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CTB Biorreactores2016
CTB Biorreactores2016
BIOTECNOLOGIA
(FCEyN – UBA )
Biotecnología Industrial
Producción industrial de Metabolitos
Biorreactores
Miryan Cassanello
PINMATE – Dep. Industrias, FCEyN-UBA
E-mail: miryan@di.fcen.uba.ar
Ingeniería Química
Biología
Química
Bioquímica
Biotecnología AZUL:
Aplicación en
Biotecnología ROJA: organismos marinos
Aplicación en medicina
Biotecnología Biotecnología
ROJA AZUL
BIOTECNOLOGIA
Biotecnología Biotecnología
VERDE BLANCA
Biotecnología VERDE:
Aplicación en agro- Biotecnología BLANCA (o industrial):
alimentos Aplicación en la industria en general,
productos químicos, nuevos materiales,
biocombustibles, etc.
BIOTECNOLOGIA
INDUSTRIAL
Metabolitos Metabolitos
Primarios Secundarios
Metabolitos primarios
-Moléculas generalmente sencillas, que participan de los caminos
metabólicos esenciales. Son casi idénticos en todos los organismos.
-Son más baratos y sencillos de producir, tienen bajo contenido de
“actividad biológica” y frecuentemente son “commodities”
1. Componentes esenciales de las células/microorganismos:
proteínas, ácidos nucléicos, polisacáridos (gelanos, xantanos) y
poliésteres, ácidos grasos (insaturados), esteroles.
2. Derivados del metabolismo intermedio: azúcares (fructosa,
ribosa, sorbosa), ácidos orgánicos (gluconato, ácido láctico,
cítrico, acético, propiónico, succínico, fumárico), alcoholes
(xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminoácidos (Lys,
Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (B2, B12), nucleótidos
saborizantes (ácidos inocínico y guanílico), polisacáridos y
poliésteres de reserva.
Microorganismos productores: bacterias, levaduras y hongos
Metabolitos secundarios
-Moléculas mas complejas, que participan de caminos metabólicos
no-esenciales, pero confieren capacidades de supervivencia en
situaciones de stress.
-Son muy variados y su estructura es fuertemente dependiente de la
especie y variedad utilizada para su producción. Se generan en
condiciones particulares y son más valiosos y complicados de
producir ⇒ alto contenido de “actividad biológica”
-Generalmente son productos especiales (alto precio). Funcionan
en los organismos que los producen como:
1. Armas contra otros microorganismos (antibióticos, toxinas,
inhibidores enzimáticos, pesticidas)
2. Factores de crecimiento (hormonas)
3. Ionóforos
4. Agentes de interacción microbiana
5. Efectores externos
PROCESOS BIOTECNOLOGICOS o
FERMENTACIONES
Procesos que se llevan a cabo en un “bio”-reactor mediante los cuales
se transforman los sustratos de un medio de cultivo (materias primas)
en metabolitos y/o en biomasa (productos) empleando para este fin
microorganismos, células o enzimas.
Biorreactor
o
Fermentador
Operaciones Operaciones
unitarias unitarias
Principales etapas de un proceso biotecnológico industrial:
Fermentación
Propagación Separación
de los Tratamiento
Esterilización de efluentes
cultivos Purificación
Preparación
de medios
1) Propagación de cultivos: comienza en un tubo de ensayo o un tubo
congelado o liofilizado donde se conserva la cepa de interés, o de
una colonia del microorganismo previamente seleccionado. Se
propaga en el laboratorio progresivamente aumentando el volumen
del medio de cultivo.
∑S + X → ∑P + nX
El crecimiento microbiano es un ejemplo de reacción auto-
catalítica. La velocidad de crecimiento está relacionada con la
concentración de células.
Velocidad específica neta de 1 dX
crecimiento (h-1): µ neta ≡
X dt
X: concentración másica de células (g/L)
t: tiempo (h)
µ neta = µ g − k d
También se puede expresar la velocidad en función de la
concentración de número de células en lugar de la concentración
másica de las mismas. Si no se pueden medir las dos, se prefiere
la concentración másica.
Formas de medir la concentración de células
Se busca un método rápido, fácil de seguir en línea o de respuesta
rápida.
