REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA EXPERIMENTAL LIBERTADOR

INSTITUTO PEDAGÓGICO DE CARACAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA Y QUÍMICA
PROYECTO EN QUÍMICA APLICADA I

EVALUACIÓN DEL EFECTO DE FLAVONOIDES EXTRAÍDOS DE TÉ

VERDE (Camelia sinensis) SOBRE EL HONGO Fusarium

Autora: Liliana, M. Rodríguez, S.

Tutores: Prof. Luis Vásquez
Prof. Carlos Rondón

Caracas, Febrero de 2015

 ACEPTACIÓN DEL TUTOR

Por la presente hago constar que he leído el proyecto en química aplicada

presentado por la ciudadana Liliana Rodríguez, es; EVALUACIÓN DEL
EFECTO DE FLAVONOIDES EXTRAÍDOS DE TÉ VERDE (Camelia
sinensis) SOBRE EL HONGO Fusarium. y que acepto asesorar a los
estudiantes, en calidad de tutor, durante la etapa de desarrollo del trabajo
hasta su presentación y evaluación.
En la ciudad de Caracas a los __ del mes de _____ de 2014.

_________________________
Luis Vásquez
C.I:
 ACEPTACIÓN DEL TUTOR

Por la presente hago constar que he leído el proyecto en química aplicada

presentado por la ciudadana Liliana Rodríguez, es; EVALUACIÓN DEL
EFECTO DE FLAVONOIDES EXTRAÍDOS DE TÉ VERDE (Camelia
sinensis) SOBRE EL HONGO Fusarium. y que acepto asesorar a los
estudiantes, en calidad de tutor, durante la etapa de desarrollo del trabajo
hasta su presentación y evaluación.
En la ciudad de Caracas a los __ del mes de _____ de 2014.

_________________________
Carlos Rondón
C.I:
 REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA
UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA EXPERIMENTAL LIBERTADOR
INSTITUTO PEDAGÓGICO DE CARACAS

EVALUACIÓN DEL EFECTO DE FLAVONOIDES EXTRAÍDOS DE TÉ

VERDE (Camelia sinensis) SOBRE EL HONGO Fusarium.

Autora: Liliana, M. Rodríguez,

Tutores: Luis Vásquez
Caros Rondón
Fecha: Febrero 2015

RESUMEN

Es necesario disminuir los efectos de agentes fitopatógenos, en las plantas

de máximo consumo humano y uno de estos fitopatógenos es el Fusarium, el
cual ha presentado inhibición de crecimiento del micelio vegetativo frente a
extractos de plantas. La presente investigación evaluó el comportamiento del
Fusarium cultivado in vitro en presencia de concentraciones de flavonoides
extraídos de té verde (Camellia sinensis). Se aislaron 0,243g de flavonoides
de la marca de mayor demanda comercial de té verde en un sector de la
parroquia La Candelaria, con un 0,0605% de rendimiento, mediante
extracción en frío. En el ensayo biológico en cultivo PDAA, se agregaron
100μL de flavonoides a 0, 10, 100 y 1000 ppm, respectivamente. Se
determinó que los flavonoides mantuvieron un efecto inhibidor del
crecimiento del micelio durante las primeras 96 horas disminuyendo
progresivamente hasta alcanzar un máximo de 14,77% a los 216 días a 1000
ppm.

Descriptores: Fitopatógeno, Fusarium, extracción en frío, inhibición

crecimiento micelial, té verde, Camellia sinensis, polifenoles,
flavonoides, catequinas.
 INDICE GENERAL
pp.
LISTA DE CUADROS………………………………………………………..…....i
LISTA DE GRÁFICOS………………………………………………………..…...ii
RESUMEN……………………………………………………………………..…..iii

CAPÍTULO I, EL PROBLEMA
Planteamiento del problema…………………………………………………11
Objetivos……………………………………………………………………….14
Variables…………………………………………….………………...……….15
Importancia……………………….…………………….……………...………15

CAPITULO II.
Antecedentes……………………………………………….……..…………..17
Enfermedades de las plantas…………………………….………………….18
Daños causados por hongos fitopatógenos…………….….……….….….19
Fusarium……………………………………..………………….……………..22
Desarrollo de la enfermedad………………………………….……………..23
Efecto antimicrobiano de extractos vegetales……………….…………….23
Flavonoides…………………………………………………………….……...24
Biosíntesis de Flavonoides…………………………………….………...…..26
Flavanoles……………………………………………………………….……..27
Té verde………………………………………………………………………..29
Extracción sólido - líquido……………………………….…………………...30
Extracción continúa vía Soxhlet……………………………………….……31

CAPITULO III. MARCO METODOLOGICO

Diseño de la investigación…………………………………………………..33
Tipo de diseño………………………………………………………………...33
Población y muestra………………………………………………………….34
Instrumentos de recolección de datos……………………………………...34
Materiales y reactivos………………………………………………………...35
Obtención del extracto de acetato de etilo vía Soxhlet…………………...35
Obtención de flavonoides a partir de extracción en frío…………………..36
Reconocimiento de flavonoides con hierro(III)…….……………………....38
Evaluación del comportamiento del Fusarium ante los flavonoides……39
Análisis microbiológico del hongo cultivado……………………………….42

CAPITULO IV.
Resultados obtenidos……………………………………...…………………43
Análisis de resultados………………………………………………………...44
CAPITULO V. CONCLUSIONES, RECOMENDACIONES Y LIMTACIONES
Conclusiones…………………………………...……………….……………..62
Limitaciones y recomendaciones……………………………………………63

REFERENCIAS……………………………………………………………………64
 LISTA DE CUADROS

CUADRO pp
1 Materiales, instrumentos y equipos utilizados en el proyecto
de investigación”……………………………….……………………….…… 35
2 Resultados en la extracción vía Soxhlet de té verde con acetato
de etilo………………………………………....……………….…………….… 45
3 Resultados de la identificación de flavonoides en el extracto de
acetato de etilo…………………………………..………………………...... 47
4 Porcentaje de rendimiento de flavonoides aislados del material
vegetal...……………………………………………………………………….. 48
5 Crecimiento promedio del radio del micelio vegetativo del cultivo
control de Fusarium…………………………………………………………. 49
6 Crecimiento promedio del micelio vegetativo de los cultivos de
Fusarium en PDAA con concentraciones de flavonoides
extraídos del té verde de mayor marca comercial en un sector
de la Parroquia La Candelaria…………………………………………….. 49
 LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO pp
1 Evidencias de infecciones por hongos en las plantas...……………..20
2 Morfología de las colonias del hongo Fusarium…………………........21
3 Vista microscópica de las hifas, y las estructuras
reproductivas (conidióforos y conidios) del Fusarium………..………22
4 Marchitamiento de la planta de tomate a causa del hongo
Fusarium…………………………………………………………………...23
5 Núcleo de flavano…………………………….………………………......24
6 Estructura de los flavonoides……………………………………………26
7 Resumen de la biosíntesis de los flavonoides………………………….27
8 Catequinas del té verde (Camellia sinensis)……………………………28
9 Recolección del té verde………………………………………………….30
10 Extractor Soxhlet………………………………………………………….32
11 Resultados obtenidos en la determinación de la marca comercial
de té verde más vendida en 10 establecimientos comerciales
en un sector de la parroquia Candelaria………………………………43
12 Resultados obtenidos en la determinación de la marca
comercial de té verde más consumida por una muestra
de 12 personas en un sector de la parroquia Candelaria…………...44
13 Razones por las cuales los consumidores prefieren esa marca
de té verde…………………………………………………………………44
14 Efectos por los cuales los consumidores prefieren el té verde………45
15 Extracción Soxhlet del material vegetal con éter de petróleo…..……45
16 Extracción Soxhlet del material vegetal con acetato de etilo……......46
17 Resultados de la CCP de los diferentes extractos obtenidos
Vía Soxhlet………………………..…………………………………………46
GRÁFICO pp
18 Resultados obtenidos en la identificación con Hierro (III)
de los diferentes extractos de té verde obtenidos vía Soxhlet………47
19 Proceso de extracción en frío de 40,12g de té verde………………...48
20 Flavonoides aislados de 40,12g de material vegetal…………………48
21 Resultados de la identificación de flavonoides con hierro (III)
en el extracto de acetato de etilo obtenido por maceración…………48
22 Crecimiento micelial del testigo de Fusarium…………………………50
23 Crecimiento micelial del testigo de Fusarium durante 240…………..50
24 Crecimiento micelial del Fusarium en 10 ppm de flavonoides a
las 120 horas………………………………………………………………50
25 Crecimiento micelial del Fusarium en 100 ppm de
flavonoides a las120 horas………………………………………………50
26 Crecimiento micelial del Fusarium en 0ppm (disolvente y el control
(sin flavonoides) a las 120 horas………………………………………..51
27 Crecimiento del radio del micelio de Fusarium a 0 ppm a
las 216 horas 22 Crecimiento micelial del
testigo de Fusarium………………………………………………………52
28 Crecimiento micelial del testigo de Fusarium durante 240…………..50
29 Crecimiento del radio del micelio de Fusarium a 100 ppm
a las 216 horas……………………………………………………………52
30 Crecimiento del radio del micelio de Fusarium a 1000 ppm
las 216 horas………………………………………………………………52
31 Crecimiento del radio del micelio de Fusarium a diferentes
concentraciones de flavonoides a las 216 horas……………………...53
32 Porcentaje de crecimiento del radio del micelio de Fusarium a
diferentes concentraciones de flavonoides……………………………53
GRÁFICO pp
33 Vista microscópica de las hifas y las estructuras reproductivas
(conidióforos y conidios) del hongo Fusarium cultivado como testigo………54
34 Estructura de los polifenoles……………………………………………55
35 Estructura de las clorofilas a y b ……………………………………….56
36 Posible reacción de formación del complejo entre el catión
férrico y los polifenoles del té verde (coloración verde)……………...57
37 Imagen del grupo galoilo presente en las catequinas del
té verde…………………………………………………………………….57
 CAPÍTULO I

