencia por células en

división es aprovechada en la terapia genética del cáncer, para introducir

genes que modifiquen sólo las células cancerosas y no el tejido sano. Una

alternativa para el uso de vectores retrovirales en células que no se

dividen son los lentivirus, como el virus de la inmunodeficiencia humana

(VIH). Sin embargo, estos retrovirus son de mayor complejidad y los

vectores desarrollados hasta el momento no han podido ser producidos

en títulos suficientemente altos para ser eficientes en las transducción del

gen terapéutico, aunque la capacidad de poder infectar células que no se

dividen ha sido demostrada en neuronas y en otras líneas celulares

irradiadas.

2.2 ADENOVIRUS

Los adenovirus son virus de ADN de doble hebra, que producen

infecciones del tracto respiratorio, y tienen tropismo por los epitelios

respiratorio, gastrointestinal, y de la córnea. Para construir los vectores de

adenovirus se han eliminado los genes de las proteínas tempranas E1a,

E1b, E2 y E3, esenciales para la replicación viral. Estas modificaciones

hacen al adenovirus deficiente, además de generar espacio para insertar

12
el gen terapéutico. Los vectores de adenovirus pueden transducir genes

de mayor longitud que los que pueden ser transducidos por vectores

retrovirales.

Los vectores de adenovirus tienen gran eficiencia de transducción,

aún en células que no están proliferando y pueden producirse en grandes

concentraciones. Su tropismo por células epiteliales los hace bastante

versátiles. Están siendo utilizados para el desarrollo de terapia genética

para las dos enfermedades pulmonares hereditaria más frecuentes, la

fibrosis quística y la deficiencia de anti-tripsina. Además, utilizando a los

hepatocitos como células hospederas, se están ensayando vectores de

adenovirus para el tratamiento de las deficiencias de factores de

coagulación y de enzimas responsables del metabolismo de lípidos y

carbohidratos.

Una importante característica de los adenovirus es que el material

genético viral no se integra al genoma de la célula hospedera y se

mantiene episomal. Esto hace que el riesgo de producir mutagénesis por

inserción sea prácticamente nulo; sin embargo, la expresión del gen

terapéutico en células que se están replicando se pierde con el transcurso

del tiempo, pues no se divide con la célula. En experimentos in vivo, la

expresión del gen terapéutico es bastante eficiente al inicio, pero luego se

desvanece, entre uno y seis meses después. Un fenómeno que

13
contribuye a la expresión transitoria del gen es el desarrollo de una

respuesta inflamatoria, caracterizada por el aumento de interleuquinas, la

aparición de anticuerpos contra proteínas de adenovirus y de síntomas

clínicos inespecíficos, como fiebre y malestar general. A pesar de haberse

eliminado la capacidad de replicación viral, aún se desarrolla una fuerte

respuesta inmune contra las proteínas de las partículas virales, teniendo

como consecuencia la desaparición de las células que albergan al gen

terapéutico. Sin embargo, esta desventaja puede ser aprovechada en

protocolos de terapia genética que requieren de una expresión temporal

del gen terapéutico. Por ejemplo, la inducción de inmunidad a células

cancerígenas puede realizarse expresando proteínas que aumentan el

reconocimiento de estas células por el sistema inmune. Si resulta efectivo,

las células cancerígenas perecerán y la duración temporal de la expresión

del gen no tendrá significado.

14
 Figura N°02: Adenovirus
Fuente:desconocida

2.3 VIRUS ASOCIADOS A ADENOVIRUS

Estos virus pertenecen al grupo de parvovirus humanos, y son

naturalmente deficientes en replicación, pues necesitan de la coinfección

con adenovirus o virus de herpes simplex para iniciar el ciclo de

replicación viral. Algunos estímulos celulares pueden también

desencadenar la replicación del VAA, sin necesidad de la coinfección con

otros virus, tales como la radiación gamma, la luz ultravioleta o el uso de

hidroxiurea. No se ha encontrado evidencia que los asocie con alguna

enfermedad, pese a su alta prevalencia. Sorprendentemente, la infección

15
con parvovirus es correlacionada inversamente con la incidencia de

carcinoma de cuello uterino. Algunos estudios sugieren que el

responsable de este fenómeno es uno de sus genes, rep, que tiene

características pertenecientes al grupo de genes supresores de tumores .

Los vectores basados en VAA transducen genes a diferentes tipos

celulares con gran eficiencia, y no necesitan estar en estado proliferativo.

No produce inflamación o alguna respuesta inmune significante y

generalmente se integra específicamente en el cromosoma 19, en

secuencias que no codifican genes.

Esta última propiedad es importante, pues disminuye el riesgo de

transformación maligna de la célula. La mayor desventaja es la poca

capacidad para el tamaño del gen terapéutico, que sólo puede ser hasta

de 4.7 kb. El proceso de purificación puede ser difícil en algunos casos,

cuando la presencia de adenovirus contaminante es importante.

2.4 VIRUS HERPES SIMPLEX (HSV)

Los virus del Herpes Simplex son virus de ADN de doble hebra, con

tropismo por las células del sistema nervioso. Estos virus establecen una

infección latente en las neuronas, generalmente benigna. El virus se

replica en el epitelio ocular o en el orofacial, invade terminaciones

nerviosas locales, asciende a los ganglios utilizando el transporte

16
retrógrado axonal y se mantiene en las neuronas sensoriales en un

estado latente. El virus es reactivado sólo bajo ciertos estímulos celulares,

en los cuales se induce la expresión de proteínas tempranas, y se inicia el

ciclo de lisis y replicación.

Para la construcción de un vector basado en el HSV se han utilizado

dos estrategias, una de ellas es similar al utilizado para los vectores de

adenovirus, en este caso se elimina las secuencias de genes que

expresan las proteínas tempranas ICPO, ICP4, ICP22 y ICP27, haciendo

un vector deficiente para replicarse. Genes de hasta 15 kb pueden ser

transducidos por un vector de HSV. La segunda estrategia consiste en

construir un "mini-HSV", con las mínimas secuencias necesarias para la

formación de la partícula viral y la infección de la neurona. Requieren de

algunas proteínas para la formación de la partícula viral y la infección de

la neurona a través de una célula empaquetadora. Los sistemas de

vectores basados en HSV necesitan de mayores pruebas de seguridad,

pues la patofisiología de la infección viral no está del todo esclarecida.