Directos
Métodos Indirectos
Determinación de la concentración másica de células:
Métodos directos (en ausencia de otros sólidos en suspensión):
•Masa de células secas (centrifugado/filtrado/lavado/secado)
•Volumen de células centrifugadas en condiciones estándar
•Absorción de luz por células en suspensión
luciferasa Sensible
luciferina + ATP + O 2 → LUZ
> 10-12 gATP/L
Cinética de crecimiento de un cultivo en batch
Etapas:
1) de latencia o
inducción
2) de crecimiento
exponencial
3) de desacelera-
ción
4) estacionario
5) de muerte o
declinación
celular
3)4)
Desaceleraci
Estacionario: por consumo
ón: velocidad de de un nutriente
crecimiento nula.esencial
Las o generación
células aún son de
5)
1)
2) Latenciabaja
Muerte:
Crecimiento
subproductos
el númerodel inóculo
: adaptación
exponencial:
tóxicos
células,aldifícil
medio. definir
rápida multiplicación
crecimiento desbalanceado,
el límite
Depende
de del
las
con la
inóculo
células
células deben
activas
etapa y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibióticos,
(edadanterior.
readaptarsey tamaño)
crecimiento
a y de los(composición
balanceado
las condiciones nutrientes.
hostiles. Sedepuede adaptar
células ex-situ.
constante).
hormonas) productos de la desregulación celular
1) Latencia: adaptación del inóculo al medio. Depende del
inóculo (edad y tamaño) y de los nutrientes. Se puede adaptar
ex-situ.
2) Crecimiento exponencial: rápida multiplicación de células
crecimiento balanceado (composición de células constante).
3) Desaceleración: por consumo de un nutriente esencial o
generación de subproductos tóxicos crecimiento
desbalanceado, las células deben readaptarse a las condiciones
hostiles.
4) Estacionario: velocidad neta de crecimiento nula. Las células
aún son activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej.
antibióticos, hormonas) productos de la desregulación celular
5) Muerte: baja el número de células, difícil definir el límite con
la etapa anterior.
Crecimiento balanceado: todos los componentes de las células
crecen con la misma velocidad → la composición media de las
mismas permanece constante. Es válido para la etapa de crecimiento
exponencial.
exponencial
En este período, la velocidad de crecimiento es independiente de los
nutrientes y resulta en una cinética de primer orden porque el valor es
aproximadamente constante:
1 dX dX µ neta t
µ g ≅ µ neta = ⇒ = µ neta dt ⇒ X = X 0e
X dt X
Tiempo necesario para duplicar la biomasa:
ln(2)
X = 2X 0 ⇒ τd =
µ neta
Crecimiento no balanceado: los componentes de las células no
crecen con la misma velocidad → la composición media se modifica.
Esta situación caracteriza especialmente a la etapa estacionaria
El estrés producido por la falta de nutrientes o por la existencia de
subproductos o toxinas inhibidoras que generan un medio hostil
induce una reestructuración de las células para adaptarse a las nuevas
condiciones.
µ g ≠ µ neta = µ g − k d
Puede ocurrir:
•La concentración másica de células (X) es constante pero baja el
número de células viables.
•X baja por lisis de células. Puede aparecer un segundo período de
crecimiento, los productos de lisis o las células muertas constituyen
un sustrato alternativo (crecimiento críptico).
•X constante pero su metabolismo es activo; cambia la regulación
celular produciendo metabolitos secundarios.
Coeficiente de mantenimiento:
1 dS
m= - se emplea para definir la velocidad
X dt m específica de consumo de sustrato
para energía de mantenimiento.
Los rendimientos
dependen del medio
y de la fuente de C.
Para la mayoría de
los casos:
YX /S = 1± 0,4 g/g
g biomasa
g de C consumido
Relación del crecimiento de biomasa con la formación de
productos:
∑S + X → ∑P + nX
Definimos la velocidad específica de 1 dP
formación de producto, qP qP = = YP / X µ g
X dt
Se encuentran 3 situaciones:
(a) qP asociada al crecimiento celular,
ej: producción de una enzima constitutiva q P = α µ g ⇒ α = YP / X
de la biomasa (metabolito primario).
(b) qP parcialmente asociada (etapa de
desaceleración y estacionaria), ej: fermentación de q = α µ + β
P g
ácido láctico, xantanos y algunos metabolitos
secundarios.
(c) q no-asociada al crecimiento
P
celular (etapa estacionaria, donde la q P = β = cons tan te; µg = 0
µg=0) ej.: metabolitos secundarios
como antibióticos.
Relación del crecimiento de biomasa con la formación de
productos:
1 dP 1 dX
qP = = YP / X µ g = YP / X
X dt X dt
•El O2 se
introduce por
burbujeo y su
concentración
depende de la
agitación.