EL PROBLEMA

Planteamiento del problema

Muchos cultivos de frutas y hortalizas de interés para el ser humano son

afectados, tanto por malezas que compiten a su alrededor por luz y
nutrientes, como por .enfermedades producidas por diversos agentes
fitopatógenos los cuales causan elevadas pérdidas a nivel de cultivos. Entre
los fitopatógenos más importantes, se encuentran las bacterias y los hongos,
siendo éstos últimos los responsables del deterioro patológico de frutas,
hojas, tallos y productos subterráneos como raíces y tubérculos.
Los síntomas que se pueden observar por este tipo de infecciones son
manchas, tizones, podredumbres húmedas o secas, abolladuras, costras,
marchitamientos y un fenómeno conocido como Damping off que es la
incapacidad de las semillas de germinar en el terreno o la muerte de
plántulas una vez germinadas (Becerra, Morales y López, 2010).
Una clase de hongo que puede causar uno o varios de los síntomas
anteriormente descritos es el Fusarium, el cual pertenece a la clase
Basidiomycete, y se caracteriza por formar masas de hifas estrechamente
entretejidas con superficies duras y resistentes. Este hongo está presente en
casi todos los suelos ya que tiene una amplia gama de hospedantes y
sobrevive en los residuos de plantas de manera saprofita. Se desarrolla a
temperaturas muy diversas, en zonas cálidas, templadas y frías, ocasionando
daños considerables en el tallo, la hoja, la raíz o el fruto de la planta, y puede
atacar alrededor de 250 especies de éstas, tanto en campo como en el sitio
de almacenamiento (Cotes, 2012).
Es por ello, que para combatir los daños del Fusarium en los cultivos y
plantaciones, los agricultores han utilizado el control químico ya que
consideran que este método es más efectivo y rápido para detener los
efectos de esta patología, sin embargo, su uso es poco eficiente debido a
los costos de producción; además se ha comprobado que los plaguicidas
químicos y en particular los fungicidas, pueden presentar efectos negativos
en la biodiversidad de los agroecosistemas y en la salud pública (Flores,
Carballo, García, Ramos, Ochoa y Pentón, 2009).
Por esta razón los científicos trabajan en el desarrollo de alternativas de
control ecológicas, entre las que se encuentran el control biológico de los
fitopatógenos y el uso de productos derivados de las plantas, como aceites
esenciales o extractos vegetales, los cuales han despertado gran interés por
parte de los investigadores; presentando resultados satisfactorios, tanto en
laboratorio como en el campo.
En este sentido, los extractos vegetales resultan una alternativa
importante, debido a que se ha demostrado que algunas sustancias
presentes en dichos extractos ejercen un efecto fungicida considerablemente
efectivo sobre algunos hongos fitopatógenos. En relación con lo anterior en
el 2009, Bolívar, Sanabria, Rodríguez, Camacaro, Ulacio, Cumana y
Crescente, lograron reducir en un 37% y un 33% la enfermedad causada por
el hongo fitopatógeno Colletotrichum gloesporioides en frutos de mango, a
partir de extractos etanólicos de seis diferentes plantas.
Por otra parte, en 2009, Rojas C., en su estudio del efecto inhibitorio de
extractos de té verde (Camelia sinensis) sobre cinco cepas de hongos
diferentes, determinó que la mayor sensibilidad a la inhibición fue presentada
por la muestra comercial de té que contenía la mayor concentración de
flavonoides las cuales conforman gran porcentaje del extracto de esta
planta.
Cabe destacar, que para Gómez, (2008), los flavonoides representan un
grupo de compuestos fenólicos que se caracterizan por ser de coloración
amarilla y contribuyen al color de las flores y frutos de las plantas superiores,
y se localizan en la membrana tilacoide de las células vegetales; y el té
verde es una fuente principal de éstas sustancias. Ésta planta es cultivada en
muchos países y regiones del mundo, y su empleo como infusión se originó
en China y hasta mediados del siglo XIX, dicho país monopolizaba el
comercio mundial de este producto (Figueroa, Rodríguez y Sánchez, 2004).
Según Marcano y Hasegawa, (2002), el té se manufactura a partir de
viertas variedades de la planta, principalmente Camellia sinensis y Camellia
sinensis assamica, y debido diversos procesos durante su producción, puede
presentar modalidades distintas como el té verde, el té blanco o el té negro.
De los tres tipos de té anteriormente nombrados, el té verde recibe un
tratamiento de inactivación de las enzimas en las hojas frescas a través
calentamiento o escaldado, lo cual previene la oxidación enzimática de los
flavonoides presentes en dicha planta; siendo en este caso, el subgrupo
representado por los flavan–3-oles o catequinas, entre las que se encuentran
epigalocatequina-3-O-galato, epicatequina-3-O-galato, epicatequina y la
epigalocatequina; las cuales son las responsables del mayor efecto
antifúngico de esta planta (Figueroa, 2004).
Sobre la base de lo anterior expuesto, en el presente trabajo se evaluó el
comportamiento de cepas de Fusarium cultivadas in vitro, ante diferentes
concentraciones de flavonoides extraídos de una marca comercial de té
verde de mayor demanda comercial de un sector de la parroquia La
Candelaria.
 Pregunta de investigación

¿Cuál es el comportamiento del hongo Fusarium cultivado in vitro ante

diferentes concentraciones de flavonoides extraídos de una marca de té
verde de mayor demanda comercial en la parroquia La Candelaria?

Objetivos de la investigación

Determinar la marca comercial de té verde (C. sinensis) de mayor

demanda comercial en un sector de la parroquia La Candelaria del municipio
Libertador, a través de un estudio de campo.
Obtener el extracto polar té verde (C. sinensis) a través de extracción
continua vía Soxhlet con acetato de etilo.
Obtener el extracto polar té verde (C. sinensis) a través de extracción en
frío.
Identificar la presencia de compuestos polares (flavonoides) en los
diferentes extractos de té verde (C. sinensis) a través de cromatografía en
capa fina (CCF)
Identificar la presencia de polifenoles (flavonoides) en el extracto de
acetato de etilo a partir de té verde (C. sinensis) a través del ensayo con
cloruro de hierro (III) en placas de sílica gel.
Evaluar el comportamiento in vitro del Fusarium ante diferentes
concentraciones de extracto de té verde de mayor demanda comercial en la
parroquia La Candelaria.
 Variables de la investigación

Independiente: Compuestos químicos presentes en el extracto de acetato

de etilo.
Dependiente: Variedad del té verde (C. sinensis)
Crecimiento y desarrollo del Fusarium
Controlada: Ensayo biológico.
Método de extracción
Marca comercial de té verde (C. sinensis)
Interviniente: Pureza de los reactivos,
Cepa del hongo
Impurezas en el medio del cultivo
Impurezas en las disoluciones de flavonoides
Medio de cultivo

Importancia de la Investigación

Encontrar estrategias, técnicas y métodos que incrementen la

productividad agrícola y mantengan el equilibrio ecológico sin impactos
negativos para el ambiente, ni riesgos para la salud humana, constituye un
reto para la agricultura y su desarrollo.
Es por ello que el presente proyecto de investigación puede constituir una
alternativa de importancia para el tratamiento de infecciones en plantas
causadas por hongos, al alcanzar una demostración importante del efecto de
los flavonoides del té verde sobre el Fusarium, es decir, evidenciar la
disminución del desarrollo del micelio o un desarrollo atípico de las
estructuras reproductivas, al tratar este hongo con diferentes
concentraciones de flavonoides extraídos de Camellia sinensis en un ensayo
in vitro.
Esto también permitiría presentar una alternativa para control de hongos
en cultivos y plantaciones a nivel nacional, en los que se podría aplicar el
extracto directamente a las plantas o en los suelos del cultivo. Por otra parte,
las frutas y tubérculos son frecuentemente atacados por hongos, afectando
la calidad del producto en almacenes y centros de distribución, en los cuales
también podría aplicarse el extracto de té verde sobre los productos en
exhibición y venta, ya que en muchos casos, el aspecto exterior
especialmente en tomates, es afectado en gran manera por Fusarium
haciéndolos menos atractivos para los consumidores.
 CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

