Ciencias de la Vida Y la

DEPARTAMENTO: CARRERA: Ingeniería en Biotecnología

Agricultura
PERIODO
ASIGNATURA: Fitoquímica 201811 NIVEL: 5to
LECTIVO:
DOCENTE: Dra. Blanca Naranjo NRC: 3832, 3833, 2834 PRÁCTICA N°: 9
LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA
Laboratorio N°3 de Docencia.
PRÁCTICA:
TEMA DE LA
IDENTIFICACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE ALCALOIDES POR VARIAS TÉCNICAS ANALÍTICAS.
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
El procedimiento analítico está basado en el método de Shamsa et al. (2008), consiste en la reacción de alcaloides (solamente aquellos
que tienen nitrógeno en el interior de su estructura con verde de bromocresol (BCG), dando lugar a la formación de un complejo de
transferencia de carga alcaloide-verde de bromocresol, a un pH 4,7, de color amarillo, susceptible de una determinación
espectrofotométrica a 470 nm (Amanlou et al., 2007; Shamsa et al., 2008). El método ofrece las ventajas de sencillez, la sensibilidad, la
estabilidad y la escasa interferencia por otros compuestos
OBJETIVOS:
 Separar y aplicar procedimientos que permitan aislar los alcaloides de matrices vegetales
 Investigar los diferentes tipos alcaloides presentes en las matrices vegetales por medio de pruebas químicas de coloración y
cromatografía de capa fina, espectros de absorción.
 Determinación cuantitativa de alcaloides en muestras de especies vegetales.
MATERIALES:
REACTIVOS:
• Reactivo de Dragendorff
INSUMOS:
• Reactivo de Mayer
• 1 Erlenmeyer de 25 mL
• Reactivo de Wagner
• Tubos de ensayo
• Metanol
• Gradilla
• Cloroformo
• pipetas
• Hidróxido de sodio
• Vasos de precipitación
• Verde de bromo cresol
• Embudo de separación
• Fosfato ácido de sodio
• Ácido cítrico
EQUIPOS:
• Cámara cromatográfica
• Lámpara Ultravioleta
• Espectrofotómetro
• Espectrofotómetro
• Embudo de separación
• Agitador
MUESTRA:
Muestra vegetal como: semillas, hojas, flores de plantas se sospeche o sepa poseen alcaloides.
INSTRUCCIONES:
Utilice ropa de protección: vestimenta apropiada, mandil, guantes, gafas de seguridad, cabello recogido.
Llegue puntual a la hora de la práctica.
No olvide su muestra, su franela y una práctica IMPRESA POR GRUPO.
ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES:

a.- Solución de Verde bromocresol (BCG)

Se pesan 69,8 mg de verde de bromocresol y se agregan en un vaso de precipitado de 50 mL, se mezclan con 3 mL de NaOH de
concentración 2 mol/L y 5 mL de agua destilada, hasta que esté completamente disuelto y la solución se diluye hasta 1000 mL con
agua destilada en un balon de 1000 mL.
b.- Solución de ácido cítrico de 0,2 mol/L
Se pesan 42,02 g de ácido cítrico monohidratado y se disuelven en un litro de agua destilada en un balón volumétrico.
c.-Solución tampón de fosfato acido de sodio a pH 4,7.
Se pesan 71,6 g de Na2HPO4 y se disuelven en agua destilada, usando un balón aforado de 1 litro y se ajusta el pH con la
solución de 0,2 mol/L de ácido cítrico hasta llegar a un pH de 4,7.
d.- Solución estandar de atropina
Se pesa 1 mg de atropina y se disuelve con agua destilada aforado en un balón volumétrico de 10 mL.
2. Preparación para la curva de calibración

Tabla 1. Preparación de curva de calibración

Fosfato ácido de sodio pH= 4,7 Verde de bromo cresol (BCG)

Blanco.- 2 ml de agua destilada 5 mL 5 mL

Patrón 1.- 0,5 mL de Atropina 5 mL 5 mL

Patrón 2.- 0,8 mL de Atropina 5 mL 5 mL

Patrón 3.- 1,0 mL de Atropina 5 mL 5 mL

Patrón 4.- 1,2 mL de Atropina 5 mL 5 mL

Patrón 5.- 1,5 mL de Atropina 5 mL 5 mL

Patrón 5.- 2,0 mL de Atropina 5 mL 5 mL

A continuación, añadir 2 mL de cloroformo a cada embudo de separación. La fase clorofórmica se separa y se recoge en
un balón volumétrico de 10 mL, previamente rotulado. Se sigue agregando consecutivamente al embudo de separación
2 mL de cloroformo y luego dos veces más de 3 mL de cloroformo, después se afora con cloroformo los matraces de 10
mL (V final para todas las soluciones es de 10 mL). La absorbancia del complejo formado y disuelto en cloroformo se
mide a 470 nm frente al blanco preparado, como anteriormente se describió, pero sustituyendo la atropina por agua
destilada (2 mL). Con los valores de las absorbancias y las cantidades de atropina en cada estándar se hace la gráfica
de la curva de calibración que debe ser lineal, con un valor de r2 aceptable de entre 0,997 y 1,000.

