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Fundamento
La electroforesis es una técnica de separación de moléculas, que se basa en la
migración diferencial de especies cargadas al ser sometidas a un campo eléctrico.
Estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo, en dependencia de una
combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional. Los geles de
poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separaciones
electroforéticas, dado que reúnen una serie de propiedades idóneas:
transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran
variedad de compuestos químicos. La poliacrilamida se forma por polimerización
de dos compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida. Se han desarrollado dos
tipos de técnicas para la electroforesis: libre o de frente móvil (las moléculas se
mantienen separadas mientras se aplica una corriente eléctrica) y la electroforesis
de zona (aun al suspender la corriente eléctrica las moléculas aún se mantienen
separadas). La electroforesis en gel de poliacrilamida puede clasificarse de
acuerdo a varios criterios: tamaño del poro del gel y el número de reguladores
para preparar el gel, dando lugar a la electroforesis continua y discontinua. En
función del campo eléctrico y el tamaño de las moléculas puede darse la
electroforesis de alto y bajo voltaje. Para llevar a cabo una buena separación, es
necesario determinar el tamaño del poro del gel, el cual está en función de la
concentración de los monómeros de acrilamida, del tamaño y carga neta de las
proteínas a separar.
Resultados
1.8
1.6
1.5
y = -0.0618x + 2.1681
R² = 0.9566
1.4
y = -0.0646x + 2.078
R² = 0.9225
1.3
1.2
5 6 7 8 9 10 11 12 13
%T
Preguntas extra
1. Concluya acerca del tamaño molecular relativo de las proteínas y sus
cargas eléctricas relativas al pH del regulador de trabajo (8.7 a 9.1).
Por medio de las ecuaciones obtenidas en el gráfico de Ferguson, podemos
llevar a cabo una comparación de las pendientes de cada una de las
muestras, observando que la clara tiene un peso molecular mucho mayor
que el suero y el yogurt. Debido a que las proteínas son de alto peso
molecular e influye también la forma que tengan, no todas las proteínas se
podrán desplazar a lo largo del gel, ya que dependerá de la carga, tamaño y
forma, pero si podemos observar sus características ya que se observa un
desplazamiento de las proteínas hacia el ánodo con carga positiva,
prediciendo que estas tienen una carga negativa en su estructura, y la
longitud del desplazamiento de cada banda que forme nos dará una idea del
peso molecular y de la estructura de las proteínas.
2. Diga cuál %T recomienda para la separación de las proteínas de cada
muestra, ¿por qué?
3.
Muestras %T recomendado PM (Kd)
Suero Conoalbúmina 7.5 75
Seroalbúmina 69
Yogurt (caseína) 12.5 25
Clara (Ovoalbúmina) 10 45
Discusión
En la presente práctica se llevó a cabo una electroforesis para poder analizar las
proteínas presentes en tres muestras (suero, clara y yogurt). Para esto se llevó a
cabo la preparación de cuatro geles con diferente concentración de acrilamida, bis-
acrilamida y persulfato de amonio. Que fueron de 5.5%, 7.5%, 10% y 12.5%, para
poder llevar a cabo una comparación entre ellos en la efectividad de separación, ya
que el tamaño del poro fue diferentes. Esto debido a que mayor concentración de
acrilamida y bis-acrilamida obtuvimos poros más cerrados o pequeños. Al llevar a
cabo el desarrollo electroforético a 150 voltios, y las muestras se suspendieron con
azul de bromofenol para su detección en el gel, una vez finalizada la electroforesis
se llevó a cabo el teñido del gel con azul de cromassie R-250 y se clarifico
posteriormente, para poder visualizar las bandas formadas por el corrimiento de las
proteínas presentes en las muestras.
