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Manual de Estudiantes Biologia para Ingenieros
Manual de Estudiantes Biologia para Ingenieros
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BIOLOGÍA PARA INGENIEROS
MEDELLÍN
2017
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Laboratorio de Biología para Ingenieros UNIVERSIDAD
DE ANTIOQUIA Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Química
ÍNDICE
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a. Llegar puntualmente. Todas las prácticas están programadas para ser realizadas en
el tiempo previsto.
b. Llevar las guía de la práctica a realizar, esta debe ser leída con anticipación.
c. Tenga en cuenta las instrucciones dadas en cada sesión. El profesor puede preguntar
cualquier información que esté contenida en ellas.
d. No es permitido el uso de radios, walkman, celulares o equipos puedan interrumpir
el desarrollo de la práctica.
e. Es prudente usar pantalón largo y evitar las faldas y pantalonetas.
f. Usar zapatos cerrados adelante, evitar sandalias o calzado similar.
g. No es permitido el ingreso al laboratorio de personas diferentes a los matriculados
en el curso.
h. Desarrollar las actividades con calma, tome el tiempo necesario para hacer los
distintos procedimientos para que los resultados sean buenos.
i. Analice los resultados obtenidos durante la práctica. Confíe en sus propias
observaciones.
j. Está prohibido fumar dentro del laboratorio.
k. Utilícelos reactivos adecuados en cantidades y concentraciones indicadas. No
desperdicie el material.
l. El material de trabajo es propiedad dela universidad y debe ser devuelto en buenas
condiciones y limpios. Usted es responsable y debe reponer y pagar todo el material que sea
dañado o extraviado.
m. La limpieza, el cuidado al trabajar, el empleo correcto de las técnicas enseñadas y el
interés son factores que contribuyen al éxito de la práctica.
n. No emplee material sucio o contaminado para extraer reactivos de los recipientes.
o. No se retire del laboratorio sin justificación.
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NORMAS DE BIOSEGURIDAD
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OBJETIVO
PREGUNTAS
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OBJETIVOS
Conocer y/o familiarizarse con los diferentes equipos de laboratorio, a través del
desarrollo de actividades que involucren manejo de material de vidriería (probetas,
erlenmeyers, pipetas, etc.) y equipos de laboratorio (balanzas analíticas, pH metro,
espectrofotómetro, micropipetas, filtros).
Realizar la medición de biomasa por medio de las técnicas de peso seco y
turbidimetría (absorbancia).
Realizar la determinación de azúcares reductores por el método espectrofotométrico
del DNS.
MARCO TEÓRICO
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Micropipeta:
Es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeños volúmenes
de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas científicas. Los volúmenes
captables por estos instrumentos varían según el modelo: los más habituales, denominados
p20, p200 y p1000, admiten un máximo de 20, 200 y 1000 μl, respectivamente. Es de
destacar que el uso de micropipetas permite emplear distintos líquidos sin tener que lavar el
aparato: para ello, se emplean puntas desechables, de plástico, que habitualmente son
estériles. Existen varios tipos de puntas: por ejemplo, las amarillas para pipetear volúmenes
pequeños (por ejemplo, 10 μl), y las azules para pipetear volúmenes grandes (por ejemplo,
800 μl).
Tipos: Existen micropipetas manuales, en las que el volumen a aspirar se fija girando un
botón en su parte superior que está conectado a un sistema analógico de confirmación de
volumen, y automáticas, en las cuales dicho sistema es digital. Hay micropipetas simples,
que sólo acogen una punta cada vez, y multicanales, que permiten incorporar múltiples
puntas (por ejemplo, ocho), absorbiendo el mismo volumen en todas ellas.
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Espectrofotometría:
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la
concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las
radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma
lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro,
en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y
medir la cantidad de luz absorbida por la misma. Para cuantificar la absorbancia se puede
usarla ley de Lambert- Beer, esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz
monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:
= = · ·
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración, a mayor
número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia
que recorre la luz por la solución, a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la
luz por la muestra más moléculas se encontrará; y por último, depende de ε, una constante
de proporcionalidad, denominada coeficiente de extinción, que es específica de cada
cromóforo. Como A es adimensional, las dimensiones de ε dependen de las de c y l. La
segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se hace,
siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de ε resultan ser M-1·cm-1. Este
coeficiente así expresado, en términos de unidades de concentración molar (o un
submúltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extinción molar (εM). Cuando, por
desconocerse el peso molecular del soluto, la concentración de la disolución se expresa en
otras unidades distintas de M, por ejemplo g·L-1, las dimensiones de ε resultan ser
distintas, por ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado se denomina coeficiente
de extinción específico (εs). La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas.
La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en espectrofotómetros.
