MARCO TEÓRICO

La mayoría de microorganismos son incoloros cuando se les observa a través de

un microscopio óptico estándar, ya que la diminuta célula bacteriana en su estado
basal permite el paso de una cantidad excesiva de luz, es por ello que se requieren
tinciones biológicas para contrastar con el fondo blanco brillante profusamente
iluminado (Gray, 1965) Las tinciones consisten en preparaciones acuosas u
orgánicas de colorantes o grupos de colorantes que proporcionan una variedad de
colores a los microorganismos y a los tejidos vegetales y animales, u otras
sustancias de importancia biológica (Koneman, 2008).

Algunos ejemplos de colorantes básicos son el cristal violeta, el azul de metileno, la

safranina

Los colorantes ácidos no son atraídos por la mayoría de las bacterias porque los
iones negativos del colorante son repelidos por la superficie bacteriana cargada
negativamente.

Todo proceso de tinción requiere de 3 etapas previas. (García, Paredes, &

Fernandez, 1994)

 Extensión
Consiste en formar una película de la muestra sobre un portaobjetos
perfectamente limpio y desengrasado. La deposición de la muestra debe
ocupar aproximadamente una superficie de 1cm 2 los portaobjetos suelen
flamearse antes de su uso para eliminar los restos de grasa y suciedad. Por
otro lado, la forma de realizar la extensión depende del estado físico en que
se encuentre la muestra: para muestras líquidas basta con depositar una gota
en el centro del portaobjetos y extenderla con un asa; para muestras sólidas,
o colonias procedentes de un cultivo, se deposita con antelación sobre el
portaobjetos una pequeña gota de agua, o mejor de solución salina, en la
que se efectúa una emulsión. (García, Paredes, & Fernandez, 1994)
  Desecación
Siempre debe realizarse al aire. Puede favorecerse colocando e portaobjetos
sobre el calor suave de una llama de un mechero, pero tomando
precauciones para no forzar el proceso de secado. (García, Paredes, &
Fernandez, 1994)

 Fijación

El proceso de fijación produce la muerte simultánea de los microorganismos

y su adherencia al portaobjetos por su coagulación de sus proteínas
plasmáticas mediante calor. También preserva diversas partes de los
microorganismos en su estado natural con distorsión mínima. Se aplica el
colorante, se lo lava con agua y se lo seca con papel absorbente. Si no se
realizara la fijación el colorante podría arrastrar los microorganismos del
portaobjetos (Tortora, 2007)

Colorantes

Son clasificados según su comportamiento químico en ácidos y básicos. Los

colorantes son las sales compuestas por un ion positivo y un ion negativo, uno de
los cuales esta coloreado y se conoce como cromóforo. (Tortora, 2007)

a. Ácidos o aniónicos. El color de los colorantes ácidos, está en el ion negativo.

Son los colorantes citoplasmáticos. Estos no son atraídos por la mayor parte de
los tipos de bacterias porque la superficie bacteriana con carga negativa repele
los iones negativos del colorante, de modo que este tiñe el fondo en lugar de la
estructura bacteriana. Es ejemplo de colorante acido la fucsina ácida
b. Básicos o catiónicos. El color de los denominados colorantes básicos esta en el
ion positivo. En un pH de 7 las bacterias presentan una carga levemente
negativa. Por lo tanto, el ion positivo coloreado en un colorante básico es atraído
 hacia la célula bacteriana con carga negativa. Los colorantes básicos entre los
que se encuentran el azul de metileno y el cristal violeta o violeta de genciana,
se utilizan con más frecuencias que los colorantes ácidos.
c. Neutros. Son sales compuestas de un color ácido y un color básico. Por ejemplo
cosinato
d. Indiferentes. Son los colorantes insolubles en agua y solubles en alcohol donde
no predomina ni la carga positiva ni la carga negativa. Pero no tienen carácter
neutro, colorantes de los lípidos, por ejemplo el Sudan III, negro
Sudán.(Granados, 1997)

Técnica de tinción

El proceso de tinción supone una reacción de intercambio de iones, entre el

colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la célula. Los iones
teñidos del colorante reemplazan a otros iones en los componentes celulares.
Algunos agrupamientos químicos de proteínas y ácidos nucleicos celulares pueden
participar en la formación de sales con iones cargados positivamente con 𝑁𝑎+ o 𝐾 +
y de esta manera es posible ver estas áreas periféricas de la célula que llevan una
carga negativa en combinación con iones cargados positivamente, por ejemplo

(𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎 𝑏𝑎𝑐𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑛𝑎 − ) (𝑁𝑎+ )

En un colorante como el azul de metileno, que es básico, el ion coloreado está

cargado positivamente (catión), si representamos este ion por el símbolo MB, el
colorante que en realidad es cloruro de azul de metileno, se puede representar así:

𝑀𝐵 + 𝐶𝑙 −

El intercambio iónico que tiene lugar durante la tinción se representa mediante la

ecuación siguiente en la cual el catión 𝑀𝐵 + reemplaza al catión 𝑁𝑎+ .

(𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎 𝑏𝑎𝑐𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑛𝑎 − ) (𝑁𝑎+ ) + (𝑀𝐵+ ) (𝐶𝑙 − ) → (𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎 𝑏𝑎𝑐𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑛𝑎 − ) (𝑀𝐵+ ) + (𝑁𝑎+ 𝐶𝑙 − )

Las principales ventajas de la técnica de tinción son:

 Observar de una manera más detallada su morfología.

 Proporcionar el contraste preciso y suficiente en cada caso, lo que permitirá
diferenciar distintos tipos morfológicos.
 Establecer una información completaría sobre sus estructuras internas y/o
externas que no podrían ser observadas por examen en fresco.
 Conocer sus características tintoriales orientándonos hacia un grupo
taxonómico u otro en la clasificación bacteriana.

Tinción Simple

La coloración de las bacterias por la aplicación de una solución colorante simple en

preparaciones fijas y teñidas se conoce como coloración o tinción simple. (Pelezar,
1982) Para poner en práctica este método basta con colocar una o dos gotas de
colorante sobre la extensión ya seca. Al cabo de cierto tiempo, este depende del
tipo del colorante utilizado, se lava el frotis cuidadosamente con un chorro de agua
suave o se agita en el interior de un recipiente que contenga agua limpia. Después
de secar la superficie inferior del portaobjetos con un paño y la parte superior con
papel absorbente, se coloca una gota de aceite sobre el frotis seco y teñido y se
examina con objetivo de inmersión. Los colorantes que comúnmente se utilizan en
este método son la fucsina, fenicada, safranina o violeta de genciana diluida. (Gray,
1965)

Por lo general, las células se tiñen uniformemente, no obstante, hay algunos

microorganismos que al teñirse, sobre todo con azul de metileno, en el interior de
su célula aparecen algunos gránulos más teñidos que el resto de la célula, lo cual
indica la presencia de entidades químicas activas en forma de partículas que tienen
mayor afinidad por el colorante que la célula en conjunto. (Pelezar, 1982)
Esterilización

La esterilización es un tratamiento que deja el objeto tratado libre de todo organismo

vivo. Puede lograrse mediante exposición a agentes letales físico o químicos o en
el caso especiales de las disoluciones por filtración. Para entender la base de la
esterilización por agentes letales es necesario describir brevemente la cinética de
la muerte de una población microbiana. El único criterio válido de muerte en el caso
de un microorganismo es la pérdida irreversible de la capacidad de reproducirse. El
más común es la esterilización por calor, la cual puede esterilizar los objetos
utilizando al calor como agente letal. (Tortora, Funke, & Case, 1993)

Morfología de las bacterias

 Bacillus
Células en forma de barra, algunas veces en cadenas, que pueden producir
endosporas. Móviles por flagelos peritricos, o inmóviles. Gram positivas en
general, aunque algunas especies presentan reacción negativa o variable a esta
técnica de tinción. la mayor parte saprofitos, que se encuentran comúnmente en
el suelo; algunas especies son parásitos o patógenos de los animales
especialmente de los insectos.

 Escherichia
Bacilos cortos. móviles o
inmóviles. Gram-
negativas. Fermentan
la glucosa y la lactosa con
producción de ácido y de
gas. No producen acetilmetilcarbinol. Se encuentra en las heces; en ocasiones
son patógenos para el hombre (enteritis, peritonitis, cistitis, etc). Muy
ampliamente difundidos en la naturaleza.

 Staphylococcus
Células esféricas, que se presentan aisladas, en parejas, en tétradas, o en
agrupaciones irregulares, semejantes a racimos de uvas, especialmente en los
cultivos en caldo. Inmóviles. Gram-positivas, Muchas razas producen un
pigmento anaranjado
o amarillo, sobre todo
en los medios que
contienen fuertes

concentraciones de NaCl.