Podemos observar en la tabla uno, como en algunos de los geles se pudo observar
un mayor corrimiento de la muestra, ya que podemos observar más bandas en
comparación de otras, como es el caso del gel de 7.5% que se observa una mayor
cantidad de bandas en el suero, sin embargo en el caso de la leche podemos
observar la misma cantidad de bandas al 7.5%, 10% y 12.5%, mientras que la clara
presenta un mayor número de bandas al 10%, esto debido a que en estos
porcentajes podemos observar una mejor separación de las proteínas presentes en
las muestras. Esto debido a que la movilidad de las proteínas dependerá de la carga
y el tamaño, al igual que del tamaño del poro, el cual permitirá que de acuerdo al
tamaño de la molécula esta pueda desplazarse en el gel. Además podemos
observar que el suero presenta una mayor cantidad de proteínas, seguido de la
clara y finamente el yogurt, sin embargo, la observación de las bandas no es
suficiente para poder determinar de qué proteína se trata cada una de las bandas,
se necesitaría de otro proceso, mediante sus pesos moleculares para poder
determinarlos.
En la tabla dos podemos observar que la concentración final de acrilamida es
inversamente proporcional al tamaño del poro y a la movilidad electroforética
relativa, esto ya que podemos observar que a menor concentración de acrilamida
hubo una mayor distancia recorrida por las proteínas, ya que el poro era más grande
en comparación de los geles del 12.5%, ocasionando que las proteínas de menor
tamaño pudieran pasar fácilmente por estos poros, sin embargo en el caso contrario
en los geles del 12.5%, estos generan poros más pequeños, ocasionando que las
proteínas que son de gran tamaño queden retenidos y solo permitiendo el paso de
las proteínas que son de un tamaño pequeño.
A partir del log (M x 100) y %T obtenidos en la tabla dos, se llevó a cabo el grafico
de Fergunson, en donde podemos observar el tamaño y la carga relativa de algunas
de las proteínas presentes en cada muestra. En el caso del tamaño, está la
podemos comparar entre proteínas gracias a la pendiente de cada una de las rectas
formadas en cada muestras, podemos observar que las proteínas de la clara tiene
un mayor tamaño, sin embargo esto no coincide con la bibliografía, ya que las
proteinas del suero tienen un mayor peso molecular que el de la clara, esto
posiblemente se puede deber a que al momento de medir la distancia recorrida por
cada proteína se realizó de manera incorrecta o hubo alguna interferencia en el
recorrido de las muestras, debido a que estas se encontraban en los extremos y se
encontraba un exceso de vaselina en estas zonas y la vaselina interfiere en la
movilidad de las muestras. Lo obtenido experimentalmente con respecto al tamaño
fue, que las proteinas de la clara son de mayor peso molecular seguido del suero y
el yogurt. En el caso de la carga esta la podemos visualizar debido a la ordenada al
origen de cada una de las rectas, obteniendo que el suero tiene una mayor carga,
seguido del yogurt y finalmente la clara. Al influir la carga y el tamaño en la movilidad
de las proteinas, podemos observar que se obtuvo una mayor cantidad de bandas
en el suero, ya que este tiene una mayor carga habrá una mayor movilidad
electroforética, sin embargo, también el peso molecular influirá en esta movilidad ya
que este disminuirá si su tamaño es mayor, ya que se presentara una mayor fricción
de la molécula con el medio, por ello podemos observar que en el caso del suero,
a pesar de que tiene una mayor carga este presenta una menor movilidad que el
yogurt, esto debido a que su peso es mayor en comparación del yogurt.
Conclusiones
Hay una mayor presencia de proteinas en el suero humano.
A mayor concentración de bis-acrilamida se obtiene un tamaño de
poro menor.
La concentración final óptima de acrilamida para la separación de las
proteinas del yogurt es el de 12.5%.
La concentración final óptima de acrilamida para la separación de las
proteinas del suero es el de 7.5%.
La concentración final óptima de acrilamida para la separación de las
proteinas de la clara es de 10%.
Las proteínas del suero presentan una mayor carga.
Bibliografías
Dra. Hilda Marilín García Pérez, 2000. Electroforesis en geles de
poliacrilamida:fundamentos, actualidad e importancia. Universo diagnóstico.
Laboratorios Beterá. Recuperado de
http://bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2_00/uni07200.pdf
Lomonte B. Electroforesis en gel de Poliacrilamida. Facultad de ciencias.
Universidad Central de Venezuela. Recuperado de
http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/lab-bioq-gen/archivos/Lomonte%20-
%20Cap13%20PAGE.pdf
Lodish Harvey, 2005. Biología celular y molecular. Editorial Médica
Panamericana, México.