Antecedentes

En 2009, Bolívar, Sanabria, Rodríguez, Camacaro, Ulacio y Cumaná,

determinaron el efecto fungicida de extractos etanólicos de las plantas
Azadirachta indica, Phyllanthus niruri, Calotropis procera, Lippia origanoides,
Gliricidia sepium y Heliotropium indicum, colectadas en el estado Lara,
Venezuela, sobre la antracnosis ocasionada por el hongo Colletotrichum
gloesporioides en frutos de mango (Mangifera indica). El extracto se obtuvo
por presión reducida y se determinaron los grupos de flavonoides presentes
en ellos, por otro lado hicieron crecer el fitopatógeno en el medio nutritivo
PDA (papa, dextrosa, agar), agregándole tres métodos de aplicación in vitro
de extracto al 2,5%.
Los investigadores concluyeron que los mejores resultados los
obtuvieron postcosecha, ya que lograron reducir el crecimiento micelial del
hongo a partir de los extractos de las plantas anteriormente nombradas, en
un 37 y 33 % en los frutos de mango, respectivamente.
En 2013, Gallardo, C; estudió el efecto inhibitorio de tres variedades de té
(Camellia sinensis). Las variedades de estudio fueron sencha, gunpowder y
darjeeling la cual es una variedad de té negro que contiene hojas de té
verde. La investigadora evaluó el efecto del extracto acuoso de la muestras
de té, sobre los hongos Rhodotorula mucilaginosa, Mucor spp, Cladosporium
cladosporioides, Penicillium citrinum y Penicillium rugulosum presente en una
sala de maduración de quesos. Cada cepa se sembró aislada en una placa
conteniendo agar Muller-Hinton al cual se le hicieron perforaciones y se
agregaron 100 μL de cada infusión, incubándolas a 25°C durante cinco días.
La autora concluyó que la infusión darjeeling es la que presenta mayor
efecto inhibitorio sobre 3 de los fitopatógenos (no presentó efecto sobre
Penicillium citrinum y Penicillium rugulosum), y además determinó por medio
HPLC, que esta variedad es la que presenta la mayor cantidad de
flavonoides de las tres.

Bases Teóricas

1. Enfermedades de las plantas

Las enfermedades de las plantas son uno de los principales problemas
que se tiene que afrontar en la agricultura porque reducen las cosechas,
desmejoran la calidad del producto, limitan al mismo tiempo la disponibilidad
de los alimentos y materias primas para algunas industrias. En los países
desarrollados, donde el alimento es abundante, las enfermedades de las
plantas provocan pérdidas económicas a la agricultura, propician el aumento
de precio en los productos y destruyen la belleza del ambiente al dañar las
plantas ornamentales de las casas, parques avenidas y bosques (Cadenas,
2010)
De acuerdo con Achicanoy, (2001), para que las plantas desarrollen las
enfermedades que causan lo anteriormente expuesto se tienen que cumplir
los siguientes factores:
1. La cepa virulenta de un agente patógeno (hongos, bacterias o virus) debe
presentar una baja frecuencia en el huésped (cultivo).
2. El huésped (cultivo) que es susceptible a esta cepa se debe distribuir
ampliamente en una región.
3. Las condiciones ambientales deben ser favorables para el desarrollo de
los agentes patógenos.
La interacción de los factores antes nombrados produce la enfermedad de
una planta. De hecho, la enfermedad no se generará a no ser que exista un
agente patógeno activo, un huésped apropiado y condiciones ambientales
adecuadas para la infección, colonización y reproducción de un agente
patógeno.
Entre los factores ambientales que propician el desarrollo de una
enfermedad se encuentran temperatura, luz, humedad relativa, y otros; pero
también el riego, el cual cambia el microclima y la fertilización química, que
promueve el crecimiento frondoso de la vegetación y el aumento de la
suculencia de las plantas huéspedes.
Estos factores también pueden afectar la capacidad competitiva de un
agente patógeno cuando éste se encuentra en el suelo. El creciente
conocimiento del triángulo de la enfermedad huésped/agente
patógeno/medio ambiente ha permitido a los patólogos emplear ciertos
principios ecológicos para reducir las pérdidas de una enfermedad
epidémica. (Cadenas, 2012).

2. Daños causados por hongos fitopatógenos

Las enfermedades que producen los hongos en las plantas pueden ser
del tipo local, cuando afectan una porción pequeña del tejido, o general, si
causan un daño completo a toda la planta, lo cual depende del tipo de planta
que parasiten. Sin embargo, en una misma planta pueden producir un efecto
local y luego uno generalizado. El daño producido por los hongos es,
principalmente, una muerte del tejido (necrosis) que infectan. También
pueden producir atrofia de la planta completa o de algunas de sus partes y,
en otros casos, pueden causar un crecimiento excesivo (hipertrofia). Además
los hongos que afectan la raíz, o bien al sistema vascular de la planta,
tienden a producir color amarillo en la planta y marchitez (Becerra y otros,
2010)
Según Urbina, (2011), estas enfermedades producen en sus hospederos
una amplia variedad de tipos diferentes de síntomas como manchas
cloróticas y necróticas, cribados, cancros, tizónes, podredumbres húmedas o
secas, momias, agallas, abolladuras, costras, ahogamientos,
marchitamientos y pústulas.

Grafico No. 1.- Evidencias de infecciones por hongos en las plantas

(Tomado de Urbina, 2011)
 3. Fusarium
División: Ascomycota
Clase: Euascomycetes
Orden: Hypocreales
Familia: Hypocreaceae
Género: Fusarium
Especies: F. oxysporum, F. solani, F. verticilloides, F. dimerum,
F. chlamydosporum.
Fusarium es un género de hongos anamórfico que agrupa a un gran
número de especies, siendo la mayoría saprobias o parásitas de plantas,
aunque también existen especies capaces de infectar humanos y animales,
habiendo aumentado significativamente el número de fusariosis en pacientes
inmunocomprometidos (Arias, González y Peteira, 2012)
Se caracteriza por producir colonias de rápido crecimiento, con una tasa
diaria cercana a un centímetro en medio papa- dextrosa agar (PDA) a 25ºC.
La morfología de las colonias es muy variable y puede presentar dos tipos:
una de tipo micelial caracterizada por la producción de abundante
micelioaéreo, algodonoso, con una coloración variable, de blanco a rosado
durazno, perousualmente con un tinte púrpura o violeta más intenso en la
superficie del agar y pocas microconidias y una de tipo pionotal con la
formación de poco o ningún micelio aéreo y abundantes microconidias
(Bautista, Garcés, Orozco y Valencia, 2001)

Micelio vegetativo

Gráfico 2. Morfología de las colonias del hongo Fusarium

(Tomado de Castellanos y otros, 2002)
 De acuerdo con Bautista y otros (2001), este hongo produce tres clases
de esporas:
Microconidias: Esporas generalmente unicelulares, sin septas, hialinas,
elipsoidales a cilíndricas, rectas o curvadas; se forman sobre fiálides
laterales, cortas, simples o sobre conidióforos poco ramificados. Las
microconidias tienen 5 a 12 μm de largo por 2,5 a 3,5 μm de ancho.
Macroconidias: Esporas de paredes delgadas, fusiformes, largas,
moderadamente curvadas en forma de hoz, con varias células y de 3 a 5
septas transversales, con la célula basal elongada y la célula apical
atenuada; las macroconidias tiene un tamaño de 27 a 46 μm de largo por 3,0
a 4,5 μm de ancho.
Clamidosporas: Esporas formadas a partir de la condensación del
contenido de las hifas y de las conidias, de paredes gruesas. Se forman
simples o en pares, terminales o intercalares: poseen un tamaño de 5 a 15
μm de diámetro. Gracias a ellas el hongo sobrevive en condiciones
ambientales desfavorables y en el suelo como saprófito de vida libre en
ausencia de plantas hospedantes. Hasta el momento no se conoce la fase
perfecta de este hongo.

Hifas
Conidióforos Conidios

Gráfico 3. Vista microscópica de las hifas, y las estructuras reproductivas

(conidióforos y conidios) del Fusarium
(Tomado de Catsellanos y otros, 2002)
 3.1. Desarrollo de la enfermedad
Los primeros síntomas de la enfermedad son el amarillamiento del follaje,
comenzando con la caída de las hojas. Las hojas infectadas posteriormente
muestran un encrespamiento bajo, seguidamente se oscurecen y se secan.
La parte superior de la planta se marchita durante el día y se recupera
en la noche, pero el marchitamiento empeora hasta que la planta se marchita
completamente observándose el oscurecimiento vascular en los tallos y los
pecíolos infectados de las hojas grandes. Las plantas afectadas y sus
sistemas de raíces se atrofian (Arias, González y Peteira, 2012)

Grafico 4. Marchitamiento de la planta de tomate a causa del hongo

Fusarium
(Tomado de Castellasnos 2002)

4. Efecto antimicrobiano de extractos vegetales

Globalmente las plantas producen más de 100 000 productos naturales
de bajo peso molecular, conocidos como metabolitos secundarios. Éstos se
diferencian de los primarios en que no son esenciales para la vida de la
planta. Esta diversidad de sustancias resulta de un proceso conducido para
adquirir una defensa mejorada frente a los ataques de microorganismos,
insectos y otros agentes (Domingo y López, 2003).
Los metabolitos secundarios se les atribuyen efectos insecticida,
acaricida, nematicida, molusquicida, rodenticida, fungicida, bactericida y
herbicida, y pueden obtenerse a partir de extractos vegetales que se
preparan con diferentes disolventes como agua, alcohol, éter etílico, aceite,
acetona y benceno La disolución acuosa extrae solo una parte de los
metabolitos, pero la técnica es la más sencilla y económica para los
agricultores y reduce el riesgo de contaminación y accidentes (Moreno,
Barrios, Hernández, Morales y Ramírez, 2001)

5. Flavonoides.
Los flavonoides sin ser metabolitos primarios, se encuentran casi en
cualquier vegetal superior, hay más de 8000 compuestos conocidos de
plantas vasculares mientras que en los vegetales inferiores: algas, hongos y
bacterias, los compuestos fenólicos principales son quinonas y xantonas.
En las plantas superiores, los flavonoides son muy importantes ya que
cumplen funciones como antioxidantes, y secuestradores de radicales libres,
agentes antimicrobiales y antinutricionales, fotorreceptores y protectores
contra luz UV, agentes quelantes de metales, atractores visuales para los
insectos, entre otros (Marcano y Hasegawa, 2002).
Estos compuestos poseen bajo peso molecular y comparten un esqueleto
común C15(C6-C3-C6), que recibe el nombre de núcleo de flavano, el cual está
compuesto por dos anillos de fenilos (A y B) ligados a través de un anillo C
de pirano (heterociclo). Los átomos de carbono de los anillos C y A se
numeran del 2 al 8, y los del anillo B desde el 2' al 6' (Fig. 5).