Los primeros ensayos con vectores de HSV han presentado cierto grado

de citotoxicidad no esperada y son necesarias mayores modificaciones

que eliminen este fenómeno. (Chinen, 2000)

17
 CAPITULO III
TERAPIA GÉNICA SOMÁTICA Y TERAPIA GÉNICA GERMINAL

La terapia génica hace referencia a dos tipos de enfoques

conceptualmente diferentes. Todos los ensayos clínicos de terapias

génicas llevados a cabo en humanos, tienen como objetivo la corrección

de un defecto genético en células somáticas, es decir, en las células que

no son ni espermatozoides ni óvulos.

Terapia génica somática es aquella dirigida a modificarla dotación

genética de células no germinales, es decir, de las células somáticas o

constituyentes del organismo. Por ello, la modificación genética no puede

transmitirse a la descendencia. Por consenso general entre los

investigadores y con la legislación actual, basada en motivos éticos y de

seguridad, solamente se llevan a cabo protocolos clínicos en este tipo de

terapia génica. En principio, la terapia génica somática no ha sido motivo

de reservas éticas, salvo las relacionadas con su posible aplicación a la

ingeniería genética de potenciación, es decir, toda manipulación genética

cuyo objetivo sea potenciar algún carácter, como la altura, sin pretender

tratar enfermedad alguna. (PA., 1996)

18
 Figura N°03: Terapia genica y somatica y germinal
Fuente:desconocida

La terapia génica somática ha centrado sus actuaciones sobre

enfermedades hereditarias bien definidas cuyo defecto genético reside en

un único gen, las llamadas enfermedades monogénicas. Estas podrían

ser del tipo de las hemofilias, fenilcetonuria, deficiencia de ADA

(adenosina desaminasa), fibrosis quística, distrofia muscular,

hipercolesterolemia familiar, etc.

Enfermedades hereditarias cuyo defecto genético es fácilmente

confirmable en los portadores, y altera el funcionamiento de un tipo celular

19
concreto y más o menos accesible a los genes terapéuticos externos. Las

enfermedades provocadas por la alteración de más de un gen, opor la

falta de coordinación de varios genes, las llamadas poligénicas, son

lógicamente más complejas de abordar y de momento se desestima la

terapia génica para su posible tratamiento.

El cáncer es una excepción, ya que aunque el cáncer engloba más

de doscientas enfermedades diferentes, todas tienen en común los

mismos mecanismos de enfermedad: la división celular incontrolada y/o la

ausencia de muerte celular programada. Ambos mecanismos son

controlados genéticamente y regulados por más de un gen. El cáncer

responde a la acumulación de errores o mutaciones durante la vida del

individuo en más de un gen de los que controlan la división y la muerte en

una misma célula somática y ésta acaba generando el tumor. Por ello, el

cánceres estrictamente una enfermedad poligénica. No obstante, la

terapia génica se ha utilizado en ciertos modelos de tumores con el fin de

activar el suicidio de las células cancerosas.(Carreras MJ, 2001)

Antes de poder evaluar los ensayos de terapia génica en humanos,

es importante entender cuáles son las dificultades técnicas de la

introducción de un gen terapéutico en una célula. Para ello se debe

primero distinguirlos dos tipos básicos de la terapia génica somática. La

terapia génica in vivo y la terapia génica ex vivo.

20
 CAPITULO IV
TERAPIA GÉNICA IN VIVO YEX VIVO

Esta clasificación de la terapia génica responde al lugar donde se

produce la manipulación genética de las células. La terapia génica in vivo

aborda la modificación genética de la célula en el interior del organismo,

osea, la introducción del gen terapéutico en el lugar normal de

“residencia” de la célula en un organismo. Por ejemplo, la modificación de

células pulmonares o hepáticas con una versión correcta del gen de la

alfa-1 antitripsina en pacientes con enfisema pulmonar ocirrosis fruto de

esta deficiencia, o en la introducción del gen de la distrofina en tejidos

musculares en pacientes de distrofia muscular. En el caso de la

terapiagénica ex vivo, la manipulación genética ocurre fuera del

organismo, en un tubo de ensayo. En este caso, se extraen las células del

paciente, se cultivan en el laboratorio, se les introduce el gen terapéutico

y se reinfunden en el paciente. (PA., 1996)

Este proceso es más fácil con células del sistema hematológico. La

obtención de médula ósea, purificación de células madre, su manipulación

en el laboratorio, y la introducción de la célula madre con la versión

funcional de un gen devuelta en el paciente ha servido por ejemplo para el

21
tratamiento de la inmunodeficiencia combinada severa (SCID) por

deficiencia de ADA. La introducción del gen ADA funcional en las células

progenitoras del sistema inmunológico han curado ya a niños con SCID,

los conocidos como niños burbuja, en unos ensayos clínicos.

Figura N°04: Terapia genica in vivo y ex vivo

Fuente:desconocida

22
 CAPITULO V
TRANSFERENCIA GÉNICA o GENES DELIVERY

El problema de cómo hacer llegar un gen terapéutico a una célula

diana deficitaria de esa función es el mayor obstáculo de la transferencia

génica, más conocida por la expresión inglesa gene delivery. Este

proceso es particularmente difícil en la terapia génica in vivo, ya que los

tejidos u órganos diana, o los focos tumorales ocultos, no siempre son

accesibles. Para cualquier tipo de gene delivery se necesita un vector de

transferencia que transporte, proteja y transfiera el gen terapéutico de

forma segura y eficaz y que además le confiera la especificidad de

alcanzar únicamente a las células diana.

