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la separación de moléculas de DNA por la electroforesis en gel, técnica que depende de un campo
eléctrico el cual es producido por electrodos sometidos a un potencial eléctrico.
Entre las sustancias biológicas más importantes se encuentran los ácidos nucleicos, los cuales son
compuestos fundamentales de la célula viva. Desde el descubrimiento de la estructura de doble
hélice por James Watson y Francis Crick en 1953 *, el estudio de los ácidos desoxirribonucleico
(DNA) y ribonucleico (RNA), ha sido abordados por las diversas ciencias del conocimiento
principalmente la química y la biología, sin embargo este campo no es ajeno a las ciencias físicas.
Gracias a la dinámica molecular han surgido técnicas de laboratorio que sirven para estudiar el
tamaño, la conformación y la carga de los fragmentos de DNA*, entre los que destacan la
electroforesis; la cual consiste en utilizar una matriz coloidal, que es un gel poroso que permite la
separación de los fragmentos de DNA, a la cual se aplica una corriente eléctrica por dos electrodos
y debido a que los fragmentos tienen la misma densidad de carga, sufren de una fuerza de
atracción proporcional a su masa y gracias a esto los fragmentos más pequeños atraviesan la
matriz porosa con mayor velocidad, el resultado de este estudio es una secuencia de bandas que
al ser comparadas con un marcador estándar se puede establecer el tamaño y forma de los
fragmentos estudiados, esta técnica se ha seguido desarrollando y mejorando a través del tiempo.
A continuación haremos una revisión de la evolución de la electroforesis a través del análisis de
algunos artículos de divulgación científica.
Configuración de electrodos utilizados en CHEF, los electrodos (alambre de platino, 0.030 pulgadas
de diámetro) se suspendieron en una disolución al 0.5 de disolución tampón formada por Tris,
borato y EDTA (45 mM tris, 45 mM borato, 1.25 mM EDTA, pH 8.3) y conectados a una serie de
resistencias de 820 ohm y 2 Watts para el arreglo cuadrado y de 470 ohm y 2 Watts para el arreglo
hexagonal, la alternación de la orientación del campo se generó por un timer (GrabLab modelo
451)
Aunque la electroforesis en gel por campos eléctricos alternados permite trabajar con fragmentos
de mayor tamaño, aún tiene ciertos inconvenientes, entre los que destacan la irregularidad del
campo eléctrico lo que provoca que las moléculas de DNA migren con trayectorias que dependen
de la posición del gel de electroforesis con respecto al campo aplicado, lo que da como resultado
que la comparación de las muestras sea muy difícil.
Material y métodos.
Al realizarse la electroforesis, se utiliza una placa de gel por lo que el campo eléctrico dentro de
esta puede delimitarse al plano (x, y), porque solo existirían las componentes E_x y E_y. Se conoce
que el campo eléctrico puede representarse como el negativo del gradiente de una función escalar
llamada potencial eléctrico __
Ec 1
Ec 2
Donde OMEGA O es el voltaje aplicado a través de los electrodos, al sustituir la Ec. 2 en la Ec. 1,
los campos eléctricos generados por los electrodos son homogéneos y perpendiculares a los
electrodos
Ec3
Es ilógico pensar en un electrodo infinitamente largo, pero es factible producir un campo eléctrico
homogéneo con un sistema finito **, utilizando múltiples electrodos sobre el contorno de un
polígono cuyas caras coinciden con las posiciones del hipotético electrodo infinito. Los electrodos
en y=0 y y=a, se fijan a los potenciales 0 y OMEGA0, respectivamente y los electrones intermedios
se fijan puntos entre 0 y omega o del potencial dados por la Ec. 2.
