SEPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUIMICA DE LA ENZIMA 1,3-

PROPANODIOL OXIDORREDUCTASA PROVENIENTE DE UNA CEPA NATIVA

DE Clostridium spp IBUN 158.

Ruiz López José Hilario

Procesos de Bioseparación
Dr. Paul Sánchez Ocampo

A 25 De Enero De 2019, Universidad Del Papaloapan.

Índice
Introducción .................................................................................................................................... 3
Justificación ..................................................................................................................................... 4
Marco teórico .................................................................................................................................. 5
• Glicerol: ............................................................................................................................... 5
• 1,3-propanodiol .................................................................................................................. 5
• Síntesis química de 1,3-propanodiol .................................................................................. 5
• Fisiología de la formación de 1,3-propanodiol en Clostridium IBUN 158 B...................... 6
• Obtención de enzimas ........................................................................................................ 7
• Caracterización enzimática................................................................................................. 7
Objetivos ......................................................................................................................................... 7
• Objetivo general ................................................................................................................. 7
• Objetivos específicos .......................................................................................................... 7
Diagrama De Flujo ........................................................................................................................... 8
Metodología (Materiales y métodos) ............................................................................................. 9
1. Preparación de medios y cultivo. ....................................................................................... 9
2. Obtención del Extracto Proteico Crudo ........................................................................... 10
• Producción del extracto proteico crudo ........................................................................... 10
3. Purificación de la Enzima 1,3-propanodiol deshidrogenasa ........................................... 10
• Precipitación de proteínas ................................................................................................ 10
• Separación y purificación de la enzima ............................................................................. 11
4. Caracterización de la enzima 1,3-propanodiol deshidrogenasa ..................................... 11
• Efecto de la temperatura sobre la Actividad de la enzima ............................................... 11
• Determinación del pH óptimo ........................................................................................... 12
• Determinación de parámetros cinéticos Km y Vmax ........................................................ 12
Discusión ....................................................................................................................................... 13
Conclusiones ................................................................................................................................. 13
Referencias Bibliográficas ............................................................................................................. 14
SEPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUIMICA DE LA ENZIMA 1,3- PROPANODIOL
OXIDORREDUCTASA PROVENIENTE DE UNA CEPA NATIVA DE Clostridium spp
IBUN158.

Introducción

Los subproductos de la agroindustria han sido objeto de estudio para generar

alternativas de consumo energético evitando el uso del petróleo y sus derivados, los
cuales debido a su procesamiento y consumo desmedido han generado un alto nivel de
contaminación, sin contar con la disminución de sus reservas por ser un recurso no
renovable. Esto ha incrementado el interés en la búsqueda de nuevas tecnologías para
la síntesis de biocombustibles como biodiesel y bioetanol a partir de cultivos de
cereales, palma de cera, caña de azúcar entre otros. El biodiesel se obtiene de un
proceso de transesterificación de aceites vegetales y metanol que origina glicerol como
principal subproducto. El proceso de producción de biodiesel genera como residuo 10
toneladas de glicerol cruda por cada 100 toneladas de aceite que se utiliza en el proceso
de producción del combustible. Desde el año 2007 México, ha venido produciendo
biodiesel a partir de aceite de palma, la meta es lograr para el año 2020 cerca de 600
mil toneladas/año para consumo interno y exportación, lo que generaría 60 mil
toneladas de glicerol aproximadamente, el cual puede ser utilizado para otros fines y
generar rentabilidad a otras industrias nacionales. Este glicerol crudo sirve como una
fuente de carbono alterna, para la producción de solventes como el 1,3-propanodiol por
parte de algunas cepas microbianas. El proceso biotecnológico es una alternativa viable
y económica en comparación con los procesos de tipo químico. En la actualidad, Dupont
es la única compañía que comercializa el polímero proveniente de la síntesis de 1,3-
propanodiol producido por vía biotecnológica a partir de glucosa proveniente de jarabe
de maíz. La producción biotecnológica ha tomado gran relevancia, debido a que los
procesos químicos presentan altos costos de producción al usar materias primas
derivadas del petróleo cuyas reservas son limitadas, además de generar contaminantes
ambientales. El diol generado a partir del glicerol, es un compuesto orgánico
bifuncional, que puede potencialmente ser usado para algunas reacciones de síntesis
en particular para policondensaciones, producción de poliésteres, poli-éteres y
poliuretanos. Sin embargo, su mayor interés se centra en ser el monómero del poliéster
denominado PTT (Politrimetiltereftalato), que puede reemplazar a otros polímeros
empleados en la industria textil, de alfombras y electrónica. La producción del poliéster
ha generado rendimientos elevados a las industrias que manejan procesos
biotecnológicos a partir de subproductos de procesos industriales. Se proyecta que en
los próximos años la producción de 1,3-PD llegue a 1 millón de toneladas por año y su
precio sea competitivo frente a los valores de otros dioles, El grupo de bioprocesos y
bioprospección del Instituto de Biotecnología (IBT) de la UNAM, ha realizado desde hace
20 años un proceso de bioprospección obteniendo 178 aislamientos del género
Clostridium, trece de ellos con potencial para producción de solventes totales (acetona,
butanol, etanol y 1,3- propanodiol) en mayor concentración que las cepas de referencia
C. beijerinckii NCIMB 8052 y C. butirycum DSM 2478. Un análisis multivariado concluyó
que diez de las trece cepas promisorias pueden formar una nueva especie dentro del
género Clostridium y se consideran una nueva especie cercanamente relacionada con
Clostridium butyricum. En otros estudios, se obtuvo que la producción del solvente 1,3-
propanodiol, a partir de dos de las cepas nativas (IBUN 158B e IBUN 13A),
estrechamente relacionadas con Clostridium butyricum.