El vector es la clave del éxito de la terapia génica. Un virus es algo

más que un grupo de genes que se autorreplican cubiertos de una

cobertura con proteínas que le dan entrada específica a un tipo celular

concreto. Por ello, tradicionalmente, se ha aprovechado el cromosoma de

virus humanos con especificidad natural para determinados tejidos,

después de haber reemplazado algún segmento génico que le confiriera

virulencia al virus, por el gen terapéutico. (PA., 1996)

Actualmente también se están desarrollando otro tipo de vectores no

basados en virus. Esto se debe al peligro que encierra el desconocimiento

que tenemos sobre la posibilidad de recombinación de los vectores víricos

23
con virus endémicos latentes en el ser humano, y la posibilidad de

generar nuevos virus con capacidad infecciosa desconocida, tanto para el

paciente tratado como para el resto de la sociedad. Sobre todo con los

retrovirus, cuya capacidad de inserción en el cromosoma celular ha sido

vista en los últimos años como una gran ventaja para este tipo de

terapias. Inicialmente se deseaba que el objetivo de inserción del gen

terapéutico en el cromosoma celular fuese el lugar preciso de su versión

defectuosa. Esto es muy difícil de controlar y ahora sabemos que no es

necesario, y que el gen terapéutico se puede integrar y producir la

proteína o ejercer su función curativa desde otras localizaciones, ya sean

dentro del cromosoma o de forma extracromosomal, como es el caso de

los episomas o minicromosomas autónomos.

Los principales tipos de vectores son:

Los Retrovirus, los Adenovirus, los virus asociados a los adenovirus, los

liposomas y el DNA desnudo (o nakedDNA).

24
 Figura N°01: Vectores de terapia genica
Fuente:desconocida

5.1 GENES INTEGRADOS EN CROMOSOMAS

La ventaja de que el gen se integre en el cromosoma es que puede

perpetuarse por replicación cromosómica tras la división celular. Como las

células de la progenie también contienen los genes introducidos, se

puede obtener una expresión estable a largo plazo. Así, en los tejidos

formados por células en división activa, la clave es dirigir la modificación a

las células madre (una población minoritaria de células precursoras

indiferenciadas que dan lugar a las células diferenciadas maduras del

tejido). Además, las células madre no sólo dan lugar a las células

maduras del tejido, sino que al mismo tiempo se renuevan ellas mismas.

En consecuencia, se trata de una población inmortal de células a partir de

la cual deriva el resto de células del tejido. La transferencia eficiente de

genes a las células madre y la posterior estable expresión del gen estable

25
ofrece, por tanto, la posibilidad de curar un trastorno genético.(Lazo,

1996)

No obstante, la integración cromosómica tiene sus inconvenientes

debido a que la inserción suele ocurrir casi al azar: la localización de los

genes insertados puede variar enormemente entre células. En algunos

casos, los genes insertados pueden no expresarse debido a su inserción

en regiones muy condensadas. En algunas ocasiones, la integración

puede provocar la muerte de la célula huésped (por ejemplo, por inserción

en un gen crucial, inactivándolo). Este tipo de acontecimientos tiene

consecuencias únicamente para la célula en la que sucede la integración.

Una preocupación mayor es el riesgo de cáncer: la integración puede

perturbar los patrones normales de expresión de genes que controlan la

división o la proliferación celular, por ejemplo a través de la activación de

un oncogén o de la inactivación de un gen supresor de tumores o de un

gen implicado en la apoptosis (= muerte celular programada). La terapia

génica ex vivo ofrece al menos la oportunidad de seleccionar las células

en las que la integración ha tenido éxito, gracias a que se amplifica a

estas células en cultivo.

26
5.2 TECNICAS DE TRANSFERENCIA

Para alcanzar un determinado efecto biológico en terapia génica es

necesario introducir de manera eficaz la secuencia génica de interés en la

célula diana y conseguir su expresión. Estos objetivos suponen contar con

un adecuado sistema de vehiculización o transferencia y, al mismo

tiempo, disponer de promotores adecuados para conseguir la máxima

expresión del gen insertado en la célula. (Helena Curtis, 2008)

La introducción en una célula de material genómico foráneo se

denomina transferencia génica, transducción o transfección. Los

principales sistemas de transferencia pueden agruparse en dos tipos: los

métodos físico-químicos y los vectores virales. Los métodos de

transferencia génica físico-químicos o no virales fueron los primeros en

ser desarrollados.

En estos métodos el ADN foráneo o exógeno está integrado en un

plásmido, que es una molécula de ADN que puede ser mantenida de

manera episómica, es decir, de forma estable e independiente del

genoma de la célula huésped.

27
 En general, presentan las siguientes ventajas: son sencillos de

preparar, lo que permite su producción de forma industrial; no tienen

limitaciones en cuanto al tamaño del ADN que pueden transferir; son poco

tóxicos; y no son inmunogénicos.

Los inconvenientes de estos métodos son su baja eficacia de

transducción de las células diana y que algunos de ellos sólo pueden

utilizarse in vitro.

5.2.1 GÉNICA DIRECTA

Además de las técnicas de transferencia génica basadas en el uso de

Agrobacterium, existen otro tipo de técnicas basadas en la utilización de

tratamientos químicos, físicos y eléctricos para introducir DNA en las

células. Estas técnicas son denominadas comúnmente como técnicas de

transferencia génica directa (DGT). (Helena Curtis, 2008)

28
 a) BOMBARDEO CON MICROPROYECTILES

El bombardeo con microproyectiles o biolística, es el

método alternativo al plásmido Ti más importante para

transferir DNA a plantas. La técnica consiste en bañar

partículas esféricas de oro o tungsteno

(aproximadamente de 0,4-1,2 micrómetros de diámetro,

o del tamaño de algunas células bacterianas) con DNA,

el cual ha sido precipitado con CaCl2, espermidina o

polietilen glicol. Las partículas bañadas con DNA son

aceleradas a altas velocidades (300-600 metros /

segundo) con un equipo especial llamado pistola de

partículas (o pistola de genes). La versión original de

esta pistola de partículas utilizaba una pequeña cantidad

de pólvora para acelerar las micropartículas.(Jeremy

Mark Berg, 2007).

Actualmente se usa helio a altas presiones como fuente

para la propulsión. Los proyectiles acelerados van a

penetrar la pared celular y la membrana de la célula,

aunque la densidad de partículas utilizadas no va a

resultar significativamente dañina para la misma. El

alcance de la penetración de las partículas en las células

29
vegetales puede ser controlado variando la intensidad

del estallido, alterando la distancia que las partículas han

de atravesar para alcanzar la célula o utilizando

partículas de diferentes tamaños.