Aunque pueden variar en diseño, en especial con la incorporación de ordenadores para el
análisis de datos, todos los espectrofotómetros constan de:
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Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud
de onda a la que se va a realizar la medida. Se mide primero la absorbancia del disolvente
(conocido como blanco) y al que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando,
de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto la
absorbancia es cero. A continuación se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee
la absorbancia de ésta. (Ver figura 4) (Abril, Bárcena, Fernández, Galván, Jorrín, Peinado,
Meléndez &Túnez).
Turbidimetría:
La turbidimetría es un campo analítico relacionado con la colorimetría, tanto en el aspecto
teórico como experimental. La turbidimetría determina la cantidad de luz no dispersada, el
fundamento de esta técnica es la dispersión de la luz por partículas no transparentes
suspendidas en un líquido, como por ejemplo, precipitado y suspensiones coloidales.
Cuando se utiliza esta técnica con fines cualitativos se suelen construir curvas de calibrado
con muestras de concentraciones conocida. Estas muestras (precipitados o suspensiones)
deben prepararse bajo condiciones rigurosamente controladas ya que la cantidad de luz
dispersada depende no solo de la concentración sino también del tamaño y número de
partículas implicadas. Para que la luz dispersada pueda utilizarse comparativamente es
necesario que tanto el número de partículas como su tamaño sean del mismo orden.
Además, la longitud de onda de luz que es dispersada más eficazmente depende también
del tamaño de las partículas. Bajo condiciones controladas, se puede lograr que el tamaño
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MATERIALES
Micropipeta de 1000µL
Micropipeta de 200µL
Micropipeta de 100µL
Baño termostático
Vórtex.
Espectrofotómetro
Baño de hielo
Tubos tapa rosca
Gradillas
Balones volumétricos de 100 ml
Glucosa
DNS
Solución madre de levadura.
PROCEDIMIENTO
Volumen de
Concentración Volumen de agua
Solución solución madre
(g/L) destilada (µL)
(µL)
Blanco 0 1000
1 125 875
2 250 750
3 500 500
4 750 250
5 1000 0
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Nota:
Recuerde que las soluciones deben estar homogéneas en los momentos de hacer
diluciones y hacer las lecturas de absorbancias.
Los filtros nunca deben ser tocados directamente, use siempre pinzas dispuestas en
el laboratorio.
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OBJETIVO
MARCO TEÓRICO
Proteínas
Las proteínas son los materiales que desempeñan un mayor número de funciones en las
células de todos los seres vivos. Por un lado, forman parte de la estructura básica de los
tejidos (músculos, tendones, piel, uñas, etc.) y, por otro, desempeñan funciones metabólicas
y reguladoras (asimilación de nutrientes, transporte de oxígeno y de grasas en la sangre,
inactivación de materiales tóxicos o peligrosos, etc.). También son los elementos que
definen la identidad de cada ser vivo, ya que son la base de la estructura del código
genético (ADN) y de los sistemas de reconocimiento de organismos extraños en el sistema
inmunitario.
Aminoácidos
Son macromoléculas orgánicas, constituidas básicamente por carbono (C), hidrógeno (H),
oxígeno (O) y nitrógeno (N); aunque pueden contener también azufre (S) y fósforo (P) y, en
menor proporción, hierro (Fe), cobre (Cu), magnesio (Mg), yodo (I), entre otros.
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Prueba Biuret: Es una prueba general para proteínas, no especifica. Cuando una
proteína reacciona con sulfato de cobre (II) (color azul) se forma como respuesta positiva
un complejo color violeta. La prueba Biuret trabaja para cualquier tipo de compuesto que
posea uno o más de los grupos siguientes:
Prueba Xantoprotéica: Los anillos fenilo que contengan un grupo activante pueden
ser nitrados produciendo un compuesto amarillo. La producción de un producto coloreado
amarillo al añadir ácido nítrico es una prueba para la presencia de tirosina o triptófano en
una proteína. La adición de base fuerte hace que el color se torne más oscuro hacia
anaranjado. Las manchas amarillas en la piel causadas por ácido nítrico son el resultado de
la reacción Xantoprotéica.
Prueba para metales pesados: Los metales pesados tienen el efecto de precipitar
proteínas de sus soluciones creando enlaces (cross-linkings) entre los grupos amino libres y
los grupos carboxilo libres. Los iones más comúnmente usados para detector la presencia
de proteínas incluyen Zn 2+, Fe 3+ , Cu 2+ , Sb 3+ , Ag 1+ , Cd 2+ y Pb 2+
Entre los metales, Hg 2+, Cd 2+, y Pb 2+ tienen una alta toxicidad. Estos pueden causar serios
daños a las proteínas (especialmente enzimas) desnaturalizándolas. Victimas que han
ingerido iones de mercurio o plomo se tratan con un antídoto de algún alimento rico en
proteínas. La proteína se combina con los iones de mercurio y plomo minimizando la
absorción de tales iones. Los alimentos más usados son leche y clara cruda de huevo. La
proteína que se precipita es removida inmediatamente del estómago mediante un lavado
estomacal (Alices. 2009).
