CONCEPTO

La secuenciación determina la secuencia de los nucleótidos de un oligonucleótido de ADN atreves

de diferentes métodos o tecnología de las cuatro bases nucleótidos: timina, guanina, citosina y
adenina; para ser llamada secuenciación debe ver por lo menos cuatro sucesiones de nucleótidos.
Al transcurrir el tiempo la tecnología que se empleaba en para obtener la secuenciación de ADN ha
ido mejorando logrando obtener secuencias completas de genomas de numerosos tipos y especies
de seres vivos, incluyendo el genoma humano, animales, vegetales y especies microbianas.

DESARROLLO DE LA HISTORIA

En el transcurso del tiempo gracias al aporte descubrimiento de la estructura del ADN por los
científicos Watson y Crick, el estudio del ADN en fue avanzando por los diferentes científicos en el
transcurso del tiempo que idearon métodos y técnicas para ver más detalladamente como es la
secuenciación del ADN, se produjeron millones de secuencias de especies de arqueas, bacterias y
eucariontes.

Empezaron a ver estudios sobre el genoma de la levadura S. cerevisae en cual se usó el método
bioquímico de hidrolisis parcial con enzimas y fraccionamiento de los productos generados en
columnas de intercambio iónico o electroforesis en papel, fue así como se empezó a desarrollas los
principales protocolos de secuenciación de ácidos nucleicos. Se le da reconocimiento al científico
M. Maxan y Walter Gilbert quienes establecieron el proceso de digestión química del DNA para
determinar la secuencia de nucleótidos del ADN. Consiste en marcar en los extremos 5´ o 3´ de una
o puede ser de ambas hebras con el isótopo radiactivo del fósforo, el 32P. La muestra tomada del
ADN se divide en cuatro alicuotas y dando origen a cuatro reacciones químicas distintas. Para los
nucleótidos de Ademina y Guanina, se metilan con DMS y se trabaja en un medio alcalino, logrando
asi el fragmento de las cadenas en las purinas metiladas. En cambio, para los nucleótidos de la
Citosina y Timina, se trabajan con hidracina y luego con piperidina que logra el fragmento de ambas
pirimidinas. Luego con los fragmentos de obtenidos del ADN generados se separan en geles de
acrilaminda por vía electroforesis en cuatro vías distintas según sea el tamaño, por las bandas
generadas por medio autoradiografia. Sabiendo con que nucleótido se realizaron los cortes, es
factible la ver la naturaleza de los nucleótidos y logrando inferir la secuencia de la molecula original.

Esta técnica permitió conocer y hacer lectura de unas 100 bases de secuencia, logrando determinar
la secuencia desde la primera base.

En 1977 se dio a conocer un nuevo método de secuenciación que se le dio el nombre de

“secuenciación enzimática de Sanger” , que revolucionaria la biología molecular como se la conocía
en ese entonces.

Este nuevo protocolo su objetivo es hacer cuatro reacciones diferentes de síntesis de ADN utilizando
la función propia del ADN polimerasa, empleando un didesoxinucleotido y un nucleótido marcado
radiactivamente con Dntp, diferente en cada tubo. Se vierte el ADN polimerasa a la mezcla,
empezara añadir nucleótidos a la cadena complementaria hasta que, por haber añadido un ddNTP,
se neutralice la síntesis de la hebra complementaria por no presentar un extremo 3′, se puedan
seguir añadiendo nucleótidos a la hebra complementaria. La incorporación de los ddNTPs es al azar,
para asi tener muestras de fracmentos de todos los tamaños posibles que terminan en un residuo
específico. Después, estos fragmentos se pueden separar en un gel de poliacrilamida vía
electroforesis en cuatro carriles distintos para hacer lectura de abajo a arriba, la secuencia de la
hebra de origen.

Este método se pudo determinar secuencias de 80 nucleotidos, para tener mayores longitudes es
necesario partir de 15 cebadores que empiecen a formar una nueva reacción a una separación de
80 nucleotidos después y asi sucesivamente.

Al transcurrir el tiempos este método de Sanger se automatizo por Leroy Hood, Michael Hunkapiller
y Lloyd Smith.

En 1986, se dio la comercialización del primer secuenciador automático del método Sanger, el
Applied Biosystems 370A, un secuenciador automatizado con gel tipo “slab” o gel en vertical que
nos permitía lograg obtener 200 bases por muestra/ hora. Existían otros secuenciadores de geles
“slab” son el ASTRAL o el LI-COR Modelo 4200, que producían mayor información por medio de la
realización de variaciones térmicas en su construcción. Luego en la siguiente generación se
incorporo la electroforeis capilar, resaltando el equipo ABI PRISM 3700. fue empleado para llevar a
cabo la secuenciación del genoma humano planteado en el Proyecto Genoma Humano (1985-2003).

Este método era muy caro y demandaba mucho tiempo determinar el genoma humano ,es por eso
que se dio el origen de la conocida como Next Generation Sequencing (NGS), ultrasecuenciación o
tecnología de secuenciación masiva,realiza multiples secuencias cortas, logrando obtener millones
de lecturas en el mismo tiempo y el costo era bajo a comparación de otro métodos.

Luego hubo una segunda generación se basan en la técnica se centra en la preparación del DNA a
secuenciar y el protocolo empleado en la secuenciación. Según la técnica empleada en la
preparación del DNA como puede ser de dos tipos PCR en emulsion y PCR en puente.

Secuenciadores de tercera generación son desarrollados por las plataformas Pacific Biosciences y
Oxford Nanopore. llevan a cabo la llamada secuenciación a tiempo real (SMRT) que usa adaptadores
circulares y a través de un tipo especial de chips en donde se logra verificar el cambio de actividad
sufrida por la DNA polimerasa tras la adicción del nucleótido marcado con fluoróforo en el caso de
Pacific Biosience, o puede ser por la detección de una variacion de voltaje producido por el paso de
la secuencia de DNA por algún poro, composición del DNA a secuenciar, tanto de una cadena en
sentido foward, el caso de Oxford Nanopore, cuya idea innovadora se reconocer a la figura de
George M. Church.

LA PIROSECUENCIACION

Es el método de secuenciación de ADN, basado en la fuga de pirofosfatos a partir de sus dNTPs en

una reacción de polimerización del ADN. En este método requiere la presencia de una molecula
mono cateriana de ácido desoxirribonucleico el cual se hibrida con un pequeño cebador. Al pasar el
tiempo se ira sintetizando la cadena se obtendrá una serie de picos de señal en el pirograma en cual
lograremos obtener la secuencia