Contenido

I. Introducción ................................................................................................................................ 1
EXTRACCION DE ADN DE LA BACTERIA Bacillus subtilis CON KITs COMERCIAL Y CALIDAD EN GELES
DE AGAROSA ....................................................................................................................................... 2
II. Objetivo. ............................................................................................................................. 2
Extracción de ADN de Bacilus subtilis ......................................................................................... 3
Determinación de calidad de ADN extraído de Bacillus subtilis usando geles de agarosa. ..... 4
V. Resultados: ............................................................................................................................. 5
VI. Discusión ............................................................................................................................ 5
VII. Anexos. ............................................................................................................................... 6
VIII. Referencias Bibliográficas ............................................................................................ 9
 I. Introducción

En el presente informe contempla una serie de pasos para la extracción de ADN.

El ADN es una biomolécula que permite la continuidad y evolución de las especies, el ADN

Su función es almacenar la información genética codificada, éste, está presente en todas las

células de los seres vivos

La extracción de ADN es necesaria en multitud de aplicaciones en la biología molecular.

Existe un gran número de kits comerciales. Se ha demostrado que la sensibilidad de detección

de la PCR es diferente en kits de ADN.

Esto ha llevado como se mencionó anteriormente a la necesidad de adecuar y/o diseñar

técnicas de extracción de ADN que aseguren el éxito de la PCR y posteriores estudios,

considerando las características de las muestras (Burke et al, 2009; Somerville et al, 1989).

La bacteria con la que se trabajara es Bacilus subtilis la cual es una bacteria gram positiva

comúnmente encontrada en el suelo

Algunas de sus variedades tienen aplicaciones comerciales.

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 EXTRACCION DE ADN DE LA BACTERIA Bacillus subtilis CON KITs
COMERCIAL Y CALIDAD EN GELES DE AGAROSA

II. Objetivo.

 Obtener ADN de un cultivo en fase exponencial de Bacilus subtilis con

ZymoBIOMICS TM DNA Kits.

 Determinar la calidad de ADN extraído mediante geles de agarosa.

III. Materiales, Reactivos y Equipos.

 Micropipeta de 100 a 1000 μL.

 Mircropipeta de 10 a 100 μL.

 Puntas de 10 a 100 μL.

 Microtubos de 1.5 mL.

 Falcon de 100 ml.

 Microtubo Zymo- SpinTM Filtres.

 ZymoBIOMICSTM Lysis Solution.

 ZymoBIOMICSTM DNA WashBuffer 1.

 ZymoBIOMICSTM DNA WashBuffer 2

 ZymoBIOMICSTM DNase/RNase Free Water.

 Centrifuga.

 Vortex.

 Camara de electrophoresis.

 Fuente de poder.

 Agarosa 1%.

 Marcador de pesos molecular para AND

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  150 mL de TAE

 Agua estéril Destilada

 EDTA.

IV. Metodología.

Extracción de ADN de Bacilus subtilis

 Ya teniendo en un tuvo falcón el medio de cultivo de la bacteria Bacilus subtilis esta

se agita con ayuda del vortex.

 Se extrae 3 mL del medio de cultivo que está depositado en el tubo falcón y se reparte

1 mL en 3 microtubos.

 Concentrar 6 mL (3 mL por cada grupo de trabajo) del cultivo de B. subtilis, en 500

µL esto se logra centrifugando a 5000 rpm por 5 minutos y resuspendiendo con agua

destilada estéril.

 Tomar con una Micropipeta 250 µL del concentrado de B. subtilis ponerlos en un

microtubo de 1.5 mL y añadirle 250 µL de solución de lysis (ZymoBIOMICSTM Lysis

Solution), mover despacio y con cuidado de un lado a otro por 5 minutos.

 Retirar los 500 µL y ponerlos en un microtubo con filtros (Microtubo Zymo- SpinTM

Filtres), y centrifugarlo a 5000 rpm por 5 minutos.

 Retirar el líquido del tubo colector y realiza lavados con 150 µL de

ZymoBIOMICSTM DNA WashBuffer 1 y ZymoBIOMICSTM DNA WashBuffer 2, y

centrifugar a 5000 rpm por 5 minutos.

 Se resuspende con 100 µL de ZymoBIOMICSTM DNase/RNase Free Water lo más

cerca de la membrana de la columna, se centrifuga a las mismas condiciones antes

mencionadas.

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  Se guarda el ADN a -20 ºC.

Determinación de calidad de ADN extraído de Bacillus subtilis usando geles de

agarosa.

 Se sacó el ADN congelado a temperatura ambiente.

 Se prepara agarosa a una concentración de 1% añadiendo bromuro de etidio.

 Se añade a la cama de electroforesis, se pone los peines para generar los pocillos

correspondientes, así como el marcador de peso molecular de ADN.

 Se preparan as muestras de ADN para ingresar a los pocillos combinando la muestra

con un florocromo DNA Loading.

 Con mucho cuidado se pone 10 a 15 µL de cada muestra en los pocillos corresponden,

así como el marcado de peso molecular de ADN.

 Se conecta los cables + y- y a la fuente de poder y se programa para 120 V por 1 hora.

 Se revela en el gel por luz ultravioleta y se toma foto de las bandas que se muestren.

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 V. Resultados:

La técnica de PCR a partir de cultivos puros empleada en este estudio resultó ser altamente

reproducible por su simpleza. La calidad y cantidad de ADN extraído con los protocolos

evaluados a partir de cultivo puro no revelaron los resultados esperados en la prueba

cualitativa de electroforesis.

Por la falta de un equipo de luz ultravioleta llamado transiluminador.

VI. Discusión

Los resultados no rebasaron las expectativas previstas. Para eso hay diferentes variantes que

han podido influir de una manera negativa al resultado final, como la falta de un equipo que

ayuda a ver mucho mejor los resultados llamado transiluminador, también pudo influir un

mal vertimiento de las muestras de ADN en los pocillos de gel de agarosa

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 VII. Anexos.

Figure 2. Colocación de los

Figure 1.Uso de vortex para agitar la microtubos que contiene las
muestra con el medio de cultivo. muestras en la centrifuga

Figure 3. Tubo falcón Figure 4. Caja que

que contiene el medio de contiene el kit de
cultivo. extracción de ADN

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Figure 5. Contenido del kit de extracción de
Figure 6. Microtubo con el medio
ADN.
de cultivo antes del centrifugado.

Figure 7. Microtubo en donde se

observa mejor la concentración de
bacterias depositado al fondo.
Figure 8. Microtubo con filtro

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 Figure 9. Cámara horizontal de electroforesis

Figure 8 Agarosa.

Figure 10. Cámara horizontal de Figure11.. Muestras colocadas en los

electroforesis y peine de electroforesis. pocillos hecho en el gel de agarosa

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VIII. Referencias Bibliográficas

 Dhaliwal A. (2018). Extracción y purificación de ADN. Recuperado de

http://www.labome.es/method/DNA-Extraction-and-Purification.html

 Poutou R, Burbano M ,Sierra S, Torres K, Carrascal A , Mercado M. (2005).

Estandarización de la extracción de ADN y validación de la PCR múltiple para

detectar Listeria monocytogenes en queso, leche, carne de res y pollo. Recuperado de

https://revistas.javeriana.edu.co/index.php/scientarium/article/view/4981

 López L, Mejia C. (2012). Evaluación de métodos de extracción de ADN para

detección de Listeria monocytogenes en productos cárnicos. Recuperado de

http://www.scielo.org.co/pdf/mvz/v17n3/v17n3a11.pdf