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Prueba Hopkins Cole: Es específica del grupo indol característico del Triptófano. El
anillo del indol se hace reaccionar con ácido Glioxálico en presencia de ácido Sulfúrico
concentrado para formar un compuesto violeta que se forma en la interfase entre la solución
de proteína y el ácido sulfúrico. La reacción de Hopkins Cole es positiva sólo para las
proteínas que contienen Triptófano. Se supone que el ácido concentrado hidroliza las
proteínas en la interfase liberando el Triptófano para dar el producto violeta. Sin embargo,
el Triptófano puro en solución no da positiva la reacción, a menos que se agreguen agentes
oxidantes, por lo que es de suponer que el Triptófano de las proteínas no se libera como tal,
por lo cual la reacción presentada es sólo parcialmente correcta.
MATERIALES
Leche Hidróxido de sodio al 25%
Harina de trigo Hidróxido de sodio al 50%
Huevo Sulfato de cobre al 1%
Gelatina sin sabor Acetato de plomo al 2%
Tubos de ensayo Ácido clorhídrico concentrado
Baño termostático. Etanol
Ácido nítrico concentrado
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PROCEDIMIENTO
Preparar las siguientes soluciones:
Solución de albúmina 30% v/v.
Solución de harina de trigo 1% v/v.
Solución de gelatina sin sabor 3%p/v.
Reacción Xantoprotéica
Prueba de Biuret
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Desnaturalización
Xantoprotéica
Aminoácido azufrados
Biuret
Desnaturalización
Conclusiones
PREGUNTAS
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I.¿Qué es un péptido?
II.¿Qué es un enlace peptídico?
III.¿Cuál es la estructura de una proteína?
IV.¿Cuáles son las reacciones de cada una de las pruebas realizadas en el laboratorio?
V.¿Existen otras pruebas cualitativas y/o cuantitativas diferentes para la identificación de aminoácidos en
proteínas? ¿Cuáles?
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Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que
sean termodinámicamente posibles: Una enzima hace que una reacción química que es
energéticamente posible pero que transcurre a una velocidad muy baja transcurra a mayor velocidad
que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas
denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi
todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las
reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas. Las enzimas son un ejemplo
de que no sólo es importante lo que comemos sino que además es indispensable una buena capacidad
de absorber esos nutrientes.
OBJETIVOS
MARCO TEÓRICO
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Termamyl 120L es un producto enzimático líquido que contiene α-amilasa sobresaliente termoestable
expresada en y producida mediante una cepa genéticamente modificada de Bacilluslicheniformis. Se
utiliza en las industrias de:
Almidón: Licuefacción continúa del almidón en cocedores a presión o en equipos que operan a
similar temperatura.
Alcohol: Adelgazamiento del almidón en los macerados de la destilación.
Cervecería: Licuefacción del almidón.
Azúcar: Rompimiento del almidón presente en el jugo de caña. Por lo que el contenido de
almidón en el azúcar crudo se reduce y la filtración en la refinería se facilita.
La enzima es una endoamilasa que hidroliza las uniones 1,4α-glucosídicas de la amilosa y
amilopectina. Por lo que el almidón se rompe rápidamente en dextrinas solubles y oligosacáridos
(Termamyl 120L).
Los pasos para transformar el almidón en jarabe glucosado son dos: licuefacción, y sacarificación.
Durante el proceso de licuefacción se obtienen malto dextrinas empleando la enzima alfa amilasa. Estas
malto dextrinas contienen diferentes oligosacáridos y dextrinas y es ligeramente dulce. Luego se puede
continuar la conversión a glucosa usando la enzima amiloglucosidasa conocida también como
glucoamilasa. Esta última etapa se conoce como sacarificación, donde la amiloglucosidasa puede
transformar las malto dextrinas casi completamente en glucosa; en la práctica se produce también un
poco de maltosa (Cruz, 2012).
MATERIALES
Almidón soluble.
DNS
Lugol
Soluciones Buffer 0.1 M
Citrato con pH:3.5
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PROCEDIMIENTO
Número de tubo pH
1 3,5
2 6,3
3 9
4 3,5
5 6,3
6 9
Llevar los tubos de ensayo por 3 minutos a baño de 90oC para temperar.
Agregar 0.5 mL de la enzima diluida a los tubos a los 1,2 y 3,
Agregar 0.5 mL agua destilada a los tubos a los 4,5 y 6
Agitar y dejar los 6 tubos en el baño de 90oC por 30 minutos.
Agregar 0.5ml de NaOH 2M a todos los tubos, para parar la reacción.
Tomar 0,5 mL de cada uno de los tubos y agregar 30µL de lugol.
Tomar 1 mL de cada uno de los tubos y agregarlos a un tubo seco y limpio.
Realizar protocolo de DNS a cada uno de los tubos anteriores.
Comparar la intensidad de los colores tanto para la prueba con lugol como para la del DNS
entre los tubos 1-4, 2-5 y 3-6.