Una vez dentro de la célula, el DNA se separa de las

partículas y, en algunos casos, es integrado dentro del

genoma de las plantas. El bombardeo con

microproyectiles es utilizado para transferir DNA

exógeno a suspensiones celulares de plantas, a cultivos

de callos, a tejidos meristemáticos, a embriones

inmaduros y a polen, todos ellos obtenidos a partir de un

amplio rango de plantas diferentes, incluidas

monocotiledóneas y confieras, plantas menos

susceptibles de la infección por Agrobacterium. Además,

este método ha sido utilizado para transferir DNA a

cloroplastos y mitocondrias.(Barros, 2099)

De forma convencional, los plásmidos de DNA disueltos

en tampón son precipitados sobre la superficie de los

microporoyectiles. Este procedimiento tiene como

objetivo aumentar la frecuencia de células transformadas

al aumentar la cantidad de plásmido de DNA; no

30
obstante, una elevada cantidad de plásmido puede

resultar inhibitoria. Se estima que aproximadamente

10,000 células son transformadas con cada bombardeo.

Con esta técnica, las células transformada, que son

detectadas por la expresión de unge marcador, a veces

solo expresan el DNA transferido de forma transitoria.

La configuración de los vectores que son utilizados en

biolística para introducir genes foráneos a plantas influye

tanto en la integración como en la expresión de dichos

genes. De este modo, la transformación resulta más

eficaz cuando se usa DNA linear en vez de circular.

Además, los plásmidos de tamaños superiores a 10 Kb,

a diferencia de los pequeños, pueden ser fragmentados

durante el bombardeo con microproyectiles, produciendo

una tasa menor de células transformadas. Aun así, si el

fragmento de DNA que se va a incorporar en el genoma

de la planta es de gran tamaño, este va a ser introducido

utilizando cromosomas artificiales de levadura (YACs),

queque están diseñados para contener marcadores de

selección de la planta, así como marcadores de

selección de levaduras. Como un sistema para verificar

31
si la transformación de las células vegetales ha tenido

lugar, distintas cantidades de DNA obtenidas de

Cochliobolus heterostrophus son clonadas en el vector,

de modo que la talla del YAC será de 80 a 550 kb.

Posteriormente, el vector con el DNA del hongo será

transferido a las células vegetales. Aquellas células

transformadas resistentes al antibiótico kinamicina serán

aisladas. Se confirmará posteriormente la presencia en

estas células del segundo gen marcador, el cual va a

conferir resistencia al antibiótico higromicina, y que se

encuentra localizado en el otro brazo del vector YAC. La

presencia de ambos genes marcadores en las células

transformadas indica que el vector completo, así como el

DNA foráneo presente en el mismo, ha sido transferido

de forma eficaz.(Jeremy Mark Berg, 2007)

El método de bombardeo de micropartículas es una de

las técnicas de transferencia génica más importante, ya

que por su naturaleza totalmente física, es

independiente del tipo de célula blanco y ha sido

utilizado no sólo para introducir ADN exógeno a células

vegetales, sino a células de una gran variedad de

32
organismos tales como bacterias, algas, hongos, células

animales, y aún animales y plantas intactas.

La biobalística ha sido utilizada con éxito para producir

plantas transgénicas a partirde una gran variedad de

tejidos vegetales, entre los que se incluyen hojas,

meristemos, embriones en desarrollo, embriones

maduros, callos embriogénicos, suspensiones celulares,

etc. Los principales logros en la obtención de plantas

transgénicas por medio de este método, incluyen

especies de gran interés económico como son la soja, el

maíz, el arroz, el sorgo, la papaya, la caña de azúcar, el

trigo y el espárrago. También se ha utilizado para

transformar microorganismos como levaduras, el moho

Aspergillus y el alga Chlamydomonas.

Esta metodología de transformación tiene ciertas

limitaciones. Algunos tejidos oponen una resistencia

natural a la penetración de las partículas, dada por

cutículas endurecidas, paredes celulares lignificadas o

superficies vellosas. Sin embargo, los principales

limitantes del método continúan siendo la baja relación

entre el total de células sometidas al bombardeo y el

33
número de células que logran incorporar de manera

permanente la información genética transferida.

b) MICROINYECCIÓN

La transformación estable vía inyección de DNA en el

núcleo celular (Jaenish , R , Mintz B, 1974)es una

técnica que ha sido aplicada en células animales desde

hace ya veinte años, convirtiéndose en el método de

transferencia génica más utilizado, sobre todo en

mamíferos. La microinyección ofrece la ventaja de que

es uno de los dos métodos, junto con la transformación

mediada por láser, que permite la transferencia génica a

una célula concreta. La célula continuarás su desarrollo

y es transgén expresado lo hará también en su progenie.

Esto constituye una poderosa herramienta para analizar

la expresión génica diferencial en distintos tipos

celulares y para el marcaje de células en el estudio de

morfogénesis vegetal.

En plantas la aplicación de la microinyección resulta más

dificultosa que en animales y, aunque se han hecho

34
importantes avances en la aplicación de esta técnica en

células vegetales, su uso continua resultando muy

complicado. La principal dificultad que se encuentran en

plantas es la presencia de pared celular, la cual no es

solo una barrera física que hace necesario el uso de

capilares mucho más gruesos para llevar a cabo la

microinyección, sino que también dificulta mucho la

visualización del núcleo, lo que hace que la

microinyección tenga lugar muchas veces en el

citoplasma.

Otro problema es la presencia de grandes vacuolas en

las algunas células vegetales, pues si el DNA es

transportado a su interior, este será degradado antes de

alcanzar el núcleo.