Gráfico 5. Núcleo de flavano

(Tomado de Martínez y otros, 2002)
 La actividad de los flavonoides como antioxidantes depende de las
propiedades redox de sus grupos hidroxifenólicos y de la relación estructural
entre las diferentes partes de la estructura química. Esta estructura básica
permite una multitud de patrones de sustitución y variaciones en el anillo C
(Martínez, González, Culebras y Tuñón, 2002).
Según Martínez y otros, (2002) los flavonoides se pueden clasificar, de
acuerdo con sus características estructurales, en:
1. Flavanos, como la catequina, con un grupo -OH en posición 3 del
anillo C.
2. Flavonoles, representados por la quercitina, que posee un grupo
carbonilo en posición 4 y un grupo -OH en posición 3 del anillo C.
3. Flavonas, como la diosmetina, que poseen un grupo carbonilo en
posición 4 del anillo C y carecen del grupo hidroxilo en posición C3.
4. Antocianinas, que tienen unido el grupo -OH en posición 3 pero
además poseen un doble enlace entre los carbonos 3 y 4 del anillo C.
(Fig. 6).
 Flavonas Flavonoles Flavanonas Flavanonoles
(dihidroflavonoles

Antocianidinas Catequinas
Leucoantocianidinas (flavanoles)
(flavandioles)

Chalconas Auronas Isoflavonas

Gráfico No. 6.-. Estructura de los flavonoides

Tomado de Marcano y Hasegawa (2002)

5.1. Biosíntesis de los flavonoides.

La vía del ácido shikímico participa en la biosíntesis de la mayoría de los
fenoles de las plantas superiores. Utiliza como sustratos la eritrosa-4-fosfato
(de la vía de las pentosas-fosfato) y el ácido pirúvico (proveniente de la
glucólisis). Uno de los productos de esta vía es la fenilalanina, de la que se
deriva la mayoría de los fenoles. La fenilalanina, un aminoácido esencial que
parte del metabolismo primario de las plantas y animales, entra al
metabolismo secundario cuando la enzima fenilalanina amonio-liasa (PAL)
cataliza la eliminación de un amonio convirtiendo a la fenilalanina en ácido
 cinámico, precursor de los compuestos aromáticos, los cuales dan origen a
los polifenoles, como se muestra resumidamente en la (García y Woolrich,
2009).

Ácido Shikímico Ácido cinámico Polifenol

Ácido Ácido
Aromáticos
pirúvico prefénico

Gráfico No. 7.- Resumen de la biosíntesis de los flavonoides

5.2. Flavanoles
Los flavanoles forman de los flavonoides condensados conocidos como
taninos. A este grupo pertenecen las proantocianidinas, las cuales son
responsables de reacciones como la precipitación de polisacáridos,
alcaloides, proteínas, y como consecuencia de esto, las enzimas de la
saliva, por lo que le atribuyen las características astringentes de estas
sustancias (Marcano y Hasegawa, 2002). Entre las plantas con alto
contenido de flavanoles se encuentran el cacao (Theobroma cacao), la uva
(Vitis vinifera), el té (Camelia sinensis), la manzana (Malus domestica) y
diversas bayas; siendo su contenido diferente para cada especie vegetal
(Martínez y otros, 2002)
Las unidades monoméricas de los flavonoides condensados son los
flavan–3-oles o catequinas, entre las que se encuentran en el té verde, la
epigalocatequina-3-O-galato, epicatequina-3-O-galato, epicatequina y la
epigalocatequina, las cuales se comportan como taninos hidrolizables, es
decir, al ser tratados con ácidos o por enzimas se separan en ácido gálico y
elágico o sus derivados, y azúcares (Marcano y Hasegawa, 2002).

Gráfico No. 8.- Catequinas del té verde (Camellia sinensis)

(Tomado de Lamarao y Fialho, 2009)
 6. Té verde.

Clasificación taxonómica.
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Ericales
Familia: Theaceae
Género: Camellia
Especie: C. sinensis
El té es un producto manufacturado con hojas y talluelos de ciertas
variedades de Camellia sinensis, además de otras especies del mismo
género, que son mezcladas de forma diferente para los distintos tipos de té.
El té posee un efecto estimulante, debido a la cafeína, sustancias volátiles de
le dan sabor y los efectos astringentes son consecuencias de sustancias
polifenólicas (Marcano y Hasegawa, 2002).
La planta del té verde se clasifica taxonómicamente como Camellia
sinensis (familia Theaceae) y crece espontáneamente en regiones tropicales
y cálidas de Asia. Existen más de 80 especies, siendo las variaciones
sinensis y assamica las de mayor valoración comercial y nutricional. El
noreste de la India y el este y sureste de China se considera la región
originaria de Camellia sinensis, donde se cultiva mayormente la variedad
sinensis (Imagen 1) (Katiyar, Afaq, Perez y Mukhtar, 2001).
Las hojas del té verde se pueden someter a diferentes grados de
fermentación para obtener té sin fermentar, semi-fermentado y fermentado,
que se conocen respectivamente como té verde, té oolong y té negro. En el
caso del té verde, las hojas no se fermentan ya que de esta manera se
mantiene su contenido natural en catequinas, vitaminas y antioxidantes
naturales (Figueroa y otros, 2004).
En el proceso de elaboración, las hojas frescas recolectadas son
expuestas al vapor durante 30-45 segundos o al aire caliente seco para
inactivar las enzimas contenidas, especialmente la polifenoloxidasa, que
podría degradar los polifenoles. El té verde contiene más del 10% de su peso
en seco de polifenoles y un 1-4% de cafeína. El contenido de agua de la hoja
fresca es aproximadamente del 80%, quedando reducido durante el proceso
al 10% (Katiyar y otros, 2001).

Gráfico No. 9.- Recolección del té verde

REFERENCIAS
http://detitambiendepende.blogspot.com/2010_12_12_archive.htm

7. Extracción sólido – líquido

De un material sólido se pueden separar selectivamente algunos de sus

componentes mediante la incorporación de disolventes volátiles e inertes.
Después de que han estado en contacto con el sólido y el disolvente se
separan. Al evaporar la solución queda el material extraído. El disolvente
evaporado se condensa para volverlo a utilizar. El extractor Soxhlet permite
efectuar extracciones continuas de sólido-líquido (Domínguez y Domínguez,
1990).
 7.1. Extracción continúa vía Soxhlet

De acuerdo con Domínguez y Domínguez (1990), el extractor Soxhlet o

simplemente Soxhlet es un tipo de material de vidrio utilizado para la
extracción de compuestos, generalmente de naturaleza lipídica, contenidos
en un sólido, a través de un solvente afín. Fue inventado en 1879 por Franz
von Soxhlet, y fue diseñado originalmente para extraer un lípido de una
muestra de un material sólido. Este equipo está diseñado para aplicaciones a
nivel micro durante el análisis y experimentación en procesos de extracción
de grasas. Integrado por un extractor, un condensador especial de tipo bulbo
y un matraz; el condensador está provisto de una chaqueta de 100mm de
longitud, con espigas para la entrada y salida del agua de enfriamiento.
El extractor tiene una capacidad, hasta la parte superior del sifón, de 10
mL; el diámetro interior del extractor es de 20 mm y longitud de 90 mm. El
matraz es de 500 mL de capacidad. Está conformado por un cilindro de
vidrio, vertical de aproximadamente un pie de alto y una pulgada y media de
diámetro. La columna está dividida en una cámara superior e inferior. La
superior o cámara demuestra sostiene un sólido o polvo del cual se extraerán
compuestos (Ávila, 2001).
La cámara de solvente, exactamente abajo, contiene una reserva de
solvente orgánico. Dos tubos vacíos, o brazos corren a lo largo, a un lado de
la columna para conectar las dos cámaras. El brazo de vapor, corre en línea
recta desde la parte superior de la cámara del solvente a la parte superior de
la cámara del sólido. El otro brazo, para el retorno de solvente, describe dos
U sobrepuestas, que llevan desde la cámara de la muestra el solvente hasta
la cámara de solvente.
El Soxhlet funciona cíclicamente, para extraer las concentraciones
necesarias de algún determinado compuesto. Éste funciona de la siguiente
forma: Cuando se evapora el solvente sube hasta el área donde es
condensado; aquí, al caer y regresar a la cámara de solvente, va separando
los compuestos, hasta que se llega a una concentración deseada (Ávila,
2001).