•Velocidad de consumo de µg X
oxígeno (O2 uptake rate) OUR = q O 2 X =
YX / O
2
•Velocidad de transferencia
(O2 transfer rate) OTR = k L a LG C*O − C O b
2 2
Factores que influyen – otros factores
•Concentración de CO2 disuelta puede afectar. Puede ser tóxica para algunas
células y necesaria para otras.
Se regula modificando la concentración en la corriente de burbujeo.
CH m O n + a O 2 + b NH 3 → c CH α Oβ N δ + d H 2O + e CO 2
∑i,sustratos ν i γ i = ∑i,productos ν i γ i
ν i :coef .estequiometri cos ; γ i :grados de reduccion
Cinética de crecimiento microbiano: Modelos
productos mayor cantidad
Sustrato + biomasa → +
extracelulares de biomasa
∑S + X → ∑P + nX
(
µ neta ≡ µ g − k d ≡ )
1 dX
X dt
µneta: Velocidad específica neta de crecimiento (h-1)
µg: Velocidad específica de crecimiento de biomasa (h-1)
kd: constante de muerte celular o disminución de masa celular por
metabolismo endógeno (h-1)
X: concentración másica de células (g/L)
t: tiempo (h)
Cuantificación de la cinética de crecimiento: modelos cinéticos
(
X f − X 0 = YX / S S0 −S )
kg
m3
La mayoría de las fermentaciones operan con una relación Xf/X0 de
aproximadamente 10–20. La velocidad de producción de biomasa
por operación del reactor batch, rb , se calcula dividiendo la masa
total que podemos formar por el tiempo que lleva la operación:
YX / SS0 kg
rb =
(1/ µneta )ln(Xf )
X0 + t m m3s
Masa que sale Masa consumida Masa que entra Masa generada
del V.C. con + = al V.C. con +
los productos dentro del V.C. los reactivos dentro del V.C.
Quimiostato - ecuaciones de diseño
Masa que sale Masa consumida Masa que entra Masa generada
del V.C. con + = al V.C. con +
los productos dentro del V.C. los reactivos dentro del V.C.
Fv Fv Balance de masa de células:
S0, X0, P0 S, X, P
FV X = FV X 0 + Vµ neta X
V
(
⇒ FV X = FV X 0 + V µg − k d X )
FV: caudal volumétrico de medio
Gas de cultivo agregado (L/h)
Definiendo el factor de dilución como caudal/volumen: D = FV/V
(
⇒ DX = DX 0 + µg − k d X ) Si se alimenta medio estéril (X0= 0) y
el mecanismo endógeno es despreciable
(
⇒ DX = DX 0 + µg − k d X ) ⇒ D = µg
Importancia de este resultado: En un quimiostato en
µ
D= g EE, alimentado con medio estéril y en condiciones
en las que el metabolismo endógeno es despreciable,
la velocidad o factor de dilución, D, iguala a la
velocidad de crecimiento de células
se puede manipular la velocidad de crecimiento como un parámetro
independiente modificando las variables de operación
el quimiostato es una herramienta experimental poderosa
µm S
D = µg = S: concentración de sustrato limitante
Ks + S del crecimiento de biomasa en EE
Masa que sale Masa consumida Masa que entra Masa generada
del V.C. con + = al V.C. con +
los productos dentro del V.C. los reactivos dentro del V.C.
1 1
FVS + Vµ g X M + Vq P X = FVS0
YX /S YP /S
Formación de biomasa Formación de producto
(
X = YXM/S S0 −S )
M
D 2
Ks
µ mS DK s ⇒ DX = YX /S DS0 −
D = µg = ⇒ S=
µ − D
K s +S µm − D m
D op K s
DX )op = YXM/SD op S0 −
µ m
− D
op
DX )op = YX /Sµ m 1−
M
K
Ks
+ S
(
S + K − K K +S
0 s s s 0
( ))
s 0
M
Normalmente Ks<< S0 ⇒DX)op →YX /S mS0 µ
Efecto del factor de dilución sobre la concentración de células,
D (1/h) S (kg/m ) 3 X (kg/m3)
concentración de sustrato y la productividad. 0.06 0.006 0.427
0.12 0.013 0.434
0.24 0.033 0.417
0.5 1 S0 0.31 0.04 0.438
0.43 0.064 0.422
0.53 0.102 0.427
0.4 3 0.8 0.6 0.122 0.434
X (kg/m )
0.66 0.153 0.422
0.69 0.17 0.43
0.3 0.6 0.71 0.221 0.39
0.73 0.21 0.352
0.2 0.4 DX
3
(kg/h.m
0.3)
0.1 0.2
3
S (kg/m )
0.2
0 0
0 0.2 0.4 0.6 0.8
-1
D (h ) 0.1
µm 0
0 0.2 0.4 -1
0.6 D (h0.8)
Algunas aplicaciones de los sistemas continuos:
- producción de algunas proteínas
- tratamiento de efluentes, en particular cuando se emplean
microorganismos o enzimas inmovilizadas.