En los primeros estudios, la dificultad de atravesar la

pared celular para llevar a los investigadores a utilizar

sistemas de protoplastos. A mediados de los años

ochenta, se consiguió llevar a cabo la transformación de

tabaco y alfalfa vía microinyección de protoplasto con el

plásmido de DNA de Agrobacterium. Un año después,

35
consiguió llevarse a cabo de forma exitosa la

microinyección de cromosomas aislados (Barros, 2099)

A pesar de que la microinyección es una de las técnicas

de transferencia génica másprecisa, pues permite

introducir el DNA en compartimentos específicos, las

dificultades de su aplicación hacen que hoy en día, no se

plantea la aplicación de la microinyección como una

técnica de transformación rutinaria, aunque si puede

utilizarse para la introducción de DNA en determinadas

células.

c) MACROINYECCIÓN

La trasformación mediante la inyección de DNA en el

interior de cavidades que contienen meristemos u

órganos sexuales de la planta parece ser un paso obvio

para la introducción de DNA en la planta. Esta técnica

ofrece la oportunidad de un mayor y más íntimo contacto

entre el DNA y la línea germinal. (Jaenish , R , Mintz B,

1974)

La metodología de esta técnica es sencilla: la solución

que contiene el plásmido de DNA será inyectado en la

36
cavidad que rodea la inflorescencia en desarrollo. El

inconveniente es que será necesario utilizar una gran

cantidad de plásmido. La potencial ventaja de esta

técnica es por tanto su simplicidad, ya que puede ser

utilizada en todas las plantas sin necesidad de la

preparación de cultivos tisulares.

En los primeros estudios llevados a cabo, se utilizó DNA

genómico de plantas que contenía genes cuyo efecto

podía ser valorado morfológicamente. Algunos estudios

afirmaron la transformación, mientras otros dieron

resultados negativos, como consecuencia de la difícil

interpretación de los resultados a causa de las

contaminaciones que pueden ocurrir cuando se utilizan

genes marcadores naturales de la planta.

El interés en esta técnica aumentó en 1987 cuando se

consiguió la transformación del centeno mediante la

inyección de DNA en el floral tiller (Romero, 2009)). En

este trabajo, se utilizó el gen de la neomicina

fosfotransferasa como marcador y la evidencia de la

transformación se basaba en la selección con kinamicina

37
y el análisis por Southern, aunque la transmisión a la

progenie no pudo ser confirmada.

d) ELECTROPORACIÓN

El principio de esta técnica de transformación se basa en

el conocimiento de que la aplicación en la membrana

celular de pulsos eléctricos cortos y de alto voltaje hace

que en esta aparezcan, de forma temporal, poros que

van a permitir la entrada en el interiorde la célula de

macromoléculas presentes en la solución extracelular

.Los poros van a crearse en el componente lipídico de la

membrana, por lo que tras el tratamiento, la membrana

volverá a su estado normal. Este proceso permite a las

células suspendidas en un tampón con plásmidos de

DNA incorporar al interior celular el ADN tras la

electroporación, resultando en una trasformación

transitoria o estable. Inicialmente, la aplicación de la

electroporación como método de transformación fue

desarrollada en bacterias, levaduras y sistemas

animales.

38
 La electroporación es un método relativamente sencillo,

aunque su aplicación aprotoplastos es relativamente

difícil, como consecuencia de las limitaciones técnicas

que supone el cultivo y la regeneración de protoplastos.

No obstante, está técnica comenzó a utilizarse ya a

principios de los ochenta, asumiendo de forma general

que la pared celular no es permeable a macromoléculas

del tamaño de los ácidos nucleicos, por lo que se

requería un tratamiento con pectinasas.(Barros, 2099)

5.2.2 INYECCIÓN DIRECTA DE ADN “DESNUDO”

Esta estrategia supone la inyección directa de ADN sin ningún

revestimiento lipídico o proteico en el interior de la célula. La especificidad

en protocolos in vivo sigue resultando un problema aunque esta variante

terapéutica ha sido utilizada con cierto éxito en la inmunización contra

enfermedades o contra ciertos tipos de cáncer. El ADN desnudo posee la

cantidad mínima de ADN para evitar su degradación y pérdida durante la

división celular, quedando protegido en el interior de la célula por

elementos que permiten su replicación en cada división celular como si

fuese un mini cromosoma artificial.(Isamat, 2007)

39
 En esta técnica, el ADN es vehiculizado en una solución salina o

sérica y normalmente administrado mediante inyección intramuscular. El

mecanismo por el que entra en la célula diana permanece siendo un

enigma. Esta técnica presenta un porcentaje bajo de transfección y no se

logra la integración en el genoma. Se utiliza en la terapia génica in vivo,

aunque los calores y persistencia de la expresión de genes son

probablemente demasiado cortos.(Rozaléna, 2003)

Entre sus ventajas destacan el ser un método directo, simple,

económico y con una baja toxicidad. El ADN desnudo está siendo

utilizado como procedimiento de vacunación, ya que aunque el valor de

expresión de los genes es bajo, resulta suficiente para alcanzar una

respuesta inmunológica.(Rozaléna, 2003)

5.2.3 CONJUGADOS ADN-PROTEÍNAS

Muchas enfermedades de origen genético se traducen en defectos en

la expresión de proteínas, las cuales son difíciles de administrar o

modificar mediante técnicas farmacológicas ya sea por su tamaño,

complejidad o inaccesibilidad celular. Una de las aplicaciones futuras más

promisorias de la genética molecular en el tratamiento de las

enfermedades es la implementación de la terapia génica, la cual puede

ser definida como la administración e introducción de material genético en

40
un tipo celular o tejido apropiado para afectar la expresión génica con el

fin de obtener un efecto terapéutico deseado, superando las barreras de

una terapia farmacológica convencional. (Attilio R. 2000)