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Número de tubo °C
1 25
2 60
3 90
4 25
5 60
6 90
Nota: La actividad enzimática será reportada como µmol de azucares formados por litro de solución
por minuto por cantidad de enzima.
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OBJETIVOS
MARCO TEÓRICO
Los gránulos de almidón, que se producen en las plantas a partir de la fotosíntesis de dióxido de
carbono, están formados por polímeros de glucosa y sirven como reservas de energía. Hacia el final de
la temporada de cultivo, el almidón se acumula en las ramas de los árboles, cerca de las yemas.
También se encuentra en frutas, semillas, rizomas y tubérculos. Los gránulos de almidón son muy
adecuados para el almacenamiento a largo plazo, debido a que es un material compacto, la sequedad
relativa y alta estabilidad.
La transformación del almidón crudo en agua caliente se llama gelatinización: los gránulos se hinchan
y estallan, formando una pasta. Durante el almacenamiento prolongado o refrigeración, la pasta de
almidón a menudo se espesa debido a un fenómeno llamado retrogradación. Gelatinización y
retrogradación, que corresponden a modificaciones estructurales en los gránulos, afectan el
comportamiento del almidón que contienen los sistemas.
En consecuencia, el almidón es excelente para modificar la textura de muchos procesados y los
alimentos cocinados en casa (por ejemplo, como harina de maíz o harina para espesar las salsas) y
también ha sido utilizado durante siglos para otros fines, incluida la fabricación de papel, colas o
refuerzos de la tela. Hoy en día, las nuevas aplicaciones del almidón son emergentes, incluyendo las
fibras de las dietas bajas en calorías, los materiales biodegradables, envases, películas delgadas y
materiales termoplásticos.
Los gránulos de almidón nativos varían enormemente de forma y de tamaño (desde 0,1 a 200 nm), pero
todos tienen una característica común: bajo el microscopio e iluminados con luz polarizada, granos de
almidón teñidos con yodo presentan una "cruz de Malta" distintiva lo que indica la existencia de algún
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orden interno común. Cuando los gránulos se calientan en exceso de agua, la “cruz” comienza a
desaparecer, lo que demuestra que este orden molecular se está interrumpido (Almidón: un misterio
estructural).
MATERIALES
Almidón
Agua.
Lugol
PROCEDIMIENTO
Preparar 100 ml de una solución de almidón al 10% p/v, con la cual se realizaran cada uno de los
siguientes procedimientos:
ó −
% = 100
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d) Índice de hinchamiento.
Añadir 3 g de almidón en una probeta de 10 mL.
Medir el volumen ocupado por el almidón.
Agregar agua destilada hasta completar un volumen de 10 mL.
NO AGITAR.
Dejar reposar.
Medir el volumen de almidón cada 10 o 15 minutos hasta observar que no haya variación.
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7. TRANSESTERIFICACIÓN PARA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL
OBJETIVO
Producir biodiesel a partir de aceite de palma, mediante una reacción de transesterificación con
metanol.
Determinar el índice de acidez de algunos aceites mediante la norma NTC por el método con
etanol caliente usando indicador.
MARCO TEÓRICO
La transesterificación es un término general que se utiliza para designar a las reacciones orgánicas en
las cuales se produce un intercambio o sustitución del grupo acilo o alquilo de un éster. Desde una
perspectiva más contextualizada, podríamos definir la transesterificación como la reacción mediante la
cual, los triglicéridos (TG) presentes en los aceites vegetales y grasas animales se combinan con un
alcohol de bajo peso molecular usualmente metanol o etanol en presencia de un catalizador adecuado,
para formar glicerina y ésteres metílicos o etílicos. Los alquil ésteres grasos obtenidos a partir de la
reacción anterior, poseen propiedades y tamaño similares a los constituyentes del combustible diesel, y
es lo que se conoce como biodiesel.
Los catalizadores que se suelen utilizar a escala comercial son los catalizadores homogéneos básicos.
Se ha reportado que la síntesis de biodiesel catalizada por bases es 4000 veces más rápida que al usar
ácidos, pero tiene la desventaja que necesita materias primas refinadas con un contenido de agua menor
al 0,5 % p/p y de ácidos grasos menor al 1,0% p/p. Entre las ventajas de utilizar un catalizador
heterogéneo frente al homogéneo y enzimas, se puede mencionar: reutilización del catalizador,
facilidad de procesos continuos, uso de materias primas de diversa fuentes, no se forman jabones,
purificación más sencilla, no se necesita neutralizar, tiempo de reacción menores. Entre los posibles
inconvenientes, podrían presentarse: resistencia a la transferencia de masa, mayor temperatura de
reacción y lixiviación de las especies activas.