Gráfico 10. Extractor Soxhlet

(Tomadodehttps://www. Falimentosriobamba.blogspot.com%252F2014%252F06%252Ftema-
obtencion-de-grasa-objetivos.html%3B260%3B323)
 CAPÍTULO III

MARCO METODOLÓGICO

Tipo y diseño de Investigación

Esta investigación de Campo, la cual para la Universidad Pedagógica

Experimental Libertador (UPEL 2006), contempla que:

En la investigación de Campo, el análisis sistemático de

problemas en la realidad, con el propósito bien sea de
describirlos, interpretarlos, entender su naturaleza y factores
constituyentes. Los datos de interés son recogidos en forma
directa de la realidad y fuentes bibliográficas; en este sentido se
trata de investigaciones a partir de datos originales o primarios
(p.14)

Por otra parte, se tiene que el diseño de esta investigación es

Experimental, ya que Baptista (2006), plantea que se realiza una
investigación Experimental cuando el objetivo consiste en la modificación de
una variable (independiente) para observar cambios o efectos en otra
variable (dependiente).
Por lo anteriormente expuesto, esta investigación es de Campo y
Experimental debido a que se realizará un diagnóstico de demanda
comercial de té verde (Camellia sinensis) en 10 establecimientos comerciales
de la Parroquia La Candelaria, para luego obtener los flavonoides de la
marca comercial de té verde de mayor demanda, determinada por el estudio
anterior; y evaluar el comportamiento del hongo Fusarium cultivado in vitro
ante diferentes concentraciones de los flavonoides extraídos.
 Población y Muestra
Según Baptista (2006), “la población o universo se refiere al conjunto
para el cual serán válidas las conclusiones que se obtengan de los
elementos y unidades (personas, instituciones o cosas) a las cuales se
refiere la investigación. En el caso de esta investigación, la población está
conformada por 10 establecimientos comerciales de la Parroquia La
Candelaria del Municipio Libertador, en los cuales se realizará el diagnóstico
de preferencia de consumo.
Para efectuar la investigación y seleccionar la muestra, se utilizó el
método no probabilístico, mediante el muestreo dirigido intencional, la cual
consiste en seleccionar las unidades de la población, según el juicio de los
investigadores, dado que las unidades seleccionadas gozan de
representatividad. En el muestreo dirigido, la probabilidad de que una unidad
elemental sea elegida es desconocida (Baptista, 2006).

Instrumentos de Recolección de Datos

Los instrumentos de recolección de datos, son aquellos medios a través
del cual el investigador se relaciona con los participantes o en dónde asienta
la información observada del fenómeno de estudio, con el fin de obtener la
información necesaria que le permita lograr los objetivos de la investigación.
Para recolectar la información hay que tener presente: Seleccionar un
instrumento de medición el cual debe ser válido y confiable
para poder aceptar los resultados, aplicar dicho instrumento de medición y
organizar las mediciones obtenidas para poder analizarlos (Baptista, 2006).
Para iniciar dicha investigación se eligió como instrumento de recolección
de datos el cuestionario. Baptista, (2006), plantea que el cuestionario Es un
método, la cual se utiliza un instrumento o formulario impreso, destinado a
obtener repuestas sobre el problema en estudio y que el investido o
consultado llena por si mismo. El cuestionario puede aplicarse a grupos o
individuos estando presente el investigador o el responsable del recoger la
 información, o puede enviarse por correo a los destinatarios seleccionados
en la muestra.

Materiales y reactivos
Cuadro 1.
Materiales, instrumentos y equipos utilizados en el
presente proyecto de investigación.

Reactivos Instrumentos Equipos

- Éter de petróleo (60°C – 80°C) - Matraz fondo redondo de 500 - Manta de calentamiento
- Acetato de etilo mL PYREX - Extractor Soxhlet
- Cloruro de hierro (III) al 10% - Agitador de vidrio - Autoclave
- Cultivo PDAA (papa, dextrosa, agar - Matraces aforados - Refrigerante
acidificado) - Pipetas - Microscopio
- Acido láctico al 50% - Vasos de precipitado
- 200 mg de ciclohexamida. - Placas de Petri de 60 mm o
- 100 mg de estreptomicina sulfato 100 mm
- Azul de metileno -Láminas porta y cubre objetos
- Aceite de inmersión - Propipeta
- 300 mL de etanol al 95% - Pinzas
- 100 mL de acetato de plomo 0,1 M - Espátula
- Gotero

Diseño Experimental

Obtención del extracto de acetato de etilo a partir de té verde

(Camellia sinensis)
En un matraz fondo redondo de 500 mL se colocó de 250 a 300 mL de
éter de petróleo 60°C – 80°C. Se colocó 39,25 g de té verde en la cámara de
extracción de un Soxhlet. Luego se calentó lentamente hasta extracción
completa. El extracto etéreo se almacenó. Se colocó en un balón de 500 mL,
de 250 a 300 mL de acetato de etilo y se procesó el material vegetal de la
cámara del Soxhlet, calentando lentamente hasta extracción completa. El
material vegetal se desechó. Se tomó el extracto de acetato de etilo y se
almacenó.

Marcha analítica No. 1.- Obtención del extracto polar de una marca
comercial de té verde (Camellia sinensis) vía Soxhlet
(Tomado y modificado de Álvarez, 2011)
 Obtención de flavonoides de té verde (Camellia sinensis) a partir de
extracción en frío

El material vegetal seco, limpio y molido se extrajo en frío durante 72

horas con etanol al 95 %. Luego del tiempo de extracción se filtró y se
concentró en baño de María hasta aproximadamente 150 mL. A este
concentrado se le agregó 150 mL de acetato de plomo 0,1 M en caliente y se
dejó reposar durante 24 horas. Se separo el precipitado y la solución
amarillenta se filtró al vacío. Se destiló el filtrado y la fase acuosa resultante
se extrajo con acetato de etilo. Luego se evaporó a sequedad hasta la
aparición de un sólido amarillo, se midió la masa y se prepararon
disoluciones a 10, 100 y 1000 ppm con los flavonoides extraídos.
Marcha analítica 2. Obtención del extracto polar de una marca comercial de té verde
(Camellia sinensis) a través de extracción en frío
(Tomado y modificado de Albornoz, 1980)
Reconocimiento de flavonoides en el extracto de acetato de etilo a partir
de té verde (Camellia sinensis)

Sobre un vidrio de reloj colocar 0,5 mL de disolución del extracto polar de

té verde. Agregar sobre el extracto una gota de FeCl3 al 10%. Observar la
formación de un precipitado verde.

Marcha analítica No. 2.- Identificación de flavonoides en el extracto polar de

acetato de etilo de té verde (Camellia sinensis)
 Evaluación del comportamiento del hongo Fusarium ante diferentes
concentraciones de flavonoides extraídos de té verde

Preparación del Testigo

Preparar un testigo de Fusarium, agregando 100 mL de cultivo papa,
dextrosa, agar acidificado, (PDAA) y esterilizado en una cápsula de Petri
esterilizada. Esperar la solidificación del cultivo e inocular en el centro de la
placa de Petri con la muestra del hongo. Sellar con papel plástico envolvente.
Medir el crecimiento del micelio diariamente. Realizar el ensayo
microbiológico del hongo con una muestra de micelio vegetativo cultivado.
(Tomado y modificado de Cotes, 2012)

Comportamiento del hongo Fusarium ante diferentes concentraciones

de flavonoides extraídos de té verde
Preparar disoluciones de flavonoides en acetato de etilo a 10ppm y a
100ppm y 1000ppm de té verde. Diluir 100 µL de cada extracto en el medio
PDAA en las cápsulas de Petri destinadas para la evaluación del
comportamiento del hongo. Esperar la solidificación del cultivo e inocular con
una muestra de de Fusarium en el centro de cada una de las cápsulas de
Petri. Medir el crecimiento del micelio diariamente. Realizar el ensayo
microbiológico del hongo con una muestra de micelio vegetativo cultivado.
(Tomado y modificado de Gallardo, 2013)
 Inocular el F. oxisporum en el centro de la placa de Petri

Realizar el análisis microbiológico del hongo cultivado

Marcha analítica No. 3.- Preparación del testigo de R. solani

Marcha analítica No. 4.- Evaluación del efecto antifúngico del extracto polar
de té verde sobre R. solani
 Análisis microbiológico del hongo cultivado
Colocar una gota de azul de metileno en un portaobjetos limpio y estéril.
Extraer con un asa de Kolle estéril una muestra de micelio y colocarlo sobre
el colorante. Colocar el cubre objeto sobre la muestra de hongo. Observar en
el microscopio bajo el objetivo de 10-40 de aumento. Identificar las
estructuras características del cuerpo vegetativo del hongo. (Tomado y
modificado de Decheco A, 2011)

Colocar una gota de azul de metileno o rojo congo en un portaobjetos

estéril

Colocar una muestra del micelio del hongo cultivado

Colocar el cubreobjetos sobre la muestra

Observar en el microscopio bajo el objetivo 40X a 100X

Identificar las estructuras del cuerpo vegetativo

Marcha analítica No. 5.- Análisis microbiológico del hongo cultivado.