El mayor impacto terapéutico de la biología molecular se ha

manifestado en el manejo del trastorno fenotípico metabólico y proteico,

derivado de la aplicación de la tecnología de ADN recombinante en la

preparación de proteínas, que pueden usarse exitosamente para el

tratamiento de las manifestaciones fenotípicas de una amplia variedad de

enfermedades. Esta estrategia de obtención de proteínas de uso

terapéutico tiene como ventajas la facilidad en la obtención de grandes

cantidades del producto, así como la protección frente al riesgo de

contaminación con agentes patógenos que se generaba cuando el

producto proteico era obtenido de fuentes naturales. Como ejemplos de la

aplicación e impacto de esta estrategia terapéutica derivada de la biología

molecular, se puede destacar el uso de la insulina (el primer producto

comercial producido por la empresa biotecnológica para uso en humanos)

en la diabetes mellitus, la eritropoyetina en la anemia de la insuficiencia

renal crónica, la estreptoquinasa y el activador tisular del plasminógeno

en el infarto agudo del miocardio, los factores estimulantes de la

formación de leucocitos en disfunciones hematológicas, el factor VIII de la

coagulación en hemofilia clásica, el interferón en las hepatitis virales

41
crónicas, etc. Por lo tanto, la tecnología de ADN recombinante está

permitiendo la obtención de productos proteicos para el tratamiento de

una gama cada vez mayor de enfermedades, desde patologías genéticas

mendelianas clásicas hasta enfermedades de origen multifactorial como

cáncer, alergias, enfermedades autoinmunes, trastornos neurológicos,

infecciones y heridas.(Attilio R. 2000)

5.2.4 CONJUGADOS ADN –ADENOVIRUS

El adenovirus humano presenta un modelo de vector de transferencia

de notable seguridad, con un riesgo de enfermedad asociada a la terapia

de, a lo sumo, un resfriado. Estos virus infectan células humanas con

mucha facilidad, y su potencial para su uso como vectores de genes es

muy alto debido a ello. Además el adenovirus puede infectar células

independientemente de si están en división o no y los niveles in vivo de

fabricación de proteína a partir de un gen exógeno son muy elevados. Los

adenovirus raramente se integran en el cromosoma de las células que

invaden, aunque sí introducen sus genes en el núcleo de ésta. Esto

quiere decir que el gen terapéutico acaba desapareciendo y con él su

función terapéutica. Por otro lado, esta aparente desventaja puede ser

utilizada para tratamientos que requieran transitoriedad, y repercute

42
directamente en la seguridad del tratamiento. Éste puede ser repetido con

cierta periodicidad convirtiendo a la enfermedad en una condición crónica

sintomática, y aunque se escape de lo que es estrictamente curativo, sí

puede ser una buena y segura solución para muchas

enfermedades.(Isamat, 2007)

A continuación se presentan las ventajas y desventajas del uso de

Adenovirus como vector:

a) Ventajas

 Pueden infectar la mayoría de tipos celulares de mamífero.

 Pueden producirse a títulos elevados (1012 partículas/ml)

mediante su propagación en células 293 y su posterior

purificación en gradientes de cloruro de cesio, por lo cual

resultan adecuados para terapia génica in vivo.

 A diferencia de los vectores retrovíricos, son capaces de

transducir eficientemente células quiescentes como

neuronas y hepatocitos.

 El hecho de que los vectores adenovíricos generalmente no

se integran en el genoma de las células transducidas

elimina el peligro potencial de mutagénesis por

inserción.(Bautista, 2012)

43
 b) Desventajas:

 La expresión del gen terapéutico es transitoria.

 Producen inducción de una respuesta inmunitaria fuerte en

las células hospedadoras, contra pequeñas cantidades de

proteínas víricas sintetizadas por el vector.(Bautista, 2012)

5.2.5 LIPOSOMAS

Para evitar los problemas inherentes a la toxicidad potencial de virus

humanos se han diseñado múltiples agentes sintéticos que empaquetan

el ADN de forma que éste pueda ser introducido en la célula a la vez que

lo protegen de su degradación tanto fuera como en el interior de la célula.

Los liposomas son “perlas” de lípidos que contienen un ADN plasmídico

en el que se encuentra el gen terapéutico con todas las señales de

secuencia necesarias para su expresión en el destino celular de elección.

La transferencia a la célula se realiza por medio de la fusión entre los

lípidos del liposoma y los de la membrana celular. El mayor problema de

esta estrategia es la especificidad de las células diana en terapias in vivo

y la baja eficacia de la transferencia. La falta de especificidad está siendo

corregida por la incorporación de epítopos o pequeños polipéptidos en el

revestimiento de estas perlas lipídicas, para fusionarlas sólo en las células

44
diana que presenten moléculas receptoras específicas para estos

polipéptidos.(Isamat, 2007)

Las ventajas de los liposomas es que protegen de la degradación al

transgén hasta su llegada al núcleo. La talla del DNA introducido en ellos

no tiene límite. Podemos hacerlos llegar a tejidos específicos incluyendo

receptores en la capa lipídica. Sin embargo como desventaja presentan la

baja eficacia de transfección, una expresión transitoria, cierto grado de

toxicidad celular y pueden ser inhibidos por componentes

séricos.(Bautista, 2012)

5.3 MARCAJE CELULAR

Consiste en introducir, junto con el gen terapéutico, uno o más genes

que permitirán identificar y seleccionar aquellas células diana que hayan

incorporado el transgén. Así, por ejemplo, el marcaje con un gen que

confiere resistencia a neomicina permite la detección selectiva de las

células cuando se hacen crecer en un medio que contiene dicho

antibiótico.(C.Ronchera & J.Gonzales, 2004)

Por otra parte, un riesgo potencial de la terapia génica es la

posibilidad de aparición de complicaciones que requirieran la suspensión

del tratamiento. Es por ello que se ha desarrollado una alternativa

consistente en el doble marcaje de la célula con genes distintos de la

45
secuencia de interés, es decir, la célula marcada lleva un gen foráneo que

nos sirve de marcador, como el de resistencia a neomicina, que permite

seleccionar in vitro las células que han tomado el ADN exógeno o conocer

in vivo el grado de transfección, y el otro gen, como el de la enzima

timidinacinasa del virus del herpes simplex, que permite hacer una

selección negativa in vivo de las células marcadas, mediante la

administración de ganciclovir, el cual es fosforilado por la enzima y

activado, provocando la muerte celular; de este modo se elimina las

células modificadas si la situación lo requiere debido a la toxicidad del

tratamiento u otras complicaciones.(C.Ronchera & J.Gonzales, 2004)