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En la síntesis de biodiesel, el uso de catalizadores estructurados permitirá eliminar algunos pasos del
proceso, como neutralización y lavado en el caso de los catalizadores homogéneos, filtrados para los
heterogéneos. Este ahorro de etapas podría compensar el mayor costo del catalizador si se superan los
problemas operativos que imponen entre otros aspectos la posibilidad de regeneración y reuso del
catalizador. El depósito de catalizador en polvo sobre el monolito debe cumplir tres requisitos
fundamentales: asegurar una cantidad suficiente de catalizador, formar una capa homogénea y tener
una adherencia suficiente para su manipulación y uso (Damiani, Reinoso & Tonetto. 2011)
Los ésteres grasos obtenidos a partir de la reacción dada, poseen propiedades y tamaños similares a los
constituyentes del combustible diesel, y es lo que se conoce como Biodiesel (Torossi. 2006)
Tanto la acidez del aceite como su contenido acuoso, son parámetros importantes para tener en
cuenta, por lo que una valoración previa de la acidez del aceite, es importante para determinar la
cantidad de catalizador capaz de neutralizarla sin disminuir su acción catalítica. Para el aceite de palma
a usar, se supondrá un índice de acidez de 1.5 mg NaOH/g aceite (Torossi. 2006)
La relación molar entre el alcohol y el aceite es una de las variables más influyentes en el
rendimiento de la reacción y en la viscosidad final del biodiesel. El alcohol más utilizado es el metanol
debido a su polaridad y a su estructura de cadena corta. Si bien la estequiometria para la reacción
requiere tres moles de alcohol por mol de aceite, en la práctica, se incrementará (9:1) para desplazar el
equilibrio hacia una mayor formación de ésteres metílicos (Torossi. 2006).
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Los catalizadores a utilizar, son catalizadores básicos, como el hidróxido de sodio o de potasio.
Es de suma importancia utilizar reactivos concentrados, para minimizar la presencia de agua. La
cantidad de catalizador a usar el 1% p/p con respecto a la cantidad de aceite más la cantidad de
catalizador necesario para neutralizar el ácido presente en el aceite (índice de acidez) (Torossi. 2006).
Definiciones
Acidez: contenido de ácidos grasos libres determinados de acuerdo con el procedimiento especificado
en la norma NTC 218. La acidez se expresa como porcentaje en masa. Si el resultado de la
determinación se reporta como acidez, sin explicación adicional, ésta es, por convención, la acidez
expresada con base en ácido oleico.2) Si la muestra contiene ácidos minerales, por convención, se
determinan ácidos grasos.
Índice de acidez: número de miligramos de hidróxido de potasio requeridos para neutralizar los ácidos
grasos libres presentes en 1 g de grasa, cuando se determina de acuerdo con el procedimiento
especificado en la norma NTC218. El Índice de acidez se expresa en miligramos por gramo
Realizar los cálculos correspondientes para procesar 50 gramos de aceite de palma (100% de
pureza, densidad 856 g/mol) con la relación anteriormente indicada.
Calcular el peso de catalizador necesario en la reacción y para neutralizar la acidez del aceite
PROCEDIMIENTO
Transesterificación
1. Pesar el catalizador y disolverlo en el metanol.
2. Pesar 50 gramos de aceite y calentarlo para climatizar (60 grados centígrados).
3. Agregar la solución de catalizador-Metanol al aceite de palma.
4. Pasar mezcla a un balón volumétrico con un magneto y poner en el montaje esquematizado en
la figura 3.
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Determinación del índice de acidez por Método con etanol caliente usando indicador.
Materiales
Etanol 95% v/v neutralizado según la norma NTC.
2,5g de aceite.
Solución de NaOH al 0,25M normalizada.
Bureta.
Procedimiento
1. Pesar 2,5g de aceite en un Erlenmeyer de 100 ml.
2. Agregar 50 ml de etanol neutralizado (según la norma NTC.) a 75ºC
3. Mezclar y llevar a ebullición.
4. Titular con NaOH a 0,25 M, agitando vigorosamente.
5. Determine el índice de acidez (ecuación 1).
6. Calcular la acidez (ecuación 2).
56,1
Í = (1)
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= (2)
10
Donde
V: volumen usado de NaOH 0,25M en la titulación (mililitros).
c: concentración exacta de NaOH (moles/Litro).
m: masa de aceite (gramos).
M: masa molar del aceite (gramos/mol) (Tabla 1).
PREGUNTAS
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OBJETIVOS
Demostrar la presencia de diversos tipos de microorganismos en la naturaleza.
Aislar microorganismo de diferentes microambientes.
MARCO TEÓRICO
Cualquier ser vivo necesita tomar del ambiente una serie de compuestos que se emplean como fuente
de energía, y para sintetizar los constituyentes celulares. Estos compuestos se denominan nutrientes.
Los nutrientes deben contener agua, C, N, S, P, Ca, K, Na, Mg, Mo, Cu y Zn.
En función de la fuente de energía, los microorganismos se clasifican en:
· Fotótrofos: utilizan la luz como fuente de energía
· Quimiótrofos: Oxidan compuestos químicos inorgánicos para obtener energía.