- producción de etanol
- producción de productos asociados a crecimiento,
especialmente en gran escala (por ejemplo, ácido
láctico)
Fv α: relación de reciclo
S0,X0,P0 basada en caudales
αFv
Fv(1+α) volumétricos.
S1,cX1,P1
S1,X1,P1 c: factor de concentración
relación de la
concentración de
células en la corriente
Fv
de reciclo sobre la que
V S1,X2,P1
sale del reactor
(
Vµ neta X1 = (1+ α ) FV X1 − αFV cX1 ) V
Fv
S1,X2,P1
µ neta = D(1+ α − cα ) Gas
Fv
αFv S0,X0,P
µ neta = D[1+ α(1− c)]
S1,cX1,P 0 Fv(1+α)
1 S1,X1,P1 Como c > 1 ⇒ α(1-c) < 0
µ neta < D
Fv Cuando hay reciclo, el
V S1,X2,P quimiostato puede operar con
1 una velocidad de dilución
Gas
mayor que la de crecimiento
BM sustrato limitante (en EE):
Masa que sale Masa consumida Masa que entra Masa generada
del V.C. con + = al V.C. con +
los productos dentro del V.C. los reactivos dentro del V.C.
1 1
(1+ α )FVS1 + Vµg X1 M + Vq P X1 = FVS0 + αFVS1
YX /S YP /S
Formación de biomasa Formación de producto
BM sustrato limitante
(en EE y en ausencia de productos extracelulares):
1 1
(1+ α )FVS1 + Vµg X1 M + Vq P X1 = FVS0 + αFVS1
YX /S YP /S
1
( )
⇒ Vµg X1 M = FV S0 + αS1 − (1+ α )FVS1
YX /S
⇒ X1 =
D
µg
(
YXM/S S0 −S1 )
(
YXM/S S0 −S1 )
Si k d = 0 ⇒ µ g = µ neta = D[1+ α(1− c)] ⇒ X1 =
1+ α(1- c )
Fv
Velocidad de αFv S0,X0,P0
generación de S1,cX1,P1 Fv(1+α)
X1,cr
biomasa S1,X1,P1
c = 2 ; α = 0.5
X1,sr
V
con reciclo Gas
sin reciclo Fv
S1,X2,P1
Quimiostatos múltiples en cascada: en algunas fermentaciones,
particularmente para la producción de metabolitos secundarios (ej.:
un antibiótico), conviene separar las etapas de crecimiento de
biomasa y de formación del producto deseado pues las condiciones
óptimas son diferentes
con múltiples quimiostatos, se pueden fijar condiciones
distintas en cada uno: pH, temperatura, conc. de nutrientes
Vf
V0 V
X0,S0,P0 Xf,Sf,Pf
X,S,P
1)Carga 3)Recuperación
2)Realimentación
del producto
1) Desde la carga hasta el momento de la realimentación periódica,
el sistema se comporta como un batch: X = X + Y M S − S
0 X /S
(0 )
Xm es la máxima X a alcanzar con S0 , que se da
⇒ X m = YXM/SS0
cuando S << S0 y para la cual también X0 << Xm
Operación con alimentación semi-continua “Fed-batch”:
Cuando X ≅ Xm , se agrega una corriente de
Fv,S0 (X0) nutrientes frescos con un caudal volumétrico
Fv y de una concentración S0. La variación de
volumen es: dV
= Fv ⇒ V = V0 + (Fv) t
dt
V
Durante la realimentación, el BM de biomasa
X,S,P es: d(VX ) dX dV
2)Realimentación FV X 0 + Vµ neta X = =V +X
dt dt dt
entra + se genera = se acumula
dX FV
= X 0 + µ neta X −
dt V
X dV
V dt
( )
= DX 0 + X µ neta − D ⇒
dX
dt
(
≅ X µ neta − D )
Como el sustrato se consume casi todo ⇒ dX/dt ≅ 0
(condición de estado cuasi-estacionario). Luego:
µneta ≅ D
Como D ↓ porque ↑ V, µneta va disminuyendo continuamente.