Justificación

México desde el año 2010 ha iniciado la producción de biodiesel a partir de aceite

de palma, se espera producir 600 mil toneladas de biodiesel para este año, lo cual
generara 60 mil toneladas de glicerol como subproducto. El cual puede ser
transformado en sustancias de mayor valor agregado que generen mayor rentabilidad
a la producción del biocombustible. La síntesis biotecnológica de 1,3-propanodiol
parece ser una alternativa muy atractiva frente a la síntesis química, razón por la cual se
ha hecho necesario el desarrollo de investigaciones encaminadas a dilucidar el
comportamiento de las enzimas en la fermentación, conocer el flujo metabólico y las
condiciones adecuadas en las cuales se pueda obtener una mayor actividad enzimática,
con el fin de convertir los resultados en herramientas útiles para el mejoramiento de
cepas mediante el uso de la ingeniería metabólica. El propósito de este trabajo fue
purificar y caracterizar la enzima 1,3- propanodiol deshidrogenasa perteneciente a la vía
reductiva de la ruta del glicerol, procedente de la cepa nativa de Clostridium sp IBUN
158B. Esta enzima es capaz de reducir 3-Hidroxipropionaldehido y transformarlo a 1,3-
propanodiol, con la producción simultanea de NAD+.
Marco teórico
• Glicerol:
El 1,2,3-propantriol, glicerol o glicerina es un alcohol con tres grupos hidroxilos,
se presenta en forma de líquido a una temperatura ambiental de 25 ° C y es higroscópico
e incoloro. Posee un coeficiente de viscosidad alto y tiene un sabor dulce como otros
polialcoholes.

• 1,3-propanodiol
Es un alcohol lineal de tres carbonos y dos grupos hidroxilo, es un líquido viscoso
incoloro que es miscible con agua.

• Síntesis química de 1,3-propanodiol

La síntesis química de 1,3-PD se da por los métodos de óxido de etileno con
monóxido de carbono e hidrógeno y la hidrólisis de acroleína. Una variante de la síntesis
requiere de alta presión para la obtención del compuesto y tiene rendimientos de
aproximadamente el 80%.

Otro mecanismo, conocido con el nombre de proceso Degussa, está patentando

por DuPont y se basa en la hidrólisis de la acroleína, otorgando rendimientos de no más
del 65%, debido a la simultánea formación de 1,2-propanodiol. Ambos producen
intermediarios tóxicos, requieren de un paso de reducción bajo altas presiones de
hidrógeno y manejan altas temperaturas, por lo cual tienen altos costos de producción.
 • Fisiología de la formación de 1,3-propanodiol en Clostridium IBUN 158 B

En las especies de Clostridios, la producción de acetato y butirato está asociada

con la formación de hidrógeno molecular, cuando estos microorganismos crecen sobre
un substrato más reducido como glucosa, manitol o glicerol, el poder de reducción no
es usado para formar hidrógeno molecular pero si para formar más compuestos
altamente reducidos como 1,3-PD

Ruta metabólica 1,3-PD

Resumen de reacción
 • Obtención de enzimas

Cuando una fuente de enzimas ha sido encontrada, es preciso tener la enzima en

solución por lo que se hace necesario la ruptura de la membrana celular. Generalmente
se habla de extractos de enzimas, algunos métodos que han sido usados son:
rompimiento mecánico por pulverización con arena, movimientos a altas velocidades
con perlas de vidrio fino, ultrasonido, congelamiento y descongelamiento, uso de
solventes como acetona, autolisis, o lisis con adición de enzimas.