En función de la fuente de carbono, los microorganismos se clasifican en:
· Autótrofos: CO2
· Heterótrofos: Compuestos orgánicos carbonados.
Los microorganismos en estado natural crecen de forma heterogénea o mixta. Cuando queremos
estudiar un microorganismo dado, debemos aislarlo. Un cultivo puro es aquel que contiene un solo tipo
de microorganismo. El modo de obtener estos cultivos consiste en obtener colonias aisladas, que
provienen de una sola célula (son clones). Hay diferentes métodos para obtenerlas
METODOLOGÍAS EMPLEADAS PARA EL AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS:
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Encienda el mechero y realice el procedimiento cerca de este. Con el asa estéril tomamos la muestra y
hacemos extensiones en la placa. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y extendemos parte de la
extensión anterior en otra dirección. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y volvemos a extender
parte de la segunda extensión en otra dirección. Esterilizamos y repetimos la operación.
Incubamos a 37 º durante 24 horas y, en la primera zona, habrá un amasijo de células. En la segunda,
parte de la primera zona estará mejor extendida, y en la tercera y en la 4ª mejor aún. Si tomamos una
colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un cultivo puro.
2. siembra por el método de las diluciones sucesivas
PROCEDIMIENTO
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Muestreo.
Metodología de Cultivo:
Bacterias:
1. Tomar 5g de tierra y diluir en 45ml de agua destilada estéril (solución madre)
2. A partir de la solución madre realizar diluciones sucesivas, Tomando 1ml de solución madre y
diluyéndola en 9ml de agua destilada estéril y así sucesivamente hasta obtener una dilución 10-
3
.
3. Tomar de cada uno de los tubos con el aza de aro una gota y proceder a sembrar por
agotamiento en la caja de petri con medio de cultivo NBPRI.
4. Incubar a 37 ºC durante 24 horas.
Hongos:
1. Tomar un trozo pequeño de madera invadida por el hongo, o cortar un pedazo de hongo (por
las lamelas).
2. Realizar el lavado del hongo para disminuir posibles contaminantes así:
Llevarlo a una solución de etanol, dejar 1 minuto, sacar y secar en papel absorbente.
Introducirlo en una solución de hipoclorito, por 1 minuto, sacar y secar en papel.
Lavar finalmente en una solución de agua destilada estéril por 1 min, sacar y secar en
papel.
3. Llevar el trozo de hongo lavado a la caja de petri con medio de cultivo KIMURA, y
sembrarlo en el centro de la caja realizando un poco de presión para hundir un poco el hongo
en el agar.
4. Incubar a 37 ºC durante 24 horas.
Levaduras:
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Microalgas:
1. La muestra de agua con microalgas será la solución madre.
2. A partir de la solución madre realizar diluciones sucesivas, Tomar 1ml de solución madre y
diluirla en 9ml de medio de cultivo CHU13 y así sucesivamente hasta obtener una dilución 10-3.
3. Incubar a temperatura ambiente e iluminación por 7 días.
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OBJETIVOS
Aprender a manejar adecuadamente el microscopio compuesto binocular.
Observar y describir las características morfológicas de las colonias.
Utilizar el método de coloración de Gram para caracterizar una colonia bacteriana.
Clasificar microorganismos de acuerdo con las características morfológicas.
MARCO TEÓRICO
Las células son las unidades básicas de los seres vivos. La mayoría de ellas son de tamaño muy
pequeño por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los microscopios para su
visualización. El microscopio óptico, utiliza la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto.
Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se
consiguen aumentos mayores. Actualmente existen diferentes tipos de microscopios: Microscopio
óptico, simple, compuesto, de luz ultravioleta, de fluorescencia, petrográfico, de campo oscuro, de
contraste de fase, de luz polarizada, confocal, electrónico, electrónico de transmisión, electrónico de
barrido y otros aún más complejos.
Nota: En el laboratorio es de vital importancia conocer los requerimientos mínimos para el manejo de
microorganismos. Sobra decir que todo microorganismo en el laboratorio se debe manipular como si
este fuera potencialmente perjudicial para la salud. En la práctica cuando se manipulan
microorganismos provenientes de muestras ambientales se debe tener especial cuidado en no perder
microorganismos en las diferentes etapas de aislamiento, como tampoco permitir la contaminación.