Al aplicar el teorema de la unicidad, en todos los puntos del espacio fuera del arreglo de los
electrodos debe cumplirse la ecuación de Laplace
Al suponer que existe un potencial que satisface la Ec. 5, y que cumpla con las condiciones
especificadas en la superficie del polígono de electrodos, asumimos que existe la función
Ec 6
Que también es solución de la Ec. 5, debido a que la ecuación de Laplace es lineal, si OMEGA y PSI
satisfacen la Ec. 5, entonces cualquier combinación lineal de estas funciones también lo hará
Ec7
Ec 8
Por supuesto la función W no satisface la condiciones de frontera sobre los electrodos, de hecho,
en la superficie, W=0, debido a que omega y psi, tienen el mismo valor sobre la superficie. W será
solución de un arreglo de electrodos que están sujetos a un potencial cero, por lo que se concluye
que W=0 para todos los puntos del espacio. Ahora si W tiene un extremo en un punto P,
consideremos una esfera centrada en ese punto, se sabe que la media sobre la esfera de una
función que satisface la ecuación de Laplace es igual al valor de su centro, y como W no tiene
ningún máximo o mínimo al ser W=0 en todo el espacio se concluye que pfi=omega en todo el
espacio por lo que solo existe una única solución que satisface la ecuación 5 y las condiciones de
frontera sobre la superficie del arreglo de electrodos, con lo que se comprueba que en cualquier
lugar dentro del polígono existirá un potencial igual al generado por dos electrodos infinitos.
A partir de lo demostrado con anterioridad Chu, Vollrath y Davis utilizan dos arreglos de
electrodos diferentes, uno cuadrangular y otro hexagonal, los cuales se muestran en la figura 1, en
estos contornos dos de los electrodos opuestos definen la orientación del campo eléctrico, la
alternación en la orientación del campo se produce por un prendido y apagado de los electrodos,
el ángulo entre estos campos eléctricos alternados viene dado por la geometría del arreglo, 90°
para el cuadrangular y 120° o 60° para el hexagonal, dependiendo de la posición de la placa de gel
de electroforesis con respecto al hexágono y la asignación de la polaridad de los electrodos.
Los electrodos intermedios se pueden fijar a los potenciales deseados por cualquier método, por
ejemplo al utilizar una serie de resistencias de 820 ohm y 2 Watts para el arreglo cuadrado y de
470 ohm y 2 Watts para el arreglo hexagonal, aunque estas resistencias son muy parecidas a las
del gel, lo cual dista mucho de un circuito ideal no obstante se han encontraron buenos resultados
al utilizar esta configuración de resistencias.
El gel de electroforesis esta constituido por una disolución al 0.5 de disolución tampón formada
por Tris, borato y EDTA (45 mM tris, 45 mM borato, 1.25 mM EDTA, pH 8.3)
Los campos eléctricos homogéneos con orientaciones alternadas se han utilizado ampliamente en
la electroforesis en gel para separar DNA de levaduras en la figura 2 se exhiben los resultados de
un aparato de electroforesis en gel con campos eléctricos ortogonales alternados (OFAGE por sus
siglas en ingles), en el cual el gel de electroforesis está sujeto a diversas orientaciones de campo
eléctrico (entre 120° y 150°) debido al tamaño de la placa del gel y los electrodos. En cambio en los
arreglos presentados en la figura 1, los geles están sujetos a campos uniformes, esta diferencia se
observa fácilmente en el patrón de separación el cual es más recto en los arreglos CHEF que en el
OFAGE, lo que permite hacer una mejor comparación entre las muestras.
Los autores Schwartz y Cantor han concluido que un gradiente en un campo eléctrico fuerte es
necesario para obtener una buena resolución, sin embargo, Chu, Vollrath y Davis observaron que
aún mas importante que el gradiente del campo eléctrico, un ángulo correcto de reorientación es
crucial, esta conclusión es apoyada por el hecho de que los ángulos menores a 90° probados
experimentalmente obtuvieron una resolución menor, a pesar de que cuentan con un gradiente
intenso.
Otro método de electroforesis en gel, es el de la inversión de campo **7, donde el campo eléctrico
se invierte periódicamente y así un solo par de electrodos pueden utilizarse para generar un
campo eléctrico homogéneo, pero debido a que la migración del DNA no es una función
monotónica de tamaño, ocurre una comigración de moléculas que difieren de tamaño al aplicarse
en fragmentos de DNA muy grandes, problema que puede resolverse al escoger un rango
apropiado de pulsaciones, por su lado el CHEF produce una excelente resolución en moléculas
muy grandes de DNA.
Fig2
Utilizando los CHEF se puede identificar la estructura secundaria del DNA, tales como el DNA
superenrollado o el ramificado, debido a que tales estructuras presentan anomalías de movilidad
en respuesta a los cambios de voltaje**10. Para separar las estructuras lineales de las otras
estructuras se utiliza un arreglo cuadrangular de electrodos para generar un CHEF con campos
eléctricos de intensidad diferente en ambas orientaciones, el DNA con estructuras secundarias
termina encontrándose en puntos deslocalizados al arco de las moléculas lineales.