• Caracterización enzimática

El estudio de la cinética enzimática es importante por razones prácticas, así como

el conocimiento de las condiciones para la acción de la enzima y el efecto de varios
factores sobre la misma. Los factores que determinan la velocidad inicial de una
reacción particular son la concentración de la enzima, concentración del sustrato, pH,
temperatura y la presencia de activadores o inhibidores.

Objetivos
• Objetivo general

Obtener, separar y caracterizar la enzima 1,3-propanodiol deshidrogenasa proveniente

de la cepa nativa Clostridium IBUN 158 B.

• Objetivos específicos

o Obtener subproducto (glicerol) de elaboración de biocombustible.

o Cultivar Clostridium IBUN 158 B.
o Obtención de la enzima 1,3-propanodiol deshidrogenasa.
o caracterización la enzima 1,3-propanodiol deshidrogenasa.
o Obtención de 1,3-propanodiol mediante la reacción enzimática de 1,3-PD
propanodiol deshidrogenasa en biorreactor airlift.
o Cálculo del rendimiento de la reacción.
Diagrama De Flujo

Preparación de medios y Obtención del Extracto

cultivo. Proteico Crudo

Purificación de la Enzima
Producción del extracto
1,3-propanodiol
proteico crudo.
deshidrogenasa.

Precipitación de Separación y purificación

proteínas. de la enzima.

Efecto de la temperatura Caracterización de la

sobre la Actividad de la enzima 1,3-propanodiol
enzima. deshidrogenasa.

Determinación de
Determinación del pH
parámetros cinéticos Km
óptimo.
y Vmax.
Metodología (Materiales y métodos)

1. Preparación de medios y cultivo.

Se empleó la cepa nativa Clostridium IBUN 158B seleccionada del cepario de la
Facultad de Química de la UNAM. Para la obtención de los inóculos de trabajo se siguió
el protocolo establecido por Cárdenas y Pulido, 2004, empleando el medio de cultivo
comercial RCM, cuya composición se describe en la (Tabla 1) y el medio TGY (Tabla 2),
al cual se le modificó su fuente original de carbono por glicerol para inducir la
producción de enzimas, los medios de cultivo fueron manejados en cámara de
anaerobiosis. Las cepas puras y viables fueron incubadas a 37°C por 96 horas bajo
agitación orbital a 200 r.p.m. para ser posteriormente utilizadas como inóculo de trabajo
de trabajo.

Tabla 1: composición del caldo RCM

Tabla 2: composición del caldo TGY, modificado con glicerol como fuente de carbono

Tinción de Gram de Clostridium IBUN 158B

 2. Obtención del Extracto Proteico Crudo

• Producción del extracto proteico crudo

Para la producción del extracto proteico, en el cual se establecen
6 ciclos de 3 min a una frecuencia de 20 Hz. La lisis celular se realizó
mediante la técnica de sonicación con un equipo BRANSON 2800 de 5.6
L. La recuperación se realizó centrifugando la muestra luego de la
sonicación a 14000 rpm por 15 min y retirando el sobrenadante, puesto
que allí se encuentran las proteínas intracelulares y la proteína de
interés es una proteína intracelular.

3. Purificación de la Enzima 1,3-propanodiol deshidrogenasa

• Precipitación de proteínas
Inicialmente se buscó concentrar y separar proteínas empleando la técnica de
precipitación con sulfato de amonio, antes de pasar el extracto proteico crudo por la
columna de intercambio aniónico. La concentración y separación de la enzima se realizó
por duplicado, Se adiciono la sal de sulfato de amonio al extracto crudo, la solución se
agitó lentamente por 5-15 minutos a 4°C, hasta observar la precipitación de las
proteínas, para luego centrifugar a 10000 rpm por 10 minutos. Se recogió el precipitado
y se resuspendió en 1 ml de buffer fosfato de potasio 0.1 M pH 8.

Purificación de la enzima 1,3–propanodiol deshidrogenasa por el método de precipitación con

Sulfato de Amonio. Se utilizaron porcentajes que iban desde el 55% al 85% de saturación con sal.
 • Separación y purificación de la enzima
La purificación se realizó empleando un sistema de cromatografía líquida rápida
en proteínas. permitiendo la separación de mezclas proteicas por intercambio Aniónico
y se empleó un buffer 20mM de Tris pH 8.0 como fase móvil. La deshidrogenasa fue
eluída con un gradiente lineal de 0-1 M de NaCl, preparado en Buffer Tris-Cl pH 8.0 20
mM suplementado con 2 M NaCl, a una tasa de flujo de 1.5 ml/min.