Figura N°05: Procedimiento regulador del marcaje fenotípico para células

humanas

Fuente: HVIL

46
 CAPITULO VI
APLICACIONES

6.1. TERAPIA GÉNICA PARA LA CORRECCIÓN DE LA

DEFICIENCIA EN UNA PROTEÍNA

Existen trastornos causados por la herencia de un único

defecto genético, las conocidas como enfermedades monogénicas, es

por eso que se han desarrollado y aplicado tratamientos basados en

la restitución de la proteína defectuosa o deficitaria; pero además,

dichos tratamientos sólo tienen una efectividad parcial para paliar las

manifestaciones de la enfermedad y pueden conllevar graves

complicaciones. (Ronchera-Oms & González, 2012)

Se necesitará la introducción de un gen terapéutico normal que

provea al tejido afectado de un aporte continuo del producto de este

gen. Para ello, los vectores más indicados son los que integran su

DNA, que incluye el promotor y el gen terapéutico, en el cromosoma

de la célula. Estos vectores son los derivados de retrovirus o de virus

asociados a adenovirus. No obstante se han realizado ensayos con

vectores cuya aportación del producto génico en la célula afectada es

transitoria, y basta con repetir la administración del gen terapéutico de

forma regular para obtener un efecto paliativo a largo plazo. (Isamat,

2011)

47
 En pocas enfermedades de origen genético es pues factible

suministrar la proteína deficitaria en una forma farmacéutica efectiva,

dada su naturaleza lábil y compleja, y la necesidad de hacerla llegar a

un dominio subcelular específico.(Ronchera-Oms & González, 2012)

La inmunodeficiencia severa combinada (SCID) se debe a la

falta de la enzima Adenosina-desaminasa por la mutación en su gen.

Esta condición afecta la función de los linfocitos B y T provocando un

descenso en la producción de anticuerpos y una deficiencia

inmunológica. La SCID puede debutar a partir de los dos primeros

años de vida, condición que se conoce como “niños burbuja”

incapaces de desarrollar una respuesta inmunitaria adecuada. Los

ensayos de terapia génica con ADA comenzaron en 1993 y han

resultado tener bastante éxito. La estrategia incluye la inserción ex

vivo del gen ADA en médula ósea y la reimplantación de la médula

ósea en estos pacientes. El tratamiento de trastornos hematológicos

es conceptualmente más fácil ya que el gen terapéutico se puede

insertar en linfocitos o médula ósea de forma relativamente sencilla, y

el “tejido diana” se puede cultivar y seleccionar en el laboratorio antes

de su reimplantación. La inserción del gen del Factor VIII en células

sanguíneas de pacientes con hemofilia también se ha llevado a cabo

con cierto éxito por la misma razón de facilidad de manipulación del

48
órgano diana. Esto no es así en el caso de otros tejidos, que no

pueden tratarse ex vivo, y por ello el gene delivery supone uno de los

mayores obstáculos para la terapia génica.(Isamat, 2011)

6.2 TERAPIA GÉNICA PARA LA CORRECCIÓN DEL EXCESO DE

FUNCIÓN DE UNA PROTEÍNA

La mayoría de las patologías que nos afectan están debidas a la

acción de más de un gen, empezando por las enfermedades

infecciosas y acabando por las enfermedades neoplásicas. En

particular estas últimas, el cáncer, es un modelo de enfermedad

poligénica de gran interés y que está siendo ampliamente investigado

desde el punto de vista molecular desde hace más de una década. El

cáncer es consecuencia de daños genéticos acumulados desde el

nacimiento que provoca el crecimiento descontrolado de una célula.

Este crecimiento o división incontrolada puede ser debida al fallo de

tres mecanismos básicos. Un fallo en la división celular, un fallo en la

regulación de la muerte celular programada o apoptosis, y un fallo en

los sistemas propios de la reparación de errores o mutaciones de la

célula.

El primer caso lleva a una célula a perder el control de su división,

regulada por un centenar de genes y da lugar a un foco tumoral en

49
cualquiera de los tejidos donde se produjo la primera mutación y a

partir de la cual se genera la neoplasia. En el segundo caso, lo que

falla es la muerte de la célula. Toda célula tiene un programa de vida,

y es tan malo dividirse en exceso como no morirse. El resultado es la

producción de una estirpe celular inmortal. La muerte celular

programada, conocida como apoptosis está también controlada por

un centenar de genes; un fallo en uno de ellos puede dar lugar a la

formación de un tumor.

Por último, cualquier mutación que afecte a los sistemas de

reparación del ADN, hará que se incorporen más errores en el

cromosoma de la célula, y a la larga afectará a las vías de

transformación neoplásica citadas anteriormente. El fallo en los

mecanismos de reparación del ADN genera unas células con alta

capacidad de mutación que con el tiempo repercute en la distorsión

del control de la división celular y de la apoptosis.

50
6.3 TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER

En el cáncer las líneas de investigación, tanto preclínicas como

clínicas dentro de la TG, pueden ser agrupadas en varias estrategias:

– Destrucción de las células tumorales mediante la expresión de

productos tóxicos, o, en su defecto, enzimas capaces de activar

profármacos, como puede ser por la sobreexpresión de la enzima

tiroxina cinasa que transforma un profármaco, el aciclovir, en un

veneno.

- Fortalecer y estimular la protección natural del sistema inmunitario

contra las células anormales incrementando el carácter extraño de

estas células, potenciando los mecanismos del sistema inmunitario o

modificando las células cancerígenas para hacerlas más susceptibles

a su destrucción.

- Cambio del fenotipo de las células cancerígenas, bien inhibiendo la

expresión de oncogenes o aumentando la de genes supresores de

tumores, como el p53 que aparece mutado en un alto porcentaje de

tumores, o introduciendo «genes suicidas» en células tumorales.

- Protección de las células normales de los efectos de la

quimioterapia o radioterapia.

- Incremento de la cantidad y citotoxicidad específica de los linfocitos

que reaccionan con las células tumorales.