Caracterización de microorganismos
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Morfología bacteriana
La forma de la célula bacteriana es una característica que está determinada genéticamente, por ello es
constante para cada especie (a pesar que existen pequeñas variaciones durante los ciclos reproductivos)
y es una característica fundamental en taxonomía e identificación de especies a nivel de laboratorio. Su
morfología puede agruparse en tres formas básicas (ver tabla 1):
a. Cocos (esféricas): Presentan forma esférica o casi esférica ya que sus diámetros (largo y ancho)
son casi iguales. En algunos casos se observan formas ovoides, arriñonadas, o lanceoladas. La
forma celular está directamente relacionada con las estructuras de envoltura de la célula.
b. Bacilos o Bastones (cilíndricas): células con una morfología más variable, caracterizada porque
uno de los ejes o diámetro es notablemente mayor que el otro, de tal manera que se observan como
bastoncitos de diferente ancho y longitud. Al observar algunas especies bacterianas, éstas
presentan diferentes formas durante su multiplicación siendo posible observar células filamentosas,
bacilos cortos, ovoides, etc; a esta propiedad se le denomina pleomorfismo o polimorfismo. En
otros casos las formas bacilares se acortan en forma notable llegando casi a adoptar la forma ovoide
(morfología cocobacilar).
c. Helicoidales o curvas (espirales): Generalmente células aislada; muy largas en relación a su ancho
y se observa una torción alrededor de su eje (espiras) en un número característico para cada especie
(ejemplo: Spirochaeta, Treponema, Leptospira). Las bacterias cortas y de espiral incompleto se
denominan bacterias en comma o vibriones.
d. Bacilos miceliares: Entre las bacterias, existen algunas capaces de desarrollar en un comienzo un
micelio rudimentario, el que luego se fragmenta, ejemplo: Streptomyces sp., entre otras.
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Los hongos son los descomponedores primarios de la materia muerta de plantas y de animales en
muchos ecosistemas, y como tales poseen un papel ecológico muy relevante en los ciclos
biogeoquímicos. Los hongos se presentan bajo dos formas principales: hongos filamentosos
(antiguamente llamados “mohos”) y hongos levaduriformes. El cuerpo de un hongo filamentoso tiene
dos porciones, una reproductiva y otra vegetativa. La parte vegetativa, que es haploide y generalmente
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no presenta coloración, está compuesta por filamentos llamados hifas (usualmente microscópicas); un
conjunto de hifas conforma el micelio (usualmente visible). A menudo las hifas están divididas por
tabiques llamados septos.
El ciclo de vida del hongo puede ser Anamorfo, fase del ciclo de vida con reproducción asexual, o
Teleomorfo, fase del ciclo de vida con reproducción sexual.
Según lo anterior las Esporas, elementos de perpetuación de la especie, pueden ser:
Mitosporas (asexuales): Artrosporas, Clamidiosporas, Blastosporas, Conidiosporas.
Los hongos levaduriformes —o simplemente levaduras— son siempre unicelulares, de forma casi
esférica. No existen en ellos una distinción entre cuerpo vegetativo y reproductivo.
Para determinar el tipo de hongo se deben observar las características de la colonia:
Si la colonia es cremosa de color rosado o crema, se puede tratar de levadura.
Si la colonia es algodonosa se trata de un hongo filamentoso.
Si se observa setas u orejas se trata de Basidiomicetes.
Las principales características de los hongos representativos que se observaran en el laboratorio son:
Rhizopus: micelio no tabicado y algodonoso, esporangios muy anchos y oscuros. La base del
esporangio en forma de copa. Presencia de rizoides y zigospora .
Mucor: micelio claro y no tabicado, columnillas redondas u ovoides, esporas oscuras y de apariencia
lisa. No poseen rizoide.
Aspergillus: micelio ramificado y cenocítico conidióforos tabicados o no tabicados, fialides
implantadas sobre una vesícula.
Penicillum: micelios vegetativos tabicados , fialides ramificadas.
Levaduras: células individuales en forma ovoide, con cicatrices por la gemación.
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Las algas son organismos fotosintetizadores que habitan principalmente cuerpos de aguas dulces y
saladas. Dependiendo de la especie, existen algas unicelulares, coloniales y multicelulares. La gran
mayoría de algas presentan tamaños microscópicos que varían desde 1 µm hasta 300 µm, sin embargo
existen algunas especies microscópicas que incluso pueden alcanzar dimensiones superiores a los 50 m.
Tradicionalmente se han divido en grupos basados en su coloración así: algas verdes (Clorofitas), algas
oscuras (Feofitas), algas rojas (Rodofitas) y algas pardas (Crisofitas). Las “algas verdeazules -
Cianofitas”, son microalgas procariotas.
Ciertas algas se pueden encontrar asociadas en la naturaleza con diferentes tipos de hongos. A dicha
asociación simbiótica se le conoce como líquenes. El hongo proporciona el soporte y absorbe
minerales y nutrientes del suelo, mientras que el alga a través de su acción fotosintética, aporta las
moléculas orgánicas.
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Preparaciones
Preparaciones no coloreadas: Con este método se observan los microorganismos vivos, lo que
permite detectar el tipo de movilidad y la viabilidad de los mismos.
Preparaciones coloreadas: Como los microorganismos son incoloros y tienen el mismo índice de
refracción del agua, es necesario utilizar colorantes para poderlos visualizar. Los métodos para
observar los microorganismos proporcionan las siguientes ventajas:
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Un contraste entre la bacteria y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar los tipos
morfológicos microbianos.