4. Caracterización de la enzima 1,3-propanodiol deshidrogenasa

• Efecto de la temperatura sobre la Actividad de la enzima

Se evaluó la actividad enzimática del extracto proteico crudo por duplicado, midiendo
la producción de NAD+H obtenida mediante lecturas en el espectrofotómetro Bio Rad ®
a una longitud de onda de 340 nm. Se obtuvo un rango de temperatura con actividad
optima de 27-31°C.

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática en un rango de temperatura de 25 a 31°C

 • Determinación del pH óptimo

Los ensayos para determinar el pH óptimo fueron desarrollados con un buffer

bicarbonato de potasio, ajustado con una concentración de KOH 3 M o HCl 3 M. Los
rangos fueron medidos por duplicado en placas de 96 pozos a una absorbancia de 340
nm para determinar la producción de NAD+H, a través de un lector de ELISA, obteniendo
un ph 10 como optimo para la actividad.

Efecto del pH sobre la actividad de la enzima 1,3-propanodiol deshidrogenasa. Se evaluaron

rangos de pH establecidos entre 8 y 10.5

• Determinación de parámetros cinéticos Km y Vmax

Los parámetros cinéticos fueron obtenidos a partir de mediciones hechas por triplicado
con diferentes concentraciones de sustrato y coenzima (1,3-PD, NAD+), el sustrato
1,3PD se evaluó a concentraciones (2, 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 180, 200) y
NAD+ a concentraciones de (0, 0.1, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2, 1.5, 2, 2.5, 3) a una temperatura
de 30°C con un buffer bicarbonato de potasio 100 mM (pH 10), Sulfato de amonio 30
mM. Los parámetros cinéticos, se calcularon por una regresión no lineal de la ecuación
de Michaelis Menten, empleando la gráfica de lineaweaver-Burk (Se grafica (1/V) Vs
(1/[S]), de ahí que se pueda identificar Km y Vmax.
Efecto de la concentración de 1,3-propanodiol en mM sobre la actividad de la enzima
1,3propanodiol deshidrogenasa

Discusión
El proceso de obtención de la enzima 1,3-propanodiol deshidrogenasa de la cepa de
Clostridium resulta ser viable como se presenta en este trabajo, ya que se puede
obtener un buen rendimiento y pureza de la enzima al final de la purificación. Esto
permitirá una mayor eficiencia en la reacción enzimática cuando se sintetice 1,3-
propanodiol de los subproductos de la producción de biodiesel, por lo tanto, un
aprovechamiento máximo de las materias primas y de forma más amigable con el
ambiente.

Conclusiones
Se pudo establecer que la enzima 1,3-propanodiol deshidrogenasa proveniente de la
cepa nativa de Clostridium IBUN 158B presenta un comportamiento alostérico, Por lo
cual este proceso biotecnológico es una alternativa viable y económica en comparación
con los procesos de tipo químico.

La actividad enzimática se ve altamente influenciada durante la fermentación por

factores como el pH y la producción de ácidos, los cuales están relacionados con el flujo
de agentes reductores como NAD+H.

Las condiciones óptimas para obtener una mayor actividad enzimática se lograron a una
temperatura de 30°C, pH 10.0, concentración de MnCl2 1 mM, 1,3-PD 100mM y NAD+
2 mM.
Referencias Bibliográficas

• Abbad-Andaloussi S., Manginot-Durr C., Amine J.,Petitdemange E., Petitdemange H. (1995).

Isolation and Characterization of Clostridium butyricum DSM 5431 Mutants with Increased
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• Abbad-Andaloussi S., Guedon E., Spiesser E. and Petitdemange H. (1996). Glycerol dehydratase
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• AMAYA S., PARDO J. (2009) Evaluación de la actividad deshidratasa y deshidrogenasa de un

extracto crudo enzimático a partir de cepas de Clostridium spp. en medio con glicerol (Tesis de
Pregrado en Microbiología). Pontificia Universidad Javeriana - Universidad Nacional de Colombia
Sede Bogotá D.C., Instituto de Biotecnología.

• Aragón O. (2007). Estudio de la viabilidad técnica de la producción de 1,3 – propanodiol (1,3-PD)

a partir de glicerol con nuevas cepas colombianas de Clostridium sp. a nivel laboratorio (Tesis de
Postgrado en Microbiología). Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá D.C., Instituto de
Biotecnología.