51
 Las primeras aproximaciones utilizaban el marcaje de linfocitos

de infiltración tumoral para seguir el progreso del tratamiento contra el

melanoma maligno. En 1990, se obtuvo la aprobación definitiva para

una aplicación de TG a pacientes con casos avanzados de melanoma

basada en experimentos ex vivo con linfocitos de infiltración tumoral

(TIL) procedentes de los tumores de pacientes con melanoma. Los

TIL fueron introducidos en una solución de interleucina-2, una

sustancia natural que potencia su efecto destructor, y posteriormente

expuestos a retrovirus que codificaban para el factor de necrosis

tumoral, una proteína que interfiere con el suministro de sangre al

tumor y debilita las células tumorales. Los TIL activados se

hospedarían en los tumores atacando las células cancerosas y, a la

vez, liberando el factor antitumoral para ayudar a exterminarlos. Sin

embargo, esta aproximación presenta problemas debido a que los

linfocitos modificados pueden quedar atrapados en el hígado, bazo y

pulmones, y la expresión no regulada en estos órganos del factor de

necrosis tumoral puede originar procesos tóxicos secundarios.

(Rozalen, Fernandez Gomez, Ceña, & Jordan, 2003)

52
6.4 TERAPIA GÉNICA DE LA INFECCIÓN POR VIH

Se han realizado aproximaciones, tanto in vivo como ex vivo, en

el sida, mediante el empleo de vectores retrovirales portadores de

genes de la cápside o la envoltura del VIH, como la glicoproteína 120,

siendo los linfocitos T las células diana. Los glóbulos blancos

modificados reconocen las células infectadas por el VIH y las

eliminan, tanto en las primeras etapas de la infección como al cabo de

largos tratamientos antivirales. En los primeros ensayos clínicos estas

células pueden eliminarlo de manera tan eficaz como lo harían los

linfocitos T atacados por el virus, es más, éstas son capaces de

atacar eficazmente a varios mutantes del VIH.(Rozalen, Fernandez

Gomez, Ceña, & Jordan, 2003)

Se han realizado ya numerosos estudios sobre el tratamiento de

la infección por el VIH mediante terapia génica, tanto in vitro en

diferentes líneas celulares como in vivo en animales de

experimentación. Asimismo, en la actualidad se están ensayando

diversos protocolos clínicos de terapia génica para el tratamiento del

SIDA. Los ensayos clínicos en desarrollo utilizan mayoritariamente

técnicas ex vivo. Se aíslan células del paciente, las cuales se utilizan

como vehículos celulares de los genes terapéuticos. Mediante

53
vectores víricos o por inyección directa de ADN, se introduce un gen

terapéutico en estas células diana. A continuación, las células

transducidas, es decir, aquellas que han incorporado y expresado el

transgén, son reintroducidas en el paciente por vía intravenosa. En

algunos protocolos, las células transducidas, previamente a su

administración al paciente, son expandidas en un cultivo celular para

aumentar su número. A continuación se enumeran las diferentes

estrategias aplicadas en los ensayos clínicos realizados en terapia

génica de la infección por VIH:

- Transferir un gen del virus VIH, para así estimular la respuesta

inmune del paciente en cuanto dicho gen sea expresado.

- Introducir genes de inhibidores celulares de la replicación vírica

(interferón-a) en líneas celulares de linfocitos T y monocitos, y

con la subsiguiente inhibición de la producción de VIH.

- Transferir genes de proteínas mutantes del VIH, las cuales

compiten con las proteínas víricas nativas, dificultando el

ensamblaje del virus o inhibiendo su replicación.

- Secuestrar proteínas víricas reguladoras mediante señuelos de

ARN, sobreexpresados en la célula a partir de genes

transferidos, los cuales impiden la unión de estas proteínas a

sus verdaderos puntos de acción.

54
- Oligonucleótidos antisentido, que son hebras cortas de ARN

químicamente modificado y no funcional, complementarias de

las secuencias genéticas del VIH. La formación de parejas

(“duplex”) sentido: antisentido bloquea la traducción y promueve

la degradación de los complejos de ARN inestables.

- Manejo de ribozimas, que son ARN con propiedades

catalíticas.Al igual que los ARN antisentido, las ribozimas se

unen a secuencias complementarias del ARN diana, con la

propiedad adicional de su actividad enzimática ribonucleasa, que

rompe catalíticamente el ARN sustrato. Esto les exime de las

limitaciones estequiométricas que afectan a los ARN

antisentido.Además,no parecen inducir respuesta inmunológica.

En el caso de los virus ARN, los ribozimas resultan

particularmente interesantes,ya que pueden degradar al ARN

genómico vírico antes de su integración, así como a los ARN

mensajeros y al ARN genómico destinado al ensamblaje y la

generación de nuevos viriones.

- Introducción en las células diana de genes que codifican

anticuerpos de cadena única frente a proteínas del VIH, de

manera que la expresión de tales anticuerpos neutraliza las

proteínas víricas dentro de las células infectadas, incluso antes

55
de que se produzca el ensamblaje del virus, tratándose pues de

una verdadera “inmunización intracelular”(Isamat, 2011)

56
 CONCLUSIONES

PRIMERA

Los vectores virales no poseen los genes que codifican para las proteínas

virales, en su lugar se encuentran los genes terapéuticos, de esta manera

no hay riesgo de infección. Los principales virus que se usan en terapia

génica son: los adenovirus, los retrovirus y los virus asociados a

adenovirus.

SEGUNDA

La transferencia genética presenta ventajas en no tener limitaciones en

su tamaño de ADN y ser fáciles de preparar en la terapia génica; estos

métodos son necesario para introducir de manera eficaz la secuencia

génica de interés en la célula diana y conseguir su expresión.

TERCERA

Las terapias genéticas somáticas y germinales tienen como función

principal introducir genes en células para corregir enfermedades

celulares y hereditarias , teniendo más desarrollo la terapia somática

debido a que se puede dar en ex vivo y in vivo.

57
CUARTA

La terapia génica en enfermedades monogenicas, es prometedora, ha

tenido grandes avances en el tratamiento de enfermedades

inmunodeficientes, hemofilias, fibrosis quística, distrofia muscular, entre

otras enfermedades de procedencia genéticas y no genéticas como las

degenerativas. Esta técnica no es generalizable en todas las

enfermedades, es limitada debido a que el éxito de su aplicación depende

de la misma enfermedad mas no de la técnica.

58
 BIBLIOGRAFÍA

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