Una visualización de las estructuras internas y externas tales como. Espora, equivalente nuclear,
gránulos citoplasmáticos, pared celular, cápsula y flagelo.
Una de las coloraciones más utilizadas en el laboratorio, para la identificación de microorganismos es
la coloración de Gram, por tal razón se verá en detalle.
Coloración de Gram
La coloración de Gram es un método que ha permitido la división de las bacterias en dos grupos: El de
Gram positivas y el de las Gram negativas. La técnica está basada en la capacidad de las bacterias para
retener el colorante cristal violeta durante la decoloración con el alcohol acetona.
Las bacterias Gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona, perdiendo el color púrpura propio
del cristal violeta (Figura 2).
Las bacterias Gram positivas no se decoloran y retiene el color violeta. Después de la decoloración, se
utiliza la safranina, que es un colorante de contraste de color rojo, dicho colorante da un color rosado a
las células decoloradas (Figura 3).
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Las bacterias Gram positivas presentan una gruesa capa de péptidoglicano como estructura
fundamental por sobre la membrana citoplasmática, y las Gram negativas, encima de ésta, presentan
una delgada capa de péptidoglicano, a la que se superpone una capa de lipopolisacáridos-lipoproteína,
denominada membrana externa. La presencia de esta membrana diferencia actualmente dos divisiones
en sistemática bacteriana: las que no lo poseen, Gram (+) y las que sí, Gram (-). La diferencia entre
ambos grupos es pues de enorme importancia taxonómica. En el comportamiento como patógenos y en
la sensibilidad antibacteriana difieren sustancialmente; de ahí que la realización rápida de una
coloración de Gram, reviste enorme importancia en los procesos biotecnológicos y en la bacteriología
clínica (Facultad de química farmacéutica).
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
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1. Observación en fresco. Se realiza un frotis, el cual consiste en tomar con un asa una
muestra de la colonia y esparcirla en el porta objetos, previamente humedecido con
una gota de agua, realizando movimientos horizontales. Se adiciona una muestra de
colorante (azul de metilo) a la muestra fresca. La observación en fresco se utiliza
para hongos y levaduras (cristal violeta o azul de metilo), micro algas (lugol),
células vegetales o bacterias coloreadas.
PREGUNTAS
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Manejo del equipo. Antes de hacer uso del microscopio reconozca sus componentes y sus
funciones. El microscopio es un instrumento delicadamente ajustado que se debe manejar
con mucho cuidado.
Conecte el microscopio a una fuente de energía
Direccione la placa que tiene el especímen con los mandos de movimiento del
portaobjetos
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Seleccione el objetivo que necesita (Aplique aceite de inmersión cuando use el objetivo
de 100X). Cuando finalice la observación, asegúrese de limpiar el lente del objetivo y
cualquier parte del microscopio que esté cubierta con aceite.
Al finalizar su uso: Cúbralo para protegerlo del polvo, Los lentes no se deben tocar con los
dedos. El polvo en el lente ocular debe limpiarse con una brocha de cerdas finas o un paño.
De manera similar si una superficie de cristal requiere limpieza. También puede limpiarse
con un paño o tela de textura suave o con papel especial para lentes;. Las partes metálicas
pueden limpiarse con un paño humedecido. El alcohol no es recomendable para la limpieza
de ninguna de las partes del microscopio.
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OBJETIVOS
MARCO TEÓRICO
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MATERIALES
Erlenmeyer Mechero
Cajas Petri Cámara de flujo laminar
Tubos de ensayo Autoclave
Incubadora
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PROCEDIMIENTO
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OBJETIVOS
NOTA: Los ítems marcados con * deben ser consultados por cada equipo de trabajo.
MARCO TEÓRICO.
La Cinética de crecimiento celular para microorganismos está dada por la ecuación:
dN/dt∗=μN
Dónde:
dN/dt: cambio del número de microorganismos en el tiempo
μ: velocidad especifica de crecimiento celular (horas-1)
N: número de microorganismos (número de células)
Producción de etanol*
Solubilización de fosfatos*
Remoción de colorantes*
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MATERIALES
PROCEDIMIENTO
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Preparación del inóculo. Se toma una colonia aislada de una cepa pura de bacterias
solubulizadoras sembrada por estrías por agotamiento en placa de agar a 30º C
Microalgas
Inocular con un 10% V/V de la microalga, con un cultivo que tenga una buena
densidad celular.
Se cuentan las células en los 4 cuadros L y se calcula el promedio, teniendo en cuenta que
Promedio Células x 10000=X cel/ml
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Medio sólido
Levaduras
Preparación del inóculo.Activar la levadura a las siguientes condiciones: 30°C y 150 rpm
durante 24 horas.
0 + . →2 +
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Figura 2. Fermentómetro
1,047
=
Donde
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