 CAPÍTULO IV

Resultados y Análisis

A continuación se muestran en tablas y gráficos los resultados obtenidos

durante las diferentes fases del proyecto, presentando en primer lugar los
resultados obtenidos en el estudio de campo para determinar la marca
comercial de té verde de mayor preferencia comercial en un sector de la
Parroquia La Candelaria, seguidamente los resultados de las extracciones
vía Soxhlet y en frío, luego los del ensayo biológico in vitro. Por último se
presentan los análisis de todos los resultados presentados.

3 Ballerina
10% Mc Cormick
Kakoo 10%
Detallado (Kg) 0%
50%
Liptón
30%

Marca de Té Verde de mayor venta en un sector

de la Parroquia Candelaria

Gráfico 11. Resultados obtenidos en la determinación de la marca comercial de té

verde más vendida en 10 establecimientos comerciales en un sector de la
parroquia Candelaria
 3 Ballerina Mc Cormick
8% 0%
Kakoo
0%
Té Caps
25%
Liptón
34%
Detallado
(Kg)
33%

Marce de Té verde de mayor consumo

en un sector de la parroquia Candelaria

Gráfico 12. Resultados obtenidos en la determinación de la marca comercial de té

verde más consumida por una muestra de 12 personas en un sector de la
parroquia Candelaria

12 CÁPSULAS
11
10 DETALLADO (Kg)
9
8
7 4
6 3
5
4
3
2
1
0

Gráfico 13. Razones por las cuales los consumidores prefieren esa marca de té
verde
 10
CÁPSULAS
DETALLADO (Kg)
5

Gráfico 14. Efectos por los cuales los consumidores prefieren el té verde.

Resultados obtenidos en la Extracción vía Soxhlet

Cuadro 2.
Resultados en la extracción vía Soxhlet de té verde con acetato de etilo

Marca Masa Porcentaje de

comercial Inicial extracción
(g) (%)

Detallado por
Kilogramos
39,25 0%

Gráfico 15. Extracción Soxhlet del material vegetal con éter de petróleo.
Gráfico 16. Extracción Soxhlet del material vegetal con acetato de etilo.

Resultados obtenidos en la cromatografía en capa fina (CCF) del

extracto polar de té verde.

Gráfico 17. Resultados de la CCP de los diferentes extractos obtenidos vía

Soxhlet.
 Resultados obtenidos en la cromatografía en la identificación de
flavonoides a través de la reacción con cloruro de hierro (III).

Cuadro 3.
Resultados de la identificación de flavonoides en el extracto de acetato
de etilo.

Reactivo
Coloración con
FeCl3
Extracto
de té verde

Etéreo No reactivo

Acetato de etilo Ligeramente verde

Metanol/acetato de
verde
etilo

Gráfico 18. Resultados obtenidos en la identificación con Hierro (III) de los

diferentes extractos de té verde obtenidos vía Soxhlet
 Resultados obtenidos de la extracción en frío

Gráfico 19. Proceso de extracción en frío de 40,12g de té verde

Gráfico 20. Flavonoides aislados de 40,12g de material vegetal

Cuadro 4.

Porcentaje de rendimiento de flavonoides aislados del material vegetal

Gráfico 21. Resultados de la identificación de flavonoides con hierro (III) en

el extracto de acetato de etilo obtenido por maceración.
 Resultados obtenidos del ensayo biológico in vitro

Cuadro 5.
Crecimiento promedio del radio del micelio vegetativo del cultivo
control de Fusarium

Crecimiento del radio (cm)

24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Horas 0,14 0,46 0,93 1,37 1,88 2,40 2,96 3,46 3,95 4,30

Cuadro 6.
Crecimiento promedio del micelio vegetativo de los cultivos de
Fusarium en PDAA con concentraciones de flavonoides extraídos del té
verde de mayor marca comercial en un sector de la Parroquia La
Candelaria.

Crecimiento del radio (cm)

Horas 24 48 72 96 120 144 168 192

Control 0,17 0,70 1,35 2,05 3,00 3,60 4,00 4,40

0 ppm 0,1 0,37 0,95 1,45 2,42 3,35 3,70 4,00

10 ppm 0,1 0,38 0,88 1,44 2,38 3,08 3,54 3,94

100 ppm 0,1 0,48 1,02 1,61 2,48 3,25 3,70 4,10

1000 ppm 0,1 0,40 1,01 1,57 2,35 3,22 3,45 3,75
Gráfico 22. Crecimiento micelial del testigo de Fusarium

5
4,5
4
3,5
3
cm

2,5
2
1,5
1
0,5
0
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
horas

Gráfico 23. Crecimiento micelial del testigo de Fusarium durante 240 horas

Gráfico 24. Crecimiento micelial del Fusarium en 10 ppm de flavonoides a

las 120 horas

Gráfico 25. Crecimiento micelial del Fusarium en 100 ppm de flavonoides a

las 120 horas
 Gráfico 26. Crecimiento micelial del Fusarium en 0ppm (disolvente y el
control (sin flavonoides) a las 120 horas

5
4,5 4,4
4 4 4
CONTROL 3,6 3,7
3,5
3,35
3 DISOLVENTE 3
2,5 2,42
2 2,05
1,5 1,45
1,35
1 0,95
0,7
0,5 0,37
0 0,17
0,1
0
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Gráfico 27. Crecimiento del radio del micelio de Fusarium a 0 ppm a las 216 horas

5
4,5 4,4
4 CONTROL
4
3,5 3,6
10ppm
3 3
2,5
2 2,05
1,5 1,44
1,35
1 0,88
0,7
0,5 0,17 0,38
0 0 0,1
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Gráfico 28. Crecimiento del radio del micelio de Fusarium a 10 ppm a las 216 horas
 5
4,5 4,4
4 4
3,5 CONTROL 3,6

3 3
100ppm
2,5
2 2,05

1,5 1,61
1,35
1 1,02
0,7
0,5 0,48
0,17
0,1
0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Gráfico 29. Crecimiento del radio del micelio de Fusarium a 100 ppm a las 216 horas

5
4,5 4,4
CONTROL
4 4
1000 ppm 3,75
3,5 3,6
3,45
3,22
3 3
2,5
2,35
2 2,05
1,5 1,57
1,35
1 1,01
0,7
0,5 0,4
0,17
0,1
0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Gráfico 30. Crecimiento del radio del micelio de Fusarium a 1000 ppm las 216 horas
 5
10ppm
4,5 100ppm

4 1000ppm
CONTROL
3,5 DISOLVENTE
3
cm

2,5

1,5

0,5

0
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 horas

Gráfico 31. Crecimiento del radio del micelio de Fusarium a diferentes concentraciones
de flavonoides a las 216 horas

100,00

90,00 10ppm
80,00 100ppm
1000ppm
70,00
DISOLVENTE
60,00

50,00

40,00

30,00

20,00

10,00

0,00
1 2 3 4 5 6 7 8

Gráfico 32. Porcentaje de crecimiento del radio del micelio de Fusarium a diferentes
concentraciones de flavonoides
Gráfico 33. Vista microscópica de las hifas y las estructuras reproductivas
(conidióforos y conidios) del hongo Fusarium cultivado como testigo

Análisis de los resultados obtenidos en el estudio de campo

En la encuesta que se realizó en los 10 locales comerciales ubicados
entre el pasaje Esmeralda y la esquina de Candilito de la parroquia
Candelaria, se observa de acuerdo con el gráfico No.11 que la presentación
detallada por kilogramos es la más vendida en los expendios que tienen esta
opción de venta al consumidor. Los comerciantes manifestaron que no
conocen el nombre de la marca, sino que el nombre del té verde depende de
la ciudad donde se cultiva y cosecha. Por otro lado se observa que la
segunda más vendida es la marca Liptón cuya presentación es una infusión
fría.
En cuanto a los consumidores, se observa en el gráfico No. 12 que el té
verde detallado por kilogramos es la más consumida entre los encuestados
debido a su economía (gráfico No. 13). Por otra parte se puede apreciar que
la segunda marca de mayor consumo son las cápsulas Té Caps de
laboratorios Oftalmi. Los consumidores prefieren esta marca debido a su
presentación, la cual es más cómoda al momento de ingerirlas (gráfico No.
14). En ambos casos, la mayoría de los consumidores conocen el efecto
antioxidante y nutricional del té verde.
Luego del análisis de los resultados obtenidos en el estudio de campo,
se decidió realizar la extracción y el ensayo biológico, con el té verde
detallado por kilogramos debido a que es la presentación comercial más
vendida y consumida por un sector de la población estudiada.