3.- Preparación de extractos acuosos por percolación

La capacidad de absorción de humedad de la planta es fundamental considerar. Se realiza un extracto acuoso a una
concentración 0,2 g/mL (20 g de droga en 100 mL de agua destilada). Se coloca 20 g de la droga cruda en un vaso de
precipitado de 250 mL y se le agrega la mitad del volumen de agua destilada caliente y se cubre con papel aluminio, se
espera 60 minutos, luego se coloca la droga húmeda en el equipo de percolación y se adiciona el resto del total del
volumen de agua destilada caliente, esperar por 30 minutos, una vez transcurrido este tiempo se procede a filtrar el
extracto.
4.- Procedimiento para determinar cuantitativamente alcaloides en el extracto acuoso

Se transfieren 5 mL del extracto a un embudo de separación con 5 mL de solución de BCG y 5 mL de solución fosfato
medidos con pipetas volumétricas de 5mL. La mezcla se agita y se retira el tapón del embudo para expulsar el gas en el
embudo. El complejo formado es extraído con 2, 2, 3 y 3 mL de cloroformo, agregados cada uno consecutivamente, de
la misma forma como se extrajeron los estándares, separando la capa de cloroformo. Los extractos de cloroformo se
recogen en un balón volumétrico de 10 mL y se completa el volumen con cloroformo (volumen final es de 10 mL). Este
análisis se hace por triplicado. La absorbancia del complejo formado y disuelto en cloroformo es medida en un
espectrofotómetro de absorción a una longitud de onda de 470 nm.
5.- Cálculos
Para calcular las cantidades de alcaloides en las muestras se utiliza la ecuación de la curva de calibración. A través de
un ejemplo se harán los cálculos.
Para una ecuación de la curva de calibración
y= 1,502 x – 0,165
Se despeja x que es la variable equivalente a la cantidad de alcaloides
Obteniendo el valor de la cantidad de alcaloides (x) en el extracto en cloroformo x= 0,016 mg expresar en el volumen de
aforo de la solución de la muestra.
0,016 mg_________________5 mL
X _________________100 mL x = 0,33 mg
Este resultado se lo expresa en valores de masa/masa con los datos de la elaboración del extracto:
20 g de droga ______________ 0,33 mg
1g _______________ x

Se obtiene un 0,016 mg/g de droga cruda.

De esta forma llevamos el resultado a masa de alcaloides equivalentes a atropina/masa seca de la especie vegetal.
Se hace el reporte de los resultados, incluyendo el de la validación del método analítico.
Reporte el resultado de las reacciones positivas o negativas.
Realice los cálculos de Rf.
Los resultados serán reportados de la siguiente manera:
Pruebas cualitativas con reactivos cromogénicos:
Tabla 2. (-) ausencia del alcaloide, (+) poca presencia del alcaloide, (++) moderada presencia del alcaloide, (+++)
elevada presencia del alcaloide.

CUESTIONARIO:
1. Cuál es el principio de las reacciones de coloración entre los alcaloides y los reactivos cromogénicos?
2. Porqué se debe aplicar varias reacciones de coloración para confirmar la presencia de un alcaloide?
3. Todos los alcaloides reaccionarían de la misma manera con los reactivos de coloración?
4. Qué implica realizar un análisis cuantitativo de alcaloides?
CONCLUSIONES:
Se confirma la presencia de metabolitos secundarios alcalinos “ALCALOIDES” presentes en las matrices vegetales,
identificados con reacciones de coloración así como con cromatografía en capa fina y factores de retardo y los espectros
de absorción correspondientes y las concentraciones presentes en los extractos vegetales.
RECOMENDACIONES:
Durante el desarrollo de la práctica, tenga cuidado con el uso y manejo de los solventes, no descarte lo residuos hasta no estar
claro de la fase donde se encuentran los compuestos presentes en el medio correspondiente.

FIRMAS

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Nombre: Dra. Blanca Naranjo P. Nombre: Ing. Valeria Ochoa Nombre: Dra. Patricia Jiménez A.
DOCENTE COORDINADOR ÁREA DE CONOCIMIENTO COORDINADOR DE LABORATORIOS