Operación con alimentación semi-continua “Fed-batch”:
BM para el sustrato:
Fv,S0 (X0) Vµg X Vq X d(VS)
FVS0 − − P =
YXM/ S YP / S dt
entra − se consume = se acumula
Si no consideramos la formación de
V productos y dado que la masa de sustrato
X,S,P se mantiene siempre µg (XV )
2)Realimentación baja y ≅ constante: FVS0 =
YXM/ S
d(XV )
⇒ = µ neta (XV ) ≅ FVS0 YXM/ S ⇒ (XV )= X 0 V0 + FVS0 YXM/ S t
dt
(es igual en ausencia de metabolismo endógeno)
V (mL)
1000 µ (h-1)
Variación de las X (g/L)
P (g/L) 0.6
concentraciones de V (mL)
800
biomasa, sustrato y
producto, y de la
velocidad de 600 0.4
crecimiento y volumen
del cultivo en función
del tiempo, para el 400 µ (h )
-1
0 0
0 0.5 1 1.5 t 2(h)
Sistemas con microorganismos inmovilizados: la inmovilización
de microorganismos tiene aplicación si los productos son
extracelulares
Ventajas sobre los cultivos con células en solución:
•Proveen una alta concentración de células
•Las células se usan en forma continua y se eliminan costosos
procesos de recuperación y reciclo de células
•Se eliminan el problema del “washout” a altas velocidades de
dilución
•Se pueden lograr altas productividades
•Se puede lograr un medio local favorable que conduce a mayores
rendimientos y una mejor performance del biocatalizador
•En algunos casos mejora la estabilidad genética
•En algunos casos disminuye el daño por abrasión de las células
Sistemas con microorganismos inmovilizados
Esquema de una
columna de burbujeo
H/D~1–2
Tanques agitados de
escala laboratorio
Tanques agitados de
escala laboratorio con
células inmobilizadas
Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2-20 litros)
H ~ 15 m de alto
D ~ 4,2 m de diámetro
vórtice
Agitación y distribución de gas en reactores agitados
•La determinación de la velocidad de transferencia de oxígeno y
el calor liberado son claves para el diseño de los fermentadores.
•La velocidad de transferencia de O2 depende de la dispersión
de gas, que es función del tipo de reactor; ej: en tanques
agitados, aumenta al aumentar la velocidad de agitación.
> RPM
Influencia de la velocidad de agitación sobre la turbulencia y
la dispersión de gas inducida por agitación mecánica en un
reactor de laboratorio de 2L.
Reactor agitado en
suspensión de
escala banco: 20cm
de diámetro y de
alto (volumen ~ 8L)
Reactor tanque agitado:
Problemas ocasionados por
la evolución de espuma:
-peligro de contaminación
-complica la circulación de
gases vórtice
-complica el mezclado
-cambian las velocidades
de transferencia masa y de
calor
Configuraciones comunes de fermentadores: columnas de burbujeo
Columna de burbujeo de escala banco: V~10L
Columnas de burbujeo para el
cultivo de algas
Columnas de burbujeo
Regímenes de flujo en columnas de
burbujeo: depende del caudal de gas y
del distribuidor que se emplee
Configuraciones comunes de fermentadores
Configuraciones de recirculación interna inducida por el flujo de
aire “Air-lift”
Escala
banco
(0,2 x 2)m
luz
La multiplicación implica
replicar muchas veces el
resultado que se obtiene
en un reactor de escala
relativamente pequeña, en
lugar de llevar a cabo el
proceso en un reactor de
mayor tamaño.
Producción de ácido glucónico
Producción de gluconato de sodio con A. niger
Producción de antibiótico
Producción de lisina (10000 ton/año)
en 20 fermentadores de 250 m3
Producción de vacunas para cólera (Suecia)
Drogas medicinales
Reglas de uso : basadas en análisis dimensional y criterios de
similaridad de algunos parámetros
30 Potencia/Volumen
30 kLaLG
20 Concentración de oxígeno
La concentración de
oxígeno es diferente en
distintas zonas del
reactor. Se puede simular
considerando varios
reactores con distinta
alimentación de oxígeno
Modelo del sistema que supone
dos compartimientos con distinta
concentración de oxígeno