Análisis de resultados obtenidos en las extracciones

La primera etapa de la extracción se realizó con 300 mL de éter de
petróleo 60° - 80°, con el fin de extraer la mayor parte de los componentes
menos volátiles o apolares, como la clorofila a, presentes del material vegetal
de té verde (detallado por kilogramos), lo cual se observa en el gráfico 15. En
este sentido Marcano y Hasegawa (2002) señala que los polifenoles, pueden
extraerse en disolventes polares al menos que sean esterificados o
eterificados (pág 140). Una vez almacenado el extracto etéreo se procedió a
realizar la extración con 300 mL de acetato de etilo obteniendo al final el
extracto polar con este disolvente como se observa en el gráfico 16. En este
parte del procedimiento se realiza para extraer los flavonoides presentes en
el té verde, ya que, debido a su estructura química observada en el gráfico
34, son solubles en disolventes con polaridad creciente. (Marcano y
Hasegawa, 2002)

Gráfico 34.- Estructura de los polifenoles

Para comprobar la presencia de polifenoles en los extractos de té

verde (C. sinensis), se realizó una cromatografia en capa fina (CCF)
utilizando como fase estacionaria placas de sílica gel y como eluyentes
diclorometano (CH2Cl2), acetato de etilo y una mezcla de metanol/acetato de
etilo. Se observa en el gráfico 17, que tanto en el extracto etéreo como en de
acetato de etilo existen compuestos polares que se fijan en la parte baja de
la placa de sílica gel, estando más presentes en el extracto de acetato de
etilo. También se observan compuestos no volátiles en el extracto de acetato
de etilo fijados en la parte superior de la placa, lo que indica que el extracto
de acetato de etilo puede contener sustancias que pueden interferir en el
ensayo biológico.
De los resultados de la CCF se concluye que existen en ambos
extractos compuestos apolares, siendo interferencia específicamente en el
extracto de acetato de etilo. Este compuesto pueden ser las clorofilas a y b,
las cuales son verde azulada y verde amarillenta respectivamente, tal como
las manchas observadas en la parte superior de los cromatogramas del
gráfico 17. Estas clorofilas llamadas tambien clorofila alfa y beta presentan la
siguiente extructura:

Gráfico 35. Estructura de las clorofilas a y b

La diferencia entre ellas es que la clorofila b tiene un grupo formilo

(-CHO) en lugar de un grupo metilo (CH3-) de la clorofila a, en uno de los
carbonos del anillo de porfirina (Raven y otros, 1992), esto conlleva a que la
clorofila b sea un poco más polar que la clorofila a, por lo que se puede
deducir que fue extraída por el acetato de etilo juntamente con los
polifenoles.
 Por otra parte, se pueden observar en el gráfico 18 los resultados del
ensayo para identificar la presencia de flavonoides en los extractos etéreo y
de acetato de etilo con cloruro de hierro (III), el cual puede ocurrir según la
reacción:

Complejo entre Fe3+ y el polifenol

Gráfico 36. Posible reacción de formación del complejo entre el catión

férrico y los polifenoles del té verde (coloración verde)
De acuerdo con Figueroa y otros (2004), los polifenoles del té interactúan
fácilmente con los iones metálicos de transición y forman complejos
insolubles como sucede con el hierro. Este proceso incluye la formación de
complejos entre el grupo galoilo, principalmente, y el hierro, siendo la
coloración esperada verde azulado. La relación molar entre los flavonoides y
el hierro es directamente dependiente del pH; la relación varía entre 1:1 con
pH 2, 2:1 con pH 5.5, y 3:1 con pH 8.0.

Grupo
galoilo

Gráfico 37. Imagen del grupo galoilo presente en las catequinas del té verde
 Al observar los resultados del cuadro 3 y el gráfico 18, tanto en el extracto
etéreo como en el extracto de polar, se observan manchas de color verde –
verde azulado, mayormente marcado en la parte superior del cromatograma.
Las manchas en la parte superior puede decirse que pertenecen a las
clorofilas a y b ya que éstas presentas una coloración similar a la esperada.
Por otro lado en la placa que contiene como eluyente se observa una ligera
coloración verde en la parte intermedia, lo que puede indicar la presencia de
polifenoles. Los resultados obtenidos en la identificación se consideraron
indeterminados, por lo que se procedió a realizar una extracción del té verde
seleccionado, mediante un proceso de extracción en frío (maceración), en
donde la primera etapa de extracción se realiza con etanol.
La primera etapa de la extracción en frío consiste en la maceración
durante 72 horas con etanol, debido a circunstancias diversas durante la
ejecución de este proyecto, la maceración en etanol de 40,12g de material
vegetal se produce por alrededor de 21 días. Al agregar el acetato de plomo
0,1M al filtrado del proceso se formó un precipitado (gráfico 19). En este
sentido Marcano y Hasegawa (2002) señalan que esta sal permite separar
los compuestos monohidroxilados de los di y polihidroxilados, y debido a que
la disolución resultante conforme al gráfico 19 es de color amarillenta (vaso
de precipitado de la izquierda), se puede deducir también, que precipitaron
las clorofilas alfa y beta ya que se observa que el color verde permanece en
el precipitado.
Luego de filtrar al vacío y destilar, se extrajo la solución resultante con
acetato de etilo, permitiendo el aislamiento de los flavonoides de la solución
como se observa en el gráfico 19 en el embudo de decantación. Al finalizar el
proceso de evaporación a sequedad se obtuvieron 0,0243 g de flavonoides
de color amarillo (gráfico 20). Se obtuvo un rendimiento de 0,0605% de este
proceso. La causa de este bajo porcentaje de rendimiento puede ser el
tiempo prolongado de extracción así como pérdidas debido al proceso de
filtrado al vacío.
 Por otra parte, en el ensayo cualitativo de identificación de flavonoides
con hierro (III) dio un resultado positivo para esta extracción (gráfico 21).
Para finalizar con este proceso, se prepararon las disoluciones midiendo
0,02g de flavonoides a 10ppm, 100ppm y 1000ppm.

Análisis de resultados obtenidos en el ensayo biológico

En los resultados obtenidos durante el estudio del testigo se observó que
el micelio logró abarcar la capsula de Petri en su totalidad a los 10 días. En
este sentido Bautista y otros (2001) señalan que el Fusarium se caracteriza
por producir colonias de rápido crecimiento, con una tasa diaria cercana a 1
centímetro en medio papa- dextrosa-agar (PDA) a 25ºC. Cabe destacar que
el medio de cultivo que se utilizó para este trabajo experimental fu PDAA
(papa – dextrosa – agar acidificado) ya que en este tipo de cultivo los hongos
saprofitos crecen muy bien y esporulan en este medio (Castellanos y otros
2002), lo que concuerda con los resultados observados en el cuadro 5 y los
gráficos 22 y 23.
En cuanto al análisis microbiológico del testigo, se observó la aparición
de abundantes hifas, así como las estructuras reproductivas (conidióforos) y
abundantes conidios (gráfico 29) correspondientes en forma y tamaño a lo
esperado para este hongo según lo señalado por Bautista y otros (2001).
Por otra parte durante el estudio del comportamiento del Fusarium
cultivado in vitro en diferentes concentraciones de flavonoides, se observa en
el cuadro 6 y en los gráficos 27, 28, 29, y 30, que todas las concentraciones
de flavonoides tuvieron un efecto inhibitorio del crecimiento del micelio
vegetativo. También se observa que el porcentaje de crecimiento del micelio
(gráfico 32) va disminuyendo en todas las concentraciones a medida que
transcurren las horas en el medio de cultivo y que al comienzo del
crecimiento del micelio, el disolvente (acetato de etilo) y 10 ppm tienen un
efecto inhibitorio en las primeras 96 horas mayor que el el resto de las
concentraciones.
 En este sentido Arias y otros (2012) señalan que las especies de
Fusarium causantes de marchitez de las plantas siguen un patrón de
infección el cual consiste en penetrar por la raíz y colonizar el tallo de las
plantas en el sistema vascular, y en algunos se observa una restricción en la
región de entrada inicial del patógeno, debido a geles protectores de las
plantas que sellan los vasos impidiendo el avance del hongo, sin embargo
este patógeno puede degradar estos geles a través de enzimas pectolíticas
que produce, inhibiendo el crecimiento de células protectoras que se
adhieren a estos geles, lo que produce la conquista completa del hongo en la
planta.
Por otra parte se en algunos cultivares que pueden resistir al Fusarium,
los flavonoides como las catequinas y sus productos de oxidación inactivan
estas enzimas pectolíticas impidiendo el avance de la infección (Arias y otros
2012). De lo anterior se puede decir que el efecto inhibitorio observado en los
gráficos 27, 28, 29, 30, 31 y 32 es debido a los flavonoides presentes en el
cultivo PDAA que se extrajeron del té verde de mayor demanda comercial en
un sector de la parroquia candelaria, ya que los flavonoides de esta planta
son catequinas (gráfico 8).
Como también se puede observar en los gráficos 27, 28, 29, 30, 31 y 32
existe una disminución del efecto inhibitorio en el crecimiento del micelio del
Fusarium transcurridas 216 horas para las concentraciones 0, 10, 100 y 1000
ppm, siendo la de 1000 ppm ligeramente mayor entre las 192 y 216 horas, lo
cual puede ser debido al bajo volumen que se utilizó en el medio de cultivo
(100 μL) ya que en la mayoría de los casos en los que se han realizado
ensayos de este tipo se diluyen en el medio de cultivo, volúmenes de
extractos que oscilan de 1 a 5 mL, pero debido a al poco rendimiento en la
extracción y aislamiento de flavonoides sólo se pudo preparar un volumen de
2 mL de cada concentración.
Cabe destacar que Arias y otros (2012) señalan que Los patógenos
fúngicos de plantas tienen estrategias para reconocer al hospedante
adecuado, penetrar e invadir el tejido vegetal, superar las defensas de la
planta y optimizar su crecimiento dentro de la misma. Para realizar estos
procesos, generalmente, el hongo tiene que percibir las señales químicas y
físicas del hospedante y responder con los cambios metabólicos y
morfogenéticos requeridos para el desarrollo patogénico.
De a cuerdo con lo anterior, se puede decir que el efecto inhibitorio del
acetato de etilo está relacionado con las primeras etapas de la infección en la
cual en hongo a través del reconocimiento químico y físico, percibe el acetato
de etilo como una molécula que puede degradar, y para que ocurra este
proceso es necesario que el hongo realice la síntesis de productos génicos
específicos para formar las enzimas necesarias para degradar las moléculas
presentes en el hospedante, lo que conlleva a un retraso en el crecimiento
micelial (Arias y otros, 2012)
Cabe destacar que el crecimiento del micelio vegetativo (crecimiento de
hifas) es un proceso macroscópico en la evolución del hongo in vitro, por lo
que se puede decir que los flavonoides extraídos del té verde objeto de
estudio en este proyecto, también pueden afectar el proceso de adhesión de
las hifas a la superficie vegetal, la diferenciación de las estructuras de
infección especializadas, el desarrollo de las estructuras reproductivas y/o la
secreción de enzimas líticas y fitotoxinas del hongo según lo que expresan
los autores anteriormente citados, sin embargo el estudio de estos efectos
están fuera del alcance de este proyecto de investigación.
 CAPÍTULO V

CONCLUSIONES, RECOMENDACIONES Y LIMITACIONES

Conclusiones

Se determinó que el té verde detallado por kilogramos, es el producto de

mayor demanda entre los consumidores y comerciantes de un sector de la
Parroquia La Candelaria.
No se observó claramente la presencia de polifenoles en el extracto de
acetato de del té verde que se obtuvo mediante extracción Soxhlet en los
resultados de CCF e identificación con Hierro (III).
En el proceso de extracción vía Soxhlet no se separaron correctamente
los compuestos con menor polaridad como la clorofila a y b.
Se lograron extraer flavonoides del material vegetal correspondiente a la
muestra de té verde detallado por kilo con un porcentaje de extracción de
0,0605%, lo que refleja una extracción poco exitosa en términos de
rendimiento de la extracción en frío.
Se observó un crecimiento del Fusarium conforme a lo esperado
(conidios y micelio en 7 días, cápsula completa de micelio en 8 días).
La concentración de 1000 ppm de flavonoides logró mantener un ligero

efecto inhibidor del crecimiento del micelio después de 96 horas .

El disolvente presentó un efecto inhibidor del crecimiento del micelio las
primeras 48 horas luego de las cuales se observó la disminución del efecto.
 El efecto inhibidor disminuye a medida que va madurando el hongo
(primeros 5 días).

Recomendaciones y limitaciones

Aumentar el volumen de solución de extracto en el medio de cultivo.

Realizar un análisis microbiológico del los medios de cultivos objetos del
estudio para determinar el crecimiento de las estructuras reproductivas y el
número de conidios por unidad de área.
Evaluar la competencia entre dos hongos diferentes en diferentes
concentraciones de soluciones de flavonoides.
Una limitación es el control de la esterilidad del entorno tanto de
preparación del extracto como en el sitio de realización del ensayo biológico.
 REFERENCIAS

Achicanoy, H. (2001). Estrategias integradas para el control de

enfermedades de las plantas. Fac. Agr. Medellin. Vol. 54 (1) 1251 – 1273

Adams, P. (1990).The potential of mycoparasites for biological control of

plant diseases. Phytopathol. Vol. 22 (4) 59-79.

Álvarez, M. (2011). Taninos y Flavonoides. Universidad Central del Ecuador

[Documento en línea]. Disponible: http://q-
organicauce.wikispaces.com/file/view/TRABAJO+TANINOS+Y+FLAVON
OIDES_Michelle+Alvarez.pdf [Consulta: 2012, Junio 2]

Arias, Y., González, I., Peteira B. (2012). Aspectos Generales de la

interacción Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici – tomate. Rev.
Protección Vegetal. Vol. 27 (1) 1-7

Ávila, Z. (2001). Química Orgánica, Experimentos con un enfoque ecológico.

UNAM: México.

Barrios, L; Hernández, C; Morales, H; Moreno, L; Ramírez, C. (2001)

Evaluación del efecto insecticida de extractos de plantas sobre
Leptophobia aripa elodia. Manejo Integrado de Plagas. Vol. 60 (9) 50 –
56

Bautista, G., Garcés, E., Orozco, M., Valencia H. (2001) Fusarium

oxysporum. El hongo que nos falta conocer. Acta Biológica Colombiana.
Vol 6 (1) 7-24

Becerra, G., Sosa, M., López, A. (2010). Hongos fitopatógenos de alta

importancia económica: descripción y métodos de control. Temas
Selectos de Ingeniería de Alimentos. Vol. 4 (2) 14-23.
Bolívar, K; Camacaro, M; Cumaná, L; Crescente, O; Sanabria, M; Rodríguez,
D. (2009). Potencial efecto fungicida de extractos vegetales en el
desarrollo in vitro del hongo Colletotrichum gloeosporioides y de la
antracnosis en frutos de mango. UDO Agrícola. Vol. 9 (1), 175 -181.

Cadenas, M. (2010) Fitopatología general. Universidad Nacional Agraria La

Molina. . [Documento en línea]. Disponible:
http://tarwi.lamolina.edu.pe/~fonz/fitogen/PDF/APUNTES%20DE%20CLA
SES1.pdf [Consulta: 2014, Junio 2]

Castellanos, G., Jara, C., Mosquera, G. (2002) Guía Práctica No. 4. Manejo
del hongo en el laboratorio (Fusarium oxysporum). CIAT. México

Decheco, A. (2011). Análisis Microbiológico de los Hongos. UNFV/FIIS

[Documento en línea] Disponible:
http://es.scribd.com/doc/39929921/PRACTICA-6-ANALISIS-
MICROBIOLOGICO-DE-LOS-HONGOS [Consulta: 2014, Junio 26]

Domínguez X.; Domínguez S. (1990) Química Orgánica Experimental.

Limusa-Noriega: México

Domingo, D; López, M. (2003) Plantas con acción antimicrobiana.

Quimioterap. Vol. 16 (4), 385 – 393

Universidad Experimental Pedagógica Libertador. (2006). Manual de

Trabajos de Grado, Especialización y Maestría, y Tesis Doctorales. 3ed.
Caracas: FEDEUPEL.

Figueroa, T., Rodríguez E., Sánchez F. (2004). El té verde ¿una buena

elección para la prevención de enfermedades cardiovasculares?
Archivos Latinoamericanos de Nutrición. Vol. 54 (4), 98 – 102.

Baptista, P; Fernández, C; Sampieri, R. (2006) Metodología de la

investigación. 4ed. Mc Graw-Hill: Mexico
Gallardo, C. (2013) Determinación del efecto inhibidor de tres variedades de
té sobre flora fúngica presente en una sala de maduración de quesos.
Trabajo de grado no publicado. Universidad Austral de Chile. Valdivia

García, D; Woolrich, N. (2009). Identificación química de compuestos

fenólicos por cromatografía de HCPL, con detector UV de extractos
etanólicos de propóleos recolectados en la zona Córdoba-Orizaba.
Trabajo de grado no publicado. [Documento en línea] Universidad
Veracruzana.Disponible:http://cdigital.uv.mx/bitstream/123456789/31069/
1/CastilloGarciayWoolrichGarcia.pdf. [Consulta: 2014, Junio 2]

Gómez, V. (2008). Extracción y caracterización de flavonoides en el extracto

ETOH y ciertas fracciones del Parinari sprucei. Trabajo de grado no
publicado. Universidad Central de Venezuela. Caracas.

González, M., Betancourt M., Ortiz R. (2000). Daño oxidativo y antioxidantes

Bioquímica. Vol. 25 (1), 3 – 9.

Karp, G., (1994). Biología Celular. (2da. Ed.) McGraw – Hill. México.

Katiyar, S., Afaq, F., Perez, A., Mukhtar, H. (2001). Green tea polyphenol (-)-
epigallocatechin-3-gallate treatment of human skininhibits ultraviolet
radiation-induced oxidative stress. Immunol Journal. 22 (2), 287-94.

Lamarao, R., Fialho E. (2009). Aspectos funcionais das catequinas do chá

verde no metabolismo celular e sua relação com a redução da gordura
corporal. Revista de Nutrición. Vol. 22 (2), 257 – 269.

Marcano, D., Hasegawa, M. (2002). Fitoquímica orgánica. (2da. Ed.) Torino.

Venezuela.

Martínez, S., Gonzalez, J., Culebras, J., Tuñón, M. (2002). Flavonoides:

propiedades y acciones antioxidanrtes. Nutrición Hospitalaria. Vol. 1 (6),
271 – 278.

Venereo, J., (2002). Daño oxidativo, radicales libres y antioxidantes. Revista

Cubana de Medicina Militar. Vol. 3 